Eletroforese SDSPAGE: Técnicas de Purificação e Caracterização de Proteínas

Separação de proteínas por eletroforese SDSPAGE QBQ0316 Bioquímica Experimental 2020 O que será feito na parte experimental extração purificação quantificação e caracterização da alfaglicosidase maltase de levedura Cultura de leveduras S cerevisiae Dosar proteína e atividade enzimática no lisado total Purificar sequencialmente a proteína de interesse Precipitação com Sulfato de amônio Cromatografia troca iônica Aula 3 Aula 2 Lise celular Caracterizar a atividade enzimática na fração purificada pH ótimo inibição Aula 4 5 6 Avaliar o enriquecimento e recuperação da atividade enzimática ao longo da as etapas de purificação Avaliar as proteínas presentes na fração purificada por eletroforese em gel SDSPAGE FUNDAMENTOS DA ELETROFORESE v q E f q carga líquida E Força do campo elétrico Voltscm f coeficiente friccional 6ph resistência encontrada pelo íon dependente da viscosidade do meioh e do tamanho e forma do íon r Eletroforese está baseada na migração de uma partícula carregada sob influência de um campo elétrico biomoléculas possuem cargas que dependem do pH Augusto15 Velocidade de migração Mobilidade eletroforética µ v E µ q f µ q E f E SUPORTES PARA ELETROFORESE Papel Gel deAgarose Gel de Poliacrilamida Manutenção do pH Augusto15 ELETROFORESE E CROMATOGRAFIA SÃO BASEADAS EM DIFERENTES PRINCÍPIOS Augusto15 Mobilidade depende da carga e forma da molécula Mobilidade depende da interação relativa da molécula com a fase estacionária e a fase móvel Eletroforese Cromatografia SUPORTES PARA ELETROFORESE httpwwwbiologyreferencecomDn EpElectrophoresishtml httpcommonswikimediaorgwikiFileDNAAgarosegelelectrophoresi sjpg Augusto15 A agarose é uma mistura de polissacarídeos isolados de algas Gel de Agarose Geis de agarose são muito utilizados para separações de moléculas particularmente grandes como ácidos nucleicos DNA RNA SUPORTES PARA ELETROFORESE Gel de Poliacrilamida httpuploadwikimediaorgwikipediacommons5 5aCoomassie3jpg httpuploadwikimediaorgwikipediacommonsff1Electrophoresis Filling1Dgelwellswithproteinsmixturejpg O gel de poliacrilamida PAGE é preparado pela polimerização de acrilamida e bis Augusto15 acrilamida Muito utilizado para análise de proteínas SDSPAGE Rath A et al PNAS 200910617601765 O SDS confere carga negativa à todas as proteínas Augusto 15 SDSPAGE Sodium Dodecyl SulfatePolyAcrylamide Gel Electrophoresis Augusto 15 Figura Livro Stryer httpswwwyoutubecomwatchvtoPpdoBYPWo µ q f Separa proteínas por TAMANHO Já que o SDS confere carga negativa homogênea a todas as proteínas ETAPAS EM UM SDSPAGE 1 Preparo do gel 2 Preparo das amostras 3 Montagem do aparato de eletroforese 4 Aplicação das amostras 5 Separação das amostras no gel de eletroforese 6 Revelação do gel de eletroforese httpswwwyoutubecomwatchv8xftsCIwYo Catalisador TEMED ou Riboflavinaluz R M RM M RMM M RM RMM RMMM etc malha de acrilamida e bis acrilamida serve como uma peneira para separação das proteínas Augusto15 PREPARAÇÃO DO GEL Soluções Volume Água 402 mL SDS 10 100 µL AcrilamidaBisAcrilamida 30 333 mL Tampão Tris 15 M pH 88 25 mL TEMED 5 µL Persulfato de amônio 50 µL Soluções Volume Água 305 mL SDS 10 50 µL AcrilamidaBisAcrilamida 30 065 mL Tampão Tris 05 M pH 68 125 mL TEMED 5 µL Persulfato de amônio 25 µL httpwwwyoutubecomwatchvEDin0NiF4 GEL DE EMPILHAMENTO GEL DE SEPARAÇÃO 4 Acrilamida Tampão pH 68 720 Acrilamida Tampão pH 88 Augusto 15 SDSPAGE As proteínas se concentram em uma banda fina no gel de empilhamento aumentando a resolução No gel de Empilhamento Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Gly pI61 parcialmente dissociado em pH 68 carga zero carga1 Direção da eletrofore No gel de Separação Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl Gly pI61 Praticamente dissociado pH 88 carga1 Direção da eletrofore Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Cl Cl Cl Cl Cl Cl Cl pH68 4acrilamida 720 acrilamida Tampão TrisGlicine pH88 Augusto 15 httpbitesizebiocom3285sdspagetheeasywaytofindthewells Encaixar o gel no sistema de eletroforese Colocar o tampão de corrida na parte superior e inferior do gel Augusto 15 SDSPAGE Água Tampão Tris 05 M pH 68 Glicerol aumenta a densidade da amostra SDS 10 desnatura proteínas Azul de bromofenol corante marca a frente de corrida do gel bmercaptoetanol reduzir pontes dissulfeto 355 mL 125 mL 250 mL 200 mL 020 mL 005 mL Amostra dialisada e seca Augusto15 20 µL Tampão de amostra Ferver 5 min SDSPAGE 2 Preparo das amostras TAMPÃO DE AMOSTRA Laemmli buffer Aquecimento e SDS desnaturam a proteína Betamercaptoetanol reduz as pontes de dissulfeto bmercaptoetanol Augusto15 SDSPAGE Aplicar as amostras com cuidado 1 2 3 4 1 Padrão de peso molecular 2 Lisado centrifugado 3 Material DEAE SDSPAGE Augusto15 Ligar a fonte e aguardar a migração da proteína até o final httpbitesizebiocom3285sdspagetheeasywaytofindthewells Augusto 15 v q E f µ q f SDSPAGE SDSPAGE Augusto15 Usos de SDSPAGE Acompanhar a expressão eou purificação de proteínas Determinar massas moleculares de proteínas Antes de corar Revelação do gel de eletroforese Outros métodos de detecção prata anticorpos immublotting Após corar com azul de Coomassie e descorar premover o corante não ligado Augusto15 DETERMINAR MASSA MOLECULAR RELATIVA Rm dD d migração da proteína de interesse D migração total ELETROFORESE EM GEL BIDIMENSIONAL Focalização isoelétrica pH 9 pH 3 Preparase um gel com gradiente de pH Aplicase a mistura de proteínas Cada proteína é focalizada em uma faixa estreita de pH próxima ao seu pI Otimiza a separação de proteínas Primeira dimensão separação de acordo com o pI Segunda dimensão separação de acordo com a massa molecular ELETROFORESE EM GEL BIDIMENSIONAL Mais de 2000 proteínas são visualizadas Augusto15 Eletroforese em gel bidimensional das proteínas de E coli Utilizada para comparar níveis de expressão de proteínas Proteínas podem ser identificadas por revelação com anticorpos Proteínas podem ser identificadas por espectrometria de massas PI PM PM SDSPAGE d D Rm dD M r M r massa m olecular ou peso molecular SDSPAGE Migração relativa Cromatografia de Exclusão Eluição relativa Precisão 10 Precisão 10 COMPARAÇÃO ENTRE MÉTODOS PARA DETERMINAR A MASSA MOLECULAR DE PROTEÍNAS Espectrometria de Massas Precisão 0001 Augusto15 Método bastante sensível Valores de massacarga bastante precisos