Caderno Pedagógico de Biologia Molecular e Biotecnologia

ENSINO A DISTÂNCIA BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA Copyright 2021 by Editora Faculdade Avantis Direitos de publicação reservados à Editora Faculdade Avantis e ao Centro Universitário Avantis UNIAVAN Av Marginal Leste 3600 Bloco 1 88339125 Balneário Camboriú SC editoraavantisedubr Depósito legal na Biblioteca Nacional conforme Lei nº 10994 de 14 de dezembro de 2010 Nenhuma parte pode ser reproduzida transmitida ou duplicada sem o consentimento da Editora por escrito O Código Penal brasileiro determina no art 184 dos crimes contra a propriedade intelectual Projeto gráfico e diagramação Ana Lúcia Dal Pizzol Editoração Bruna Jaime Feiden Ficha catalográfica elaborada na fonte pela Biblioteca do Centro Universitário Avantis UNIAVAN Maria Helena Mafioletti Sampaio CRB 14 276 CDD 21ª ed 5728 Biologia molecular Santos Carlos Frederico Tourinho dos S237b Biologia molecular e biotecnologia EAD Caderno pedagógico Carlos Frederico Tourinho dos Santos Balneário Camboriú Faculdade Avantis 2021 194 p il Inclui Índice ISBN 9786559010561 ISBNe 9786559010547 1 Biologia molecular 2 Biotecnologia 3 Projeto Genoma Humano e bioética 4 Material genético Manipulação 5 Testes Biologia molecular 6 Biologia molecular Ensino a Distância I Centro Universitário Avantis UNIAVAN II Título PLANO DE ESTUDOS OBJETIVOS DA DISCIPLINA Conhecer os mecanismos moleculares das principais tecnologias que envolvem a Biologia Molecular bem como as suas aplicações nas análises laboratoriais e nos processos biotecnológicos Compreender a importância dos exames de vínculo genético suas particularidades a tecnologia por trás destes exames bem como as regiões de análise O PAPEL DA DISCIPLINA PARA A FORMAÇÃO DO ESTUDANTE As atividades desenvolvidas nesta disciplina têm como foco capacitar o alunoa ao conhecimento da Biologia Molecular como uma importante ferramenta na área da saúde e da Biotecnologia Como futuro profissional o educando deverá desenvolver o senso crítico incentivado pela investigação laboratorial associando à importância para a caracterização do diagnóstico clínico laboratorial das patologias para o monitoramento do paciente para a criação de produtos biotecnológicos além de adquirir o devido entendimento sobre a Biologia Molecular com seus exames prospectivos Este estudo visa desenvolver a compreensão das bases científicas e tecnológicas nos exames de vínculo genético sejam eles nos testes de paternidade ou no DNA criminal PROFESSOR APRESENTAÇÃO DO AUTOR CARLOS FREDERICO TOURINHO DOS SANTOS Doutor em Bioquímica e Biologia Molecular tendo desenvolvido toda a parte prática da tese no Departamento de Genética da Escola de Medicina na Universidade de YALE CT USA No Mestrado a pesquisa prática foi realizada na Universidade de São Paulo Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto USP RP Tanto o Doutorado 2000 quanto o Mestrado 1993 foram defendidos pela Universidade Federal do Rio de Janeiro UFRJ Possui Graduação em Biomedicina pela Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro UNIRIO 1990 Consultor Técnicocientífico focado em laboratórios de Biologia Molecular com testes de paternidade DNA criminal doenças genéticas infecciosas e mapas gênicos atuando há mais de 20 anos nesta função Na atividade acadêmica possui experiência na Pesquisa em biologia molecular de HIV e HCV HIV comportamento e vulnerabilidade Na Extensão coordenou por 10 anos o programa de atendimento de grupo populacional no Retiro da Lagoa Lagoa da Conceição Florianópolis Larga vivência na Bioquímica principalmente na área metabólica em genética com testes moleculares e aconselhamento genético e nas áreas afins Lattes httplattescnpqbr6558932021654679 SUMÁRIO UNIDADE 1 BIOLOGIA MOLECULAR CONCEITOS BÁSICOS GENOMAS E EPIGENÉTICA 13 INTRODUÇÃO À UNIDADE 14 11 REPLICAÇÃO 14 13 TRANSCRIÇÃO 20 131 Promotores21 132 Acentuadores Enhancers ou Reforçadores 21 133 Silenciadores 22 134 Regulação PósTranscricional 23 135 Transcrição Reversa 25 14 TRADUÇÃO 25 15 GENOMA HUMANO ORGANIZAÇÃO DO DNA NUCLEAR E MITOCONDRIAL 27 151 DNA Nuclear 28 1511 Tipos de Sequências de DNA DNA não Repetitivo 29 1512 Tipos De Sequências de DNA DNA Repetitivo 29 152 DNA Mitocondrial 33 16 DNA PLASMIDIAL 35 17 BACTERIÓFAGO 36 18 CONTROLE DA EXPRESSÃO GÊNICA EPIGENÉTICA 37 181 Modificações da Cromatina 40 182 Modificações do DNA 41 183 Epigenética e Inativação do Cromossomo X da Mulher 44 184 Epigenética e Câncer 46 CONSIDERAÇÕES FINAIS 48 EXERCÍCIO FINAL 49 REFERÊNCIAS 52 UNIDADE 2 PROJETO GENOMA HUMANO BIOINFORMÁTICA E CARIÓTIPO TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE E PURIFICAÇÃO DE MATERIAL GENÉTICO 53 INTRODUÇÃO À UNIDADE 54 22 PROJETO GENOMA HUMANO 55 221 Projeto Genoma Humano e Bioética 57 23 BIOINFORMÁTICA 58 231 Bioinformática Alinhamento 60 232 Bioinformática Montagem de Genomas 61 24 CARIÓTIPO 63 241 Estrutura e Organização Cromossomal 64 242 Classificação Citogenética 66 243 Cariótipo Técnica 67 244 Técnicas de Bandeamento Cromossomal 69 25 TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE 73 251 Clonagem Molecular 74 252 Transformação Bacteriana 77 26 BIOFÁRMACOS 78 261 Hemoderivados 79 262 Terapia Celular 79 263 Terapia Genética 79 264 Anticorpos Monoclonais 80 265 Vacinas 80 266 DNA Recombinante 81 27 PURIFICAÇÃO DE MATERIAL GENÉTICO DE CÉLULAS VIVAS 82 271 Preparação de Extrato Celular 82 272 Purificação de DNA Total e RNA a partir de Extrato Celular84 2721 Para o RNA 86 2722 Concentração da Amostra de Ácidos Nucleicos 87 273 Preparação de DNA Plasmidial 87 2731 Separação com Base no Tamanho 88 2732 Separação com Base na Conformação 88 274 Preparação de DNA de Bacteriófagos 90 275 Medição da Concentração de DNA 90 CONSIDERAÇÕES FINAIS 92 EXERCÍCIO FINAL 93 REFERÊNCIAS 95 UNIDADE 3 MANIPULAÇÃO DE MATERIAL GENÉTICO PURIFICADO 97 INTRODUÇÃO À UNIDADE 98 31 ENZIMAS PARA MANIPULAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS 98 311 Nucleases 99 312 Ligases 100 313 Polimerases 101 314 Enzimas Modificadoras 102 32 ENZIMAS DE RESTRIÇÃO 102 321 Especificidade de Sequência 103 322 Condições de Digestão 105 33 ELETROFORESE 106 331 Preparo do Gel de Agarose 107 332 Preparo da Amostra 108 333 Dando Início à Eletroforese 110 334 Aferição de Tamanho de Ácido Nucleico 111 34 TRANSFERÊNCIA EM BLOTTING 112 341 Western Blot 113 342 Southern Blot 113 343 Northern Blot 114 35 VARIAÇÃO NO COMPRIMENTO DOS FRAGMENTOS DE RESTRIÇÃO RFLP 114 36 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE PCR 118 361 Histórico do Método de PCR 118 362 Metodologia 119 3621 Determinação dos Primers 120 3622 Temperaturas e Ciclos de PCR 122 363 Contaminação124 364 Tipos de PCR 125 355 Principais Aplicações do PCR 126 366 Limitações do Método de PCR 127 37 CRISPR 129 371 Histórico 130 372 Função Fisiológica Celular 131 373 Aplicações na Medicina 132 374 Aplicações na Indústria 134 CONSIDERAÇÕES FINAIS 136 EXERCÍCIO FINAL 137 REFERÊNCIAS 139 UNIDADE 4 TECNOLOGIAS E APLICAÇÕES DOS TESTES EM BIOLOGIA MOLECULAR 141 INTRODUÇÃO À UNIDADE 142 41 PCR EM TEMPO REAL QPCR 142 42 HISTÓRICO142 421 Metodologia 144 4211 Corantes Intercalantes 146 4212 Sondas de Sequência Específica 148 43 SEQUENCIAMENTO AUTOMÁTICO 152 431 Aplicações 155 4311 Diagnóstico de Doenças Genéticas 156 4312 Diagnóstico de Doenças Infecciosas 157 4313 Clonagem 158 44 DNA MICROARRAY E CHIP DE DNA 158 441 Metodologia do DNA Microarray 160 442 Aplicações do DNA Microarray 161 4421 Investigação de Alvos Terapêuticos 161 4422 Farmacologia 163 4423 Investigação de SNPs 163 4424 Investigação da Dinâmica de Patógenos 163 4425 Detecção de Microrganismos 164 45 CAPTURA HÍBRIDA 165 451 Metodologia 165 452 Vantagens da Captura Híbrida 167 453 Captura Híbrida e o HPV 168 46 GENÉTICA FORENSE 170 461 Histórico 170 4611 Uso do DNA na Identificação de Vínculo Genético 171 462 Polimorfismo 173 4621 Polimorfismo de Tamanho 173 4622 Polimorfismo de Sequência 175 463 Análises de Polimorfismos 176 4631 Análises de VNTR STR e INDEL 176 4632 Análises de SNP 180 464 Regiões de Análises e Respectivos Marcadores 180 465 Cromossomo Y 181 466 DNA Mitocondrial 182 467 Banco de Dados 183 468 Cálculo para o Teste de Paternidade 185 469 Amostras Biológicas 186 CONSIDERAÇÕES FINAIS 189 EXERCÍCIO FINAL 191 REFERÊNCIAS 193 1 UNIDADE BIOLOGIA MOLECULAR CONCEITOS BÁSICOS GENOMAS E EPIGENÉTICA 14 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA INTRODUÇÃO À UNIDADE Prezados alunos sejam muito bemvindos à nossa primeira unidade da disciplina de Biologia Molecular e Biotecnologia Nela enfatizaremos os processos básicos envolvendo a biologia molecular replicação transcrição e tradução Cabe lembrar que vamos complementar conceitos que já foram trabalhados nas disciplinas de Biologia Humana e de Genética Além disso trabalharemos a organização do genoma humano DNA nuclear e mitocondrial o que será fundamental ao entendimento de inúmeras patologias como também os testes de DNA de identificação de vínculo genético dentre eles o Teste de Paternidade Compreenderemos as organizações gênicas as quais são importantes ferramentas na tecnologia do DNA recombinante utilizadas em inúmeros processos biotecnológicos que são os plasmídeos e os bacteriófagos O fechamento desta unidade culminará com o entendimento de mecanismos relevantes no controle dos mais diversos processos celulares estando diretamente envolvidos com a fisiologia celular com características físicas psíquicas e até mesmo com o surgimento e desenvolvimento de processos patológicos Estes mecanismos estão inclusos na Epigenética os quais modulam nosso genoma sem alteração das nossas sequências nucleotídicas Vamos encarar a Biologia Molecular como um grande avanço que foi proporcionado nas mais diversas áreas incluindo aquela na qual estamos inclusos a Saúde 11 REPLICAÇÃO Antes de iniciarmos o evento de replicação é muito importante frisar que este antecede a divisão celular pois nossas células para se dividirem seja por mitose ou meiose precisam replicar o genoma É um evento que tem início na fase S do Ciclo Celular sendo finalizado no início da fase G2 deste ciclo BORGESOSÓRIO 2013 A replicação consiste na síntese de DNA a partir do molde de mesma natureza 15 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA Lembre que o DNA é dupla fita e estas precisarão se separar porque cada fita servirá de molde para confecção de uma nova fita A dupla fita está unida apenas por ligações hidrogênio que são facilmente separáveis as quais vão se romper com o auxílio das enzimas denominadas DNAhelicases e estas liberarão seus terminais para novas ligações com desoxirribonucleotídeos específicos O molde para a síntese de uma nova fita ocorre por complementaridade do pareamento de bases evento que acontece no núcleo da célula sempre obedecendo à regra de hibridizar uma purina com uma pirimidina A com T e viceversa C com G e viceversa A complementariedade de bases é baseada no princípio de que uma base não pareada atrai um nucleotídeo livre somente se ele lhe for complementar SUGESTÃO DE VÍDEO O processo de replicação transcrição e tradução são fundamentais para a manutenção de toda a vida celular bem como de todo organismo vivo Como já havíamos visto estes processos na disciplina de Biologia Humana Unidade 4 e na de Genética vamos relembrar o conteúdo com os vídeos que se seguem 1 Replicação httpswwwyoutubecomwatchv3jslVQDGkLUlistPLDM5pg2LGBtnJHnVzdO2iTqG2QH FbTtcindex2 2 Transcrição e Tradução httpswwwyoutubecomwatchvoxBPOxTFD4listPLDM5pg2LGBtnJHnVzdO2iTqG2QH FbTtcindex3 A enzima responsável pela leitura da fita molde e construção da fita nova é a enzima DNA Polimerase No entanto alguns requisitos precisam ser obedecidos antes que aconteça a polimerização que esta enzima promove A replicação inicia em vários pontos ao longo do nosso genoma sendo eles os 16 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA locais onde a dupla fita vai se separar para ter início o evento denominados Origem de Replicação ORI No genoma humano são observadas em torno de 10000 ORIs O local exato onde a replicação vai ser iniciada e onde uma fita reencontrará a outra chamase de forquilha de replicação Após esta forquilha a enzima primase construirá uma pequena molécula de RNA o primer ou iniciador em geral de 10 ribonucleotídeos o qual vai se hibridizar com o trecho complementar da fita molde de DNA formando um pequeno trecho de DNA com a extremidade 5 livre permitindo que a DNA Polimerase se ligue neste trecho e inicie a replicação BORGESOSÓRIO 2013 Na replicação o grupo fosfato de cada nucleotídeo será unido por ação da enzima DNA Ligase em uma ligação chamada de fosfodiéster ao grupo 3OH do último nucleotídeo incorporado na fita nova Os trifosfatos de desoxirribonucleotídeos possuem os fosfatos consecutivos conectados com o carbono 5 da desoxirribose estando diretamente ligado na pentose o fosfato α seguido do β e o último que é o γ Durante a replicação a dupla beta e gama é eliminada e o fosfato alfa é acoplado ao 3OH do nucleotídeo que já está na fita nova e foi o último adicionado Como já visto o processo inicia pela separação da dupla fita com auxílio da helicase As fitas são mantidas separadas pela imediata ligação de proteínas na molécula de DNA impedindoas de se reassociarem Estas proteínas são conhecidas como Single Strand Binding Proteins SSB e conferem estabilidade ao processo e ao DNA assumindo importante papel uma vez que durante a replicação a molécula de DNA vai girar centenas de vezes para a dupla hélice ser desenrolada pelas DNAhelicases A rotina de desenrolar a fita gera uma tensão na dupla fita de DNA e para desfazer ou amenizar esta tensão impedindo uma superesperilização existe a enzima DNA Topoisomerases Figura 1 Figura 1 Replicação Fonte Shutterstock 2020 17 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA Nos eucariotos o processo de replicação envolve uma maquinaria proteica e enzimática bem grande A começar pelo fato de termos várias DNA Polimerases sete muito bem caracterizadas nos mamíferos sendo 3 α δ ε extremamente importantes na replicação do nosso DNA nuclear e a DNA Polimerase γ está envolvida na replicação do DNA mitocondrial Todas as DNA Polimerases envolvidas na replicação constroem a nova fica no sentido 5 para o 3 isto porque a enzima desliza na fita molde no sentido contrário mantendo assim a nova dupla fita antiparalela Outro ponto importante trata sobre a fidelidade na reprodução da nova fita de DNA visto que construir a nova fita sem erros é fundamental para manter a viabilidade celular e a velocidade do fenômeno biológico é elevada cerca de 3000 nucleotídeos adicionados a cada minuto Então durante a replicação as DNA Polimerases com função de reparo participam da atividade exonucleásica capacidade de remover nucleotídeos identificando removendo e corrigindo adições incorretas que podem acontecer Uma das fitas sintetizadas fita líder ou leading é contínua e ocorrerá na mesma direção da abertura da forquilha de replicação apresentando apenas um primer Já na outra fita sintetizada atrasada tardia ou lagging como a replicação acontece na direção oposta da abertura da forquilha será observado um número grande de primers com uma construção descontínua apresentando fragmentos de 100 a 200 nucleotídeos os quais são conhecidos como Fragmentos de Okazaki Claro que ao final do processo todos serão retirados por uma exonuclease e substituídos por desoxirribonucleotídeos ação de uma das DNA Polimerases Desta forma qualquer espaço entre os Fragmentos de Okazaki serão também preenchidos com os desoxirribonucleotídeos correspondentes BORGESOSÓRIO 2013 O processo de replicação nos cromossomos eucarióticos é bidirecional como foi visto Desta forma a maior parte do DNA eucariótico é replicada mas as extremidades cromossomais apresentam um problema especificamente nas regiões teloméricas A formação da leading ocorrerá até a extremidade cromossomal mas a cadeia lagging vai requerer primers à sua frente Então quando o último primer for removido restará uma ponta de DNA sem estar replicada Essa situação caso não fosse resolvida resultaria em um cromossomo com uma dupla fita de DNA mais curta do que o cromossomo que deu origem a este novo e a cada geração a região telomérica tenderia a encurtar cada vez mais com possibilidade de serem perdidas regiões codificadoras extremamente importantes Figura 2 No entanto como as células possuem um sistema especializado para compensar a perda e neste sistema a principal enzima é a telomerase capaz de adicionar múltiplas cópias de uma curta sequência de desoxirribonucleotídeos nas extremidades 3 dos 18 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA cromossomos eucarióticos Figura 3 Assim o recupera as extremidades cromossomais garantindo que não ocorra uma lacuna que seria extremamente prejudicial às estruturas dos cromossomos dos eucariotos BORGESOSÓRIO 2013 Figura 2 Replicação e Telômero Telômero Uma região com sequências repetitivas de nucleotídeos ao final de cada cromossomo Fonte Shutterstock 2020 Figura 3 Telomerase Fonte Shutterstock 2020 19 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA Ao final teremos duas fitas molde parentais hibridizadas cada uma com uma fita nova por esta razão o processo é chamado de semiconservativo FIGURA 4 O fato de manter o sentido contrário das fitas ou seja uma orientada no sentido 5 para 3 e a outra do 3 para 5 devese à configuração espacial das bases nitrogenadas que apontam para dentro da dupla fita e precisam estar a uma distância correta para serem feitas as ligações hidrogênio que estabilizam a dupla hélice de DNA BORGESOSÓRIO 2013 Figura 4 Replicação Semiconservativa Fonte Shutterstock 2020 Para finalizar veremos alguns conceitos que servirão de base ao entendimento da utilização de biologia molecular como ferramenta científica e comercial A dupla fita helicoidal de DNA é mantida unida através de ligação hidrogênio lembrando que a adenina vai se parear com a timina e serão estabilizadas por duas ligações hidrogênio enquanto o par guanina e citosina necessitará de três ligações hidrogênio Referimonos ao tamanho da molécula de dupla hélice de DNA com menção ao número de pares de base complementares pb Quando temos milhares de pares de base usamos quilobase Kb e quando forem milhões utilizase megabase Mb Por exemplo o cromossomo X humano tem cerca de 155 Mb 20 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA Figura 5 Pareamento de Bases Fonte Shutterstock 2020 13 TRANSCRIÇÃO Como já sabemos a transcrição é a transferência da informação contida no DNA para a confecção da molécula de RNA e nos eucariotos para realizar este evento biológico existem ao menos três tipos da enzima RNA Polimerase a RNApolimerase I responsável por transcrever os genes dos RNAs ribossômicos b RNApolimerase II vai fazer a transcrição de genes que geram o RNA mensageiro e uma parte dos pequenos RNAs nucleares RNAsn e c RNApolimerase III transcrevendo os genes dos RNAs transportadores e alguns RNAs ribossômicos além de outros pequenos RNAs nucleares A transcrição do DNA para confecção de RNAm é um evento biológico que vai envolver sequências de DNA a presença de muitas proteínas a cromatina em sua estrutura maleável e a formação de outras estruturas como as alças e os dobramentos Uma das sequências envolvidas na regulação é a região promotora mas existem ainda os silenciadores e os acentuadores 21 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA 131 Promotores Promotores são as sequências de DNA reconhecidas pelos componentes envolvidos na transcrição e que possuem uma localização adjacente aos genes a serem regulados apresentam centenas de nucleotídeos possuindo a capacidade de especificar a direção da transcrição para o início do gene e ao longo da molécula do DNA As regiões promotoras mais conhecidas e caracterizadas são TATA Box ou Box de Hogness apresenta uma sequência consenso de 7 a 8 pb TATAAAA localizandose de 25 a 30 pb 5 acima ou anterior ao gene que será transcrito As mutações nestas regiões podem reduzir a transcrição gênica e as deleções acarretam a alteração do sítio de início da transcrição CAAT Box ou CCAAT Box apresenta esta sequência consenso sendo localizada entre 70 a 80 pb 5 acima ou anterior ao gene É uma sequência menos frequente que a anterior porém quando presente contribuirá quantitativamente para uma transcrição mais eficiente GC Box ou GGGCGGG é uma sequência consenso presente em regiões promotoras dos chamados genes de manutenção nas quais muitos não possuem as duas regiões citadas acima 132 Acentuadores Enhancers ou Reforçadores Os Acentuadores caracterizamse por sequências de DNA muito distantes dos genes estruturais sendo capazes de aumentar o nível de transcrição dos genes além de interagirem com os promotores Devido à distância destas regiões dos promotores há mecanismos de dobramento ou de inversão do DNA permitindo que aconteça uma ampla interação entre vários elementos reguladores com a formação de várias alças ou laços de aproximação de DNA Pode ocorrer também uma interação entre proteínas reguladoras nos acentuadores com posterior deslize delas ao longo do DNA até se ligarem em uma região promotora 22 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA Vale ressaltar que vários hormônios se unem aos seus respectivos receptores e o complexo se liga em cromossomos específicos nas regiões de acentuadores promovendo a transcrição de diversos genes correspondendo à ação hormonal característica destas entidades BORGESOSÓRIO 2013 133 Silenciadores Os Silenciadores compreendem curtas sequências de DNA as quais agem reprimindo a transcrição Em geral são específicas para cada tecido ou apresentam particularidades em cada cromossomo Um exemplo é o silenciador do gene da tireotropina β humana responsável pela codificação de uma subunidade da tireotropina Este gene só se expressa em células que são produtoras deste hormônio os chamados tireótrofos na glândula hipófise O silenciador se localiza a 140 pb distante do sítio de iniciação da transcrição Desta forma em todas as células não produtoras deste hormônio ele é ativo e impede a produção em todos os tipos celulares exceto nas células citadas acima BORGESOSÓRIO 2013 Assim sendo os componentes descritos acima agem na transcrição por serem locais de ligação dos chamados Fatores de Transcrição os quais consistem em proteínas que se ligam ao DNA podendo ter efeitos dos mais variados aumentando modulando ou mesmo inibindo o nível de expressão gênica Tais Fatores de Transcrição possuem seus genes ativados por sinais extracelulares e uma vez transcritos os fatores se ligam aos promotores e controlam a transcrição de DNA para RNA Agora que vimos os componentes envolvidos na modulação da transcrição daremos continuidade ao passo a passo do evento biológico O início da transcrição acontece quando a enzima RNA Polimerase II se liga na região promotora do gene Com esta ligação a dupla hélice de DNA se desenrola para que o molde a ser transcrito seja exposto Em seguida as primeiras sequências de 2 a 9 desoxirribonucleotídeos são liberadas porque se desfazem as ligações hidrogênio com a outra fita de DNA Após a RNA Polimerase II se libera do promotor e vai em direção ao gene que será transcrito Conforme vai deslizando na molécula de DNA a RNA Polimerase II desenrola a dupla hélice de DNA expondo mais trechos da fita molde e assim vai alongando o 23 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA RNAm nascente pareando os ribonucleotídeos com os desoxirribonucleotídeos da fita molde O pareamento obedecerá à regra de uma pirimidina com uma purina mais especificamente A no DNA com U no RNA T no DNA com A no RNA C no DNA com G no RNA e G no DNA com C no RNA Ao final do processo há um reconhecimento no ponto em que se determina que mais nenhum ribonucleotídeo será adicionado para formar o RNA e quando a última base for adicionada a RNA Polimerase II e o RNA nascente serão liberados originando o chamado transcrito primário A nova fita de RNA sintetizada é idêntica em sequência onde for timina no DNA vai ser uracila no RNA à fita codificadora fita sentido ou fita com sentido e complementar à outra fita do DNA que é denominada fita molde ou fita antissentido esta cujo molde foi transcrito 134 Regulação PósTranscricional Tão logo acaba a transcrição formase o que chamado Transcrito Primário ou pré RNAm e este RNA necessitará passar por modificações químicas e estruturais para que possa sair do núcleo em direção ao citoplasma como Transcrito Funcional Essas modificações químicas foram descritas na disciplina de Genética em sua Unidade 1 De acordo com Pimentel 2013 durante o processamento do préRNAm acontece a chamada regulação póstranscricional e esta inclui basicamente I excisão e remoção dos íntrons com encadeamento dos éxons II formação na extremidade 5 do cap e III na extremidade 3 a formação da cauda de poliadenilato Pode ocorrer em cada etapa do processamento uma regulação visando ao controle da quantidade de RNAm funcional que estará disponível para a síntese proteica Os mecanismos principais para a regulação póstranscricional são o encadeamento alternativo o controle da estabilidade do RNAm e o silenciamento mediado pelo RNA a Encadeamento Alternativo processo importantíssimo o qual consiste na produção de diferentes moléculas de RNAm a partir do mesmo préRNAm permitindo que se gerem inúmeros produtos proteicos com um único gene com funções similares ou até diferentes Essas modificações de encadeamento podem ocasionar a alteração na atividade enzimática bem como a capacidade de ligação com um receptor e mesmo 24 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA a localização de uma proteína na célula Assim estes eventos são fundamentais para auxiliar no controle do desenvolvimento pluricelular na apoptose conexão neuronal entre outros BORGESOSÓRIO 2013 b Controle da Estabilidade do RNAm a quantidade de um RNAm na célula está diretamente relacionada com a taxa de transcrição gênica e a taxa de degradação deste RNAm A meia vida de um RNAm pode variar consideravelmente sendo regulada em função da necessidade celular em que muitas vezes é mais comum ser determinada pelo controle da taxa de degradação do RNAm do que pela regulação da taxa transcricional BORGESOSÓRIO 2013 A degradação do RNAm vai acontecer por três vias todas sujeitas a apresentarem uma regulação Nos RNAm recémsintetizados a cauda de poliadenilato tem em torno de 200 nucleotídeos e está ligada a uma proteína de ligação à poliA cuja função é auxiliar na estabilidade do novo RNAm Quando acontece o encurtamento desta cauda para menos de 30 nucleotídeos a molécula do RNAm se torna instável sendo ele rapidamente degradado por exonucleases Através de enzimas que removem o cap na extremidade 5 do RNAm tornando esta molécula extremamente instável Atuação de endonucleases que vão degradar o RNAm internamente e com isso vão gerar extremidades desprotegidas as quais continuarão a ser degradadas por exonucleases c Silenciamento Mediado pelo RNA Interferência por RNA RNAi é a regulação da expressão gênica exercida por pequenas moléculas de RNA de fita dupla as quais possuem pouco mais de 20 ribonucleotídeos e se localizam no citoplasma da célula Agem na repressão da tradução e induzem a degradação do RNAm que tem uma sequência complementar ao RNA dupla fita Neste tipo de regulação pequenas quantidades do RNA dupla fita são capazes de degradar grandes quantidades de RNAm Esses pequenos RNAs interferente RNAsi micro RNAmi e o RNA associado à Proteína Piwi RNApi terão atuação nuclear com a capacidade de alterar estruturalmente a cromatina reprimindo assim a transcrição 25 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA 135 Transcrição Reversa Este evento é mediado pela enzima Transcriptase Reversa enzima típica de certos vírus retrovírus que apresentam o RNA como material genético A enzima é capaz de sintetizar uma dupla fita de DNA a partir da molécula de RNA viral Este DNA sintetizado é chamado de provírus e será incorporado ao DNA da célula do hospedeiro SUGESTÃO DE LEITURA O Capítulo 17 deste livro trata especificamente do Controle da Expressão Gênica nos Eucariotos e mostra as diversas alternativas que possuímos no controle de inúmeras características e produtos gênicos PIERCE Benjamin A Genética Um Enfoque Conceitual 5ª ed Guanabara Koogan 2016 780 p ISBN 9788527729055 14 TRADUÇÃO A tradução consiste na transmissão da informação genética do RNAm na construção da molécula polipeptídica O processo tem início com a montagem de um complexo de iniciação Para tal existe uma curta sequência de ribonucleotídeos no início de cada molécula de RNAm que possibilita a ligação deles às subunidades menores ribossomais através de ligações 26 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA hidrogênio Então vão se parear ao 1o códon do RNAm AUG próximo à extremidade 5 do RNAm o anticódon do 1o RNAt com a metionina Met ligada e só este RNAt conseguirá se ligar à subunidade menor do ribossomo Todo o conjunto se mantém unido com o auxílio dos fatores proteicos de iniciação Após a subunidade ribossomal maior se liga ao sistema formando o chamado ribossomo funcional então os fatores proteicos de iniciação se desprendem do complexo O processo de alongamento é baseado no seguinte princípio toda vez que o sítio A ribossomal não possuir nenhum RNAt com aminoácido ligado será a informação de que um RNAt com aminoácido está livre para parear seu anticódon com o códon presente no sítio A Essa chegada do RNAt com aminoácido no sítio A só será possível se o fator de alongamento EFTu com um GTP preso EFTuGTP estiver associado neste local Tal GTP é fundamental para a ligação sendo clivado com liberação de energia utilizado na formação de cada ligação peptídica PIMENTEL 2013 Desta forma a célula apresentará o sítio P ocupado com o 1o RNAt carregando a metionina e o sítio A também ocupado acontecendo a clivagem do GTP em GDP Pi O complexo resultante EFTuGDP desprendese do ribossomo para ganhar novo fosfato regenerando o EFTuGTP e retornando para novo ciclo de alongamento da cadeia proteica A quebra do GTP gera a energia para a formação da ligação peptídica entre o grupamento amino do RNAt que estava em P indo se ligar ao grupamento carboxi do aminoácido preso ao RNAt que está no sítio A Esta reação é mediada pela enzima ou centro peptidil tranferase aderida à subunidade maior ribossomal Em seguida acontece a translocação ribossomal ao longo do RNAm com gasto energético de GTP transferindo o RNAt o qual contém o dipeptídeo do sítio A para o sítio P e o RNAt que agora está sem aminoácido ligado estava no sítio P vai ocupar o sítio E ribossomal sendo deslocado do complexo para que possa se ligar a novo aminoácido e retornar à região da síntese proteica Agora o sítio A ribossomal está livre e o novo RNAt com aminoácido ligado ocupará este local e reiniciará novo ciclo conforme foi descrito Figura 6 27 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA Figura 6 Maquinaria para a Tradução 1 O Sítio P prende o RNAt com o peptídeo nascente 2 O sítio E prende o RNAt que vai sair do complexo 3 A ligação peptídica ocorre aqui 4 O sítio A prende um RNAt que chega Fonte Shutterstock 2020 Este processo seguirá até que chegue no sítio A ribossomal um dos três códons de terminação UAG UAA e UGA Eles são reconhecidos nos eucariotos pelo fator de terminação eRF que se liga ao ribossomo é necessária a presença do GTP e com a clivagem do GTP acontece a liberação de energia para finalizar o processo com separação da cadeia polipeptídica do último RNAt expulsão deste RNA e separação das subunidades ribossomais 15 GENOMA HUMANO ORGANIZAÇÃO DO DNA NUCLEAR E MITOCONDRIAL O ser humano possui 24 tipos cromossomais 22 autossomos X e Y porém em suas células somáticas são 46 cromossomos distribuídos em 22 pares de autossomos par do 1 ao 22 e o par do sexual sendo do sexo feminino o par do X XX e do sexo masculino um é o X e o outro o Y Figura 7 Nos gametas o ser humano possui 23 cromossomos um de cada autossomo do 1 ao 22 totalizando 22 e um dos sexuais que podem ser o X ou o Y neste caso apenas o 28 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA gameta masculino O genoma humano apresenta longas sequências de DNA e contém as informações necessárias para construção de um organismo vivo Podemos ao longo do genoma encontrar sequências não repetitivas e sequências repetitivas Inclusive mesmo dentro destas sequências as variações podem ser mínimas ou não Figura 7 Conteúdo Cromossomal Humano Fonte Shutterstock 2020 151 DNA Nuclear O genoma nuclear do ser humano compreende em torno de 33 do seu conteúdo em genes estruturais codificam polipeptídeos que integram enzimas hormônios receptores e proteínas estruturais e reguladoras e as sequências a eles relacionadas Desta maneira a maior parte do genoma humano 67 é o chamado DNA extragênico O tamanho do nosso genoma é de aproximadamente 6000 Mb Se tudo fosse gene estrutural existiriam de seis a sete milhões de genes em nosso genoma um número que hoje sabemos ser extremamente alto sendo constantemente comprovado que não existe relação linear entre o tamanho do genoma e a quantidade de genes BORGESOSÓRIO 2013 Estimase que existam entre 20 a 25 mil genes estruturais os quais são codificados 29 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA pelas sequências não repetitivas do nosso genoma e o restante é constituído de outros tipos de DNA Em geral para os eucariotos superiores a maior parte do genoma vai se caracterizar por possuir sequências de DNA repetitivo portanto sem função codificadora 1511 Tipos de Sequências de DNA DNA não Repetitivo Estas são sequências individuais presentes em apenas uma cópia por genoma que compõem os genes estruturais e as sequências a eles relacionadas Observase uma distribuição muito variada das sequências entre os cromossomos humanos bem como as regiões onde estão presentes A maior parte das sequências está nas regiões chamadas de subteloméricas as quais compreendem as regiões situadas entre o centrômero e as extremidades teloméricas restando às regiões centroméricas e heterocromáticas poucos genes estruturais BORGESOSÓRIO 2013 Em relação às sequências que se relacionam aos genes estruturais fazem parte os íntrons e os pseudogenes Como já foi visto os íntrons são as sequências internas de DNA transmitidas ao chamado transcrito primário sendo eles removidos durante o processamento do RNA por isso são classificados como sequência não codificante Os pseudogenes são os genes não funcionais que apresentam homologia sequencial à de genes estruturais e durante o processo evolutivo pararam de funcionar em geral devido às inserções deleções e às sequências flanqueadoras com 10 a 20 desoxirribonucleotídeos e que inibem a expressão destes pseudogenes 1512 Tipos De Sequências de DNA DNA Repetitivo Compreende o chamado DNA extragênico constituído por cerca de 2000 Mb sem informação genética conhecida 30 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA DNA Moderadamente Repetitivo São sequências relativamente pequenas que vão se repetir de 10 a 1000 vezes estando dispersas por todo o genoma humano Inclusas nesta classificação existem as famílias multigênicas que são formadas por genes funcionais multicópias os quais apresentam funções bem similares tendo surgido por duplicação e divergência evolutiva Temos neste grupo as Famílias Multigênicas Clássicas e as Superfamílias Gênicas As Famílias Multigênicas Clássicas apresentam nas suas sequências alto grau de homologia e elas se originaram de duplicações Como exemplo temos os genes que codificam os diversos RNAs ribossomais que se agrupam na região do nucléolo e estão presentes nos braços curtos dos autossomos acrocêntricos 13 14 15 21 e 22 Ainda dentro destas Famílias Multigênicas Clássicas as que também estão envolvidas com o RNA especificamente com os RNAs transportadores e dispersos pelo genoma formam numerosos conjuntos As Superfamílias Gênicas são compostas por genes que se originam por duplicação a partir de um gene precursor e apresentam funções muito semelhantes Como exemplos mais conhecidos existem a Superfamília do Sistema de Antígeno Leucocitário Humano HLA localizada no braço curto do cromossomo 6 e a superfamília dos receptores de linfócitos T DNA Altamente Repetitivo Repetições Dispersas não em Tandem Fazem parte deste grupo as sequências muito curtas em geral com menos de 100 pares de base as quais estão presentes milhares de vezes no genoma e não são transcritas Este DNA altamente repetitivo está disperso por todo o genoma humano e apresenta em torno de 1400 Mb não estando as sequências posicionadas em tandem adjacentes e em mesma direção As repetições dispersas podem ser os elementos de transposição transposons que se movem ao longo do genoma Existem quatro tipos principais das repetições dispersas a Longos Elementos Nucleares Dispersos ou Elementos Intercalares Longos LINEs Longe Interspread Nuclear Elements estas sequências constituem em torno de 640 Mb do genoma humano sendo a forma mais comum chamada de LINE 1 ou elemento L1 São sequências repetitivas com aproximadamente 6500 pb e que se apresentam em até 100000 cópias Existem três tipos de LINEs L1 L2 e L3 que se 31 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA apresentam bem dispersos no genoma e em grande quantidade em torno de 13 a 20 Uma parte destas sequências pode ter atividade de transposição b Pequenos Elementos Nucleares Dispersos ou Elementos Intercalares Curtos SINEs Short Interspread Nuclear Elements estas sequências abrangem cerca de 420 Mb do nosso genoma apresentamse com um tamanho aproximado de 500 pb em sua extensão aparecendo dispersas em mais de 500000 cópias ao longo do nosso genoma A família Alu ou repetições Alu se constitui em um dos tipos mais importantes deste tipo de sequência com uma extensão em média de 300 pb A família recebe este nome por apresentar sítio de clivagem para a enzima de restrição Alu I Ela tem a capacidade de autoduplicação e pode se inserir em outro local do genoma pois apresenta pequenas sequências flanqueadoras de repetição direta semelhante às sequências de DNA dos transposons Com isso pode ocasionar a interrupção de algum gene estrutural acarretando uma doença genética Seu mecanismo de transposição se assemelha às sequências LINE Postulase que tanto os elementos L1 quanto as repetições pertencentes à família Alu podem acarretar estas mutações patogênicas observadas em doenças hereditárias em nossa espécie como por exemplo a Hipercolesterolemia Hereditária doença que pode ter relação com tal mecanismo c Repetições Terminais Longas LTRs Long Terminal Repeats sequências que compreendem em torno de 250 Mb do genoma representam repetições diretas em ambas as extremidades e possuem promotores para início de transcrição da RNA Polimerase II além de demonstrarem sinais de poliadenilação envolvida no processamento do RNAm d Transposons de DNA constituem cerca de 90 Mb do genoma dividindose entre classes autônomas e não autônomas que se movem de um local para outro em nosso genoma através de mecanismo de corte e colagem mediado pela enzima transposase Estes elementos apresentam repetições terminais com as extremidades invertidas DNA Altamente Repetitivo Repetições em Tandem O início de uma repetição ocorrerá imediatamente adjacente ao final da outra constituindo um número grande de repetições de sequências de DNA não codificadoras Elas podem ser observadas em locais restritos ou muito dispersas ao longo do genoma e se dividem em três subgrupos DNA Satélite Minissatélites e Microssatélites 32 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA a DNA Satélite compreende uma proporção do DNA total de eucariotos não sendo observado em procariotos São sequências curtas em tandem com localização nas regiões flanqueadoras dos centrômeros as chamadas regiões heterocromáticas de alguns cromossomos como o 1 9 16 e Y Nos seres humanos a sequência mais conhecida é a da família alfoide b Minissatélites são repetições curtas em tandem Dividemse em DNA Telomérico localizado na porção terminal cromossômica os telômeros e que consiste em 10 a 15 Kb da repetição em tandem TTAGGG 6 pb sendo fundamental para a integridade do cromossomo durante a replicação Este DNA é adicionado ao cromossomo pela enzima telomerase DNA Minissatélite Hipervariável ocorre próximo aos telômeros mas também em outros locais no cromossomo Uma destas sequências é o DNA caracterizado como número variável de repetições em tandem VNTR Variable Nunber Tandem Repeats repetições curtas de 15 a 200 pb que serão detectadas no interior de genes e entre eles Sequência extremamente polimórfica que pode variar em tamanho de indivíduo para indivíduo oscilando de 1 a 20 Kb em sua extensão Muitos destes grupamentos estão dispersos ao longo do genoma e a variação em seu comprimento serviu de base para a criação entre os humanos da técnica de Impressão Digital do DNA DNA fingerprinting a qual foi aplicada na medicina forense para a identificação e diferenciação entre os indivíduos c Microssatélites são repetições curtas em tandem com menos de 10 nucleotídeos geralmente entre 1 a 5 as quais se apresentam dispersas no genoma com alto grau de polimorfismo São chamadas também de STRs Short Tandem Repeats sendo amplamente utilizadas como marcadores moleculares nas análises genômicas Estas sequências em geral não ocorrem no interior de sequências codificadoras porém as repetições de 3 nucleotídeos próximas aos genes se associam a algumas doenças hereditárias como o XFrágil Doença de Huntington e a Distrofia Miotônica Existem ainda sequências com 1 a 4 pares de base extremamente polimórficas que também são utilizadas como marcadores moleculares Para facilitar o entendimento segue esquema que resume a organização do Genoma Nuclear Figura 8 33 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA Figura 8 Organização do Genoma Nuclear Fonte Adaptada pelo autor a partir de BorgesOsório 2013 152 DNA Mitocondrial O DNA da mitocôndria é uma dupla fita circular com 16569 pares de base um DNA que não apresenta íntrons exceção para as leveduras não apresenta crossing over arcabouço de histonas e um sistema de reparo eficiente A fita é composta por uma 34 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA cadeia rica em bases de guanina as quais compõem a fita pesada H e outra cadeia rica em citosina que é a fita leva L O número de cópias deste DNA por célula é grande e em geral de herança materna mas já se sabe que alguns núcleos familiares apresentam também mitocôndrias paternas BORGESOSÓRIO 2013 Este genoma é extremamente compacto havendo 93 com função codificadora Existem no genoma mitocondrial humano bem como de outros mamíferos 13 genes que codificam proteínas 22 genes produtores de RNAt e 2 de RNAr Vale ressaltar que o código genético mitocondrial se diferencia do da célula pois o códon UGA corresponde ao triptofano AUA para metionina e ainda os códons de terminação AGA e AGG Outro fator importante é a taxa de mutação do DNA mitocondrial que é 20 vezes mais alta que o DNA nuclear devido à alta taxa de produção mitocondrial de radicais livres de oxigênio agentes mutagênicos que se soma à uma capacidade de reparo limitada O acúmulo de mutações no DNA mitocondrial gerou a existência de muitas variantes por isso foram criados haplogrupos de acordo com a distribuição geográfica sendo localizados na África L1 L2 e L3 Ásia M e N e Europa R os quais ainda vão se subdividir em vários subgrupos possibilitando a construção de uma árvore evolutiva O DNA mitocondrial também possui grande relevância do ponto de vista clínico em doenças que se originam por mutações no DNA mitocondrial e são herdadas pelo lado materno como foi mencionado na maioria dos casos Apesar desta lógica a transmissão não seria tão simples uma vez que a expressão de alguns genes mitocondriais é dependente de interação com genes nucleares Muitas proteínas presentes na mitocôndria são transcritas e posteriormente traduzidas por genes nucleares sendo levadas até a mitocôndria onde vão interagir com outras que são produzidas via DNA mitocondrial Assim por conta desta interação as doenças de origem mitocondrial seguem as Leis de Mendel e aquelas que são exclusivamente mitocondriais apresentam somente uma herança materna Outro ponto importante sob o ponto de vista médico é que como o DNA mitocondrial apresenta uma replicação independente do DNA nuclear e as mitocôndrias se segregam nas células filhas também de forma independente a proporção de mutações no DNA mitocondrial pode diferir bastante entre as células somáticas cuja heterogeneidade é conhecida como heteroplasmia estando diretamente ligada aos fenótipos variáveis que se observam nas doenças mitocondriais Cabe destacar que o perfil de mutação do DNA mitocondrial por si só não explicaria o perfil fenotípico das doenças mitocondriais porque os tecidos apresentam declínios nas taxas de fosforilação oxidativa com o passar da idade então este é um dos fatores que será somado ao todo No entanto tecidos que dependem bastante da 35 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA fosforilação oxidativa como o coração músculo esquelético e tecido nervoso central acabam tendo uma relação maior com as manifestações das doenças mitocondriais tais como miopatias encefalopatias problemas musculares etc 16 DNA PLASMIDIAL São pequenas moléculas de DNA circular bacteriano contendo genes que se tornam extremamente úteis para a célula Conferem características adaptáveis às adversidades como os genes de resistência aos antimicrobianos que permite a sobrevivência destes microrganismos PIMENTEL 2013 Todas as estruturas de DNA circular possuem ao menos uma sequência que capacita o plasmídeo para se replicar independente da replicação celular pois as sequências agem como as regiões de Origem de Replicação ORIs Em geral os plasmídeos menores aproveitam a maquinaria enzimática da célula hospedeira para replicar seu material genético Em contrapartida os maiores podem apresentar os genes para codificar enzimas especiais envolvidas na replicação plasmidial Existem ainda os plasmídeos capazes de se inserir no cromossomo bacteriano e com isso replicarse Eles são chamados de plasmídeos integrativos ou epissomais cujas estruturas podem se apresentar em cópia simples dentro da célula ou em múltiplas cópias embora os fatores que controlam esta quantidade permaneçam ainda pouco compreendidos Os plasmídeos chamados conjugativos se caracterizam pela capacidade que possuem em fazer conjugação sexual entre as células bacterianas permitindo a propagação deste tipo plasmidial de uma célula para outras Eles possuem um conjunto de genes de transferência os tra Caso um plasmídeo não conjugativo esteja presente na célula unido a um conjugativo poderá ser transferido juntamente com ele Estes plasmídeos são os de fertilidade F que carregam os genes tra não possuindo qualquer outra característica Já os plasmídeos de resistência R possuem genes que conferem a estes microrganismos hospedeiros a resistência a um ou mais antimicrobianos sendo mais comum a resistência à ampicilina ao clorafenicol ou ao mercúrio Eles são muito importantes na área clínica uma vez que podem representar perigoso grupo de cepas resistentes ao tratamento medicamentoso 36 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA Os Plasmídeos chamados de Col são importantes por possuírem a capacidade de codificar a produção de colicinas que são proteínas capazes de matar outras bactérias os Plasmídeos Degradativos capacitam a bactéria a metabolizar compostos incomuns como tolueno ácido salicíclico e outros e os Plasmídeos de Virulência conferem a capacidade de patogenicidade da bactéria hospedeira A capacidade dos plasmídeos de favorecer a célula hospedeira com mecanismos adaptativos pode ser observada na Escherichia coli uma bactéria residente no intestino grosso do ser humano e que sendo dotada de alguns plasmídeos é capaz de passar de um estado de residente fisiológico para um modo residente patogênico Estes plasmídeos codificam proteínas que alteram a superfície bacteriana permitindo a adesão das mesmas ao revestimento do intestino delgado Outro gene que pode estar presente no plasmídeo codifica uma toxina proteica de secreção enterotoxina a qual pode danificar as células intestinais estando diretamente ligada com os sintomas da disenteria 17 BACTERIÓFAGO Os fagos tiveram uma grande utilidade nos estudos sobre replicação transcrição e tradução Eles se caracterizam como um parasita bacteriano pois sua multiplicação só ocorrerá se este estiver dentro de uma bactéria Para tal os fagos se utilizam dos ribossomos fatores de síntese proteica aminoácidos e energia desta célula hospedeira A estrutura viral dos fagos é bem simples consistindo de uma molécula de DNA ocasionalmente pode ser RNA portadora de alguns genes sendo em geral para a replicação do fago as envolvidas na formação da cobertura protetora que é o capsídeo O sistema de infecção é comum para vários fagos e envolve basicamente três etapas a fixação na superfície externa bacteriana injetando seu material genético na célula hospedeira acontece a replicação viral com auxílio dos componentes bacterianos e enzimas sintetizadas através do genoma do fago e finalmente os outros genes são direcionados para a produção dos componentes do capsídeo com novas partículas sendo montadas e liberadas da célula Os fagos podem se apresentar na forma de icosaedro sem cauda icosaedro com cauda e o filamentar o tipo de ácido nucleico mais comum nos fagos é o DNA que se apresenta linear e bifilamentar embora ainda sejam observados DNA circular 37 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA bifilamentar DNA linear e circular unifilamentar além do RNA tanto uni como bifilamentar Uma característica atípica dos fagos é a presença de bases incomuns como a 5hidroximetilcitosina glicosilada e a hidroximetiluracil Para alguns tipos virais possivelmente em menos de 20 minutos todo o ciclo de infecção se completa Os ciclos dos fagos são divididos em duas categorias distintas o chamado Ciclo Lítico e o Ciclo Lisogênico sendo chamado de virulento o fago que só apresenta Ciclo Lítico No Ciclo Lítico a célula hospedeira se transforma em uma fabricante de fagos gerando uma prole de muitos fagos Já no Ciclo Lisogênico não são produzidas partículas de muitos fagos e em geral o DNA é integrado ao cromossomo da célula hospedeira No Ciclo Lítico na maioria dos fagos acontece no final do ciclo de infecção a produção de uma enzima chamada lisozima que ocasiona o rompimento da parede celular bacteriana permitindo a liberação dos fagos para o meio extracelular 18 CONTROLE DA EXPRESSÃO GÊNICA EPIGENÉTICA Como já foi estudado e trabalhado em muitas disciplinas as células tecidos e órgãos possuem suas especificidades e se caracterizam muitas vezes por atividades próprias que não são observadas em outros locais Juntando esta linha de pensamento é preciso lembrar que o conteúdo e informação cromossomal de todas as células é o mesmo excetuando gametas ou mutações tecidoespecíficas que possam ocorrer Isso quer dizer que na teoria o potencial para expressar proteínas e exercer funções cruzadas existe Então qual a razão da especificidade de função garantir o desempenho de atividade biológica específica para as células tecidos e órgãos e como nosso organismo consegue distribuir e regular esta especificidade Ela tem como base o bloqueio de inúmeros genes e ativação de tantos outros garantindo o desempenho de função específica de célula tecido e órgão Parte deste controle e consequentemente desta especificidade é dada pela epigenética Conforme Fingerman 2013 a epigenética consiste em modificações feitas em nosso genoma que não vão alterar as nossas sequências desoxirribonucleotídicas mas serão capazes de promover a expressão e inibição de inúmeras sequências gênicas Estas modificações são herdadas pelas gerações e muitas delas já começam a ser executadas 38 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA durante o desenvolvimento fetal A herança vai depender de pequenas modificações químicas no DNA e nas proteínas que interagem ativamente com o DNA as quais são responsáveis pela estrutura cromossomal como se conhece as histonas juntamente com outros tipos proteicos que compõem a cromatina Importante salientar que as modificações epigenéticas acontecerão ao longo de nossa vida fazendo parte de uma programação que será passada de geração para geração além de poderem ser moduladas pelo ambiente social no qual o indivíduo está inserido e pelos hábitos de vida de cada um SUGESTÃO DE VÍDEO Cada vez mais se pensa na epigenética e na sua capacidade de modular as questões comportamentais que antes se consideravam exclusivas da interação do ser humano com o meio que o circunda Estas questões comportamentais passam pela memória de boas experiências traumas fobias nutrição e capacidade de identificação com diversos temas dos mais variados como política prazeres literatura etc Este breve vídeo postulará de qual maneira a variação em nosso comportamento poderia acontecer Aproveitem porque é lúdico e bem explicativo Acesse o link httpswwwyoutubecomwatchvIAssjnhRtGg As alterações epigenéticas no genoma humano podem acontecer em qualquer momento do ciclo de vida Este epigenoma padrão de regulação epigenética pode ser transmitido para todas as células descendentes gerando um padrão epigenético característico de inúmeras linhagens celulares que se perpetuarão por gerações Desta forma as alterações podem ser herdadas transgeracionalmente influenciando com maior ou menor capacidade as mesmas linhagens celulares de indivíduos diferentes dentro de um laço genéticofamiliar FINGERMAN 2013 Como se sabe a compactação cromossomal mais especificamente da cromatina acarretará a inibição da replicação da transcrição e também do reparo do DNA Isto acontece por alterações na associação entre o DNA e os diversos componentes da cromatina tornando o DNA mais acessível para as proteínas reguladoras ou menos 39 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA acessível dependendo do objetivo da sinalização Para BorgesOsório 2013 a transição de modelagem que se observa no DNA pode acontecer de várias formas como por exemplo alterações na composição ou posição dos nucleossomos modificação das histonas com relaxamento da associação desta família proteica com o DNA adição de grupamento metila às bases nitrogenadas principalmente na citosina evento conhecido como metilação o qual regula a transcrição de genes por influenciar na ligação dos fatores de transcrição para mediar este evento Figura 9 Figura 9 DNA Histonas e Nucleossomo Histona Tail Cauda da Histona Fonte Shutterstock 2020 A flexibilidade da cromatina pode ser determinada pela capacidade que as caudas aminoterminais das histonas têm de apresentarem modificações póstraducionais covalentes embora sejam extremamente dinâmicas As modificações de adiçãoremoção são as acetilações fosforilações e metilações 40 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA 181 Modificações da Cromatina Como um ponto de destaque destas modificações encontrase a acetilação de resíduos de lisina que estão nas caudas das histonas e as histonas hipoacetiladas são observadas nas regiões de eucromatina inativa ou em regiões de heterocromatina Como as histonas acetiladas possuem uma afinidade menor pelo DNA a cromatina passa a ter uma estrutura mais relaxada e com isso está mais apta para a transcrição Em contrapartida a desacetilação das histonas promoverá uma repressão gênica uma vez que este evento fará com que a cromatina se torne mais densa através da livre interação das histonas com a molécula do DNA Para gerar tal perfil de acetilação ou desacetilação as enzimas são fundamentais no processo Histonas Acetil Transferases e Desacetilases de Histonas FINGERMAN 2013 A fosforilação terá como base a adição do grupamento fosfato negativo que vai se ligar com as histonas proteínas essencialmente com cargas positivas Quando as histonas são fosforiladas elas perdem a afinidade de atração pelo DNA e como consequência obtémse uma cromatina menos condensada favorecendo a transcrição portanto A adição dos grupamentos metil CH3 nas histonas pode tanto ativar como inativar a transcrição Para isso tudo dependerá de quais aminoácidos serão metilados nas histonas bem como do grau de metilação A metilação da histona H3 em sua lisina 9 sinaliza o Silenciamento do DNA estando assim amplamente distribuída nas regiões de heterocromatina como observado nos centrômeros e nos telômeros Além disso também é uma fosforilação observada nos promotores que são silenciados e no cromossomo X inativo Em contrapartida a metilação da histona H3 em sua lisina 4 provocará a atividade gênica sendo observada predominantemente nas regiões promotoras de genes ativos As ações de metilação e desmetilação são intermediadas por enzimas de adição e remoção dos grupamentos metil respectivamente sendo denominadas Metil Transferases de Histonas e Desmetilases de Histonas Em adição a estas modificações químicas existem a compactação e descompactação através de Complexos de Remodelagem de Cromatina SW1SNF ATPDependentes Tais complexos possuem a capacidade de modificar a topologia dos nucleossomos e consequentemente alterar a interação que existe entre o DNA com as histonas Os complexos são compostos de múltiplas subunidades e acabam por deslocar os nucleossomos em um processo ATPdependente expondo os promotores como alvos dos fatores de transcrição ao aumentar os níveis transcricionais 41 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA 182 Modificações do DNA O evento de metilação do DNA é muito importante para modular inúmeros processos no ser humano Dentre os principais podemos citar o controle da morfogênese durante o desenvolvimento embrionáriofetal a recombinação que vai ocorrer durante a meiose o rígido controle durante a replicação proteção contra agentes externos virais que podem ser inseridos em nosso genoma controle da expressão gênica envolvimento na diferenciação celular inativação do cromossomo X feminino entre outros eventos Os genomas podem apresentar modificações a partir de metilações que vão acontecer no carbono 5 da citosina 5MeC ocorrendo principalmente 70 a 80 em regiões ricas no dinucleotídeo CG as chamadas Ilhas CpG regiões maiores que 200 pares de base as quais apresentam cerca de 50 de bases C e G com aproximadamente 60 de dinucleotídeos CpG Figura 10 Esta região é muito observada nas sequências promotoras espalhadas em nosso genoma e as metilações do DNA estão relacionadas ao silenciamento gênico somando se ao processo descrito no item anterior na otimização e na organização da expressão gênica do ser humano Figura 11 Figura 10 Metilação da Citosina Fonte Elaborada pelo autor 2021 42 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA Figura 11 Metilação da Região Promotora Fonte Elaborada pelo autor 2021 Este processo terá início na conversão da homocisteína em metionina em um processo que envolverá folato vitamina B12 B6 e colina como principais doadores de radicais metil A metionina tornarseá a precursora imediata na formação do SAdenosilmetionina SAM que é o principal doador de radical metil para os processos os quais envolvem a metilação do DNA mas também de proteínas e lipídios Depois que o SAM é utilizado e a metilação acontece ele se torna Sadenosil Homocisteína SAH para posteriormente regenerar a homocisteína e o ciclo se reiniciar BORGESOSÓRIO 2013 As metilações em citosinas são feitas por três enzimas DNA Metiltransferases a Dnmt 1 Dnmt 3a e Dnmt 3b existindo dois tipos de metilação a chamada de manutenção e a de ponto Na replicação a fita filha está hemimetilada e a fita molde completamente metilada sendo necessário o mesmo padrão de metilação para ambas as fitas Desta forma na metilação de manutenção acontece o repasse fiel às células filhas do padrão de metilação presente na célula mãe por isso a Dnmt1 utiliza o padrão da fita molde para promover as metilações que faltam na fita nova filha A metilação de novo envolve as enzimas Dnmt 3a e Dnmt 3b as quais são expressas nas células embrionárias e possuem como função principal nesta etapa a metilação do DNA após a desmetilação obrigatória que ocorrerá no período préimplantação A metilação de novo vai ocorrer em ambas as fitas de DNA 43 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA Muitas proteínas demonstram especificidade para a 5metilcitosina e acabam participando de maneira indireta da regulação da expressão gênica com destaque para as Methyl Binding Proteins BMP que são proteínas de ligação às ilhas CpG As proteínas se afinizam pelos sinais de ligação covalente exercido pelas metilações das citosinas As MBPs possuem esta habilidade de se ligarem ao DNA metilado e consequentemente bloquear a expressão gênica de duas formas 1a A ligação das MBPs provoca perturbações espaciais na interação dos fatores transcricionais com a cromatina 2a Após a ligação nas regiões metiladas as MBPs têm a capacidade de recrutar fatores de compactação da cromatina como as desacetilases de histonas e tais modificações impedem o acesso dos fatores transcricionais em seus locais apropriados Assim sendo a metilação do DNA possui um vasto quadro de atuação Além dos citados no início deste tópico temos segregação centromérica durante a divisão celular envelhecimento apoptose imprinting parental será abordado mais adiante e outros Por conta desta vasta atuação é fundamental salientar que alterações nos padrões de metilação estarão associadas com diversas patologias dos mais diferentes tipos Para resumir e facilitar o entendimento segue pequeno esquema traduzido nas Figuras 12 e 13 Figura 12 Modificações Epigenéticas nas Histonas Fonte Elaborada pelo autor 2020 44 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA Figura 13 Modificações Epigenéticas no DNA Fonte Elaborada pelo autor 2020 183 Epigenética e Inativação do Cromossomo X da Mulher Como sabemos a chamada cromatina sexual do X aparece em células de mamíferos durante a interfase também conhecida como Corpúsculo de Barr Ela é correspondente a um dos cromossomos X que vai permanecer na forma espiralizado e compactado nas células interfásicas apresentando a chamada replicação tardia De acordo com a Hipótese de Lyon em homenagem à pesquisadora Mary Lyon 1961 este X seria geneticamente inativo pelo que se chamou de compensação de dose igualando em ambos os sexos a expressão dos genes que se localizam no cromossomo X BORGESOSÓRIO 2013 O mecanismo permitiria a equivalência na quantidade de produtos formados por um único alelo no homem em relação a um par de alelos na mulher uma vez que a mulher passa a ser hemizigota em um nível celular processo explicado adiante Tal processo acontece basicamente nos eventos que se seguem 1o A inativação do cromossomo X nas fêmeas dos mamíferos ocorrerá por volta do 13o ao 16o dia após a fecundação que seria o estágio final de blastocisto no desenvolvimento embrionário mitótico 45 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA 2o O processo de qual X será inativado nas células somáticas é aleatório ao acaso tendose um mosaico de células com o X paterno inativado e uma gama onde o X inativado é o materno em torno de 50 de células para cada situação Haja vista que o cromossomo tenha sido inativado em uma célula todas as suas células filhas terão o X de mesma origem inativado então mesmo a inativação sendo ao acaso uma vez ocorrida tornase permanente 3o A inativação do X se apresenta reversível nas células germinativas assim sendo o óvulo não apresenta X inativo A inativação do cromossomo X da mulher não chega a ser completo isto é alguns dos seus genes permanecem ativados pois se todos os locus estivessem inativos as mulheres teriam um perfil clínico da Síndrome de Turner O processo inicia por um gene denominado de XIST X Inactivation Specific Transcript o qual está localizado no braço longo do cromossomo X região 132 Xq132 Vale frisar que alguns dos genes escapam a esta inativação como os que se localizam na região pseudoautossômica região de homologia com o cromossomo Y a região pericentromérica e em torno de 25 a 30 dos genes do braço curto e assim tais genes teriam o dobro de expressão A inativação do X começa por uma região denominada como XIC Centro de Inativação do Cromossomo X Nela por volta do 13o e 16o dias o gene XIST se expressa gerando um longo RNA não codificante que revestirá o cromossomo X o qual necessita ser inativado e com isso acontece a indução do seu desligamento Logo no X que foi inativado o gene XIST está ativado e no X que permanece ativado o gene XIST está inativado No cromossomo X ativado acontece a expressão de um longo transcrito antissenso ao XIST que se chama TSIX sendo a sua expressão muito importante para que aconteça o desligamento do XIST a fim de evitar uma inativação posterior de um X o qual precisa estar ativado O cromossomo X que vai permanecer inativo apresenta um perfil de hipermetilação da Ilhas CpG além de um perfil de hipometilação das histonas H4 o qual acontece posteriormente ao silenciamento através do XIST O cromossomo X inativo vai apresentar mecanismos adicionais além dos citados acima e que auxiliam no Silenciamento da cromatina I expressão de RNA não codificante II sinalização para replicação tardia III modificação de histonas e IV recrutamento da variante de histona a Macro H2A histona com participação na regulação epigenética 46 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA PARA REFLETIR Se a epigenética é capaz de modular questões comportamentais vamos espe cular e refletir se seriam possíveis experiências ruins ou traumáticas vividas pelos pais ocasionarem marcas epigenéticas nos gametas sendo as consequências destas experiên cias transmitidas aos seus descendentes 184 Epigenética e Câncer Modificações muito importantes acontecerão nas células que vão ocasionar a troca para uma condição de malignidade a perda da capacidade de metilação dos oncogenes e de genes prometastáticos além disso acontece uma hipometilação dos elementos repetitivos a hipermetilação dos genes ligados às moléculas de adesão genes ligados ao reparo do DNA dos genes supressores de tumor e os genes capazes de inibir as metástases BIANDO 2016 A princípio as mudanças na cromatina antecedem a hipometilação de genes específicos sendo elas típicas do câncer devido à ativação das Histonas Acetil Transferases HATs e também uma expressão bem alta de metil transferases de histonas Pode ocorrer ainda um grande aumento na atividade de DNA desmetilases e como resultado acontece desmetilação geral no DNA destas células tumorais A hipometilação acarretará uma instabilidade cromossômica levando a rupturas e quebras cromossomais com consequente ativação de genes prometastáticos nos estágios avançados dos processos cancerígenos Os estudos epigenéticos demonstram metilações aberrantes tanto no câncer de próstata quanto no de mama No entanto o câncer de pele não melanoma não apresenta um perfil de hipermetilação diferente do câncer de pele melanoma 47 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA NA PRÁTICA DA SAÚDE Como se pode perceber o campo da epigenética ainda é um terreno de inúme ras possibilidades e as questões comportamentais podem ter na epigenética uma gama enorme de possibilidades para explicar os processos fisiológicos bem como os patológi cos Um destes campos está ligado à obesidade um problema crônico que assola nosso planeta e carrega com ele uma gama de outros problemas os quais comprometem a saúde e abreviam a vida de muitas pessoas O artigo indicado trabalhará a questão da obesidade entre gerações leitura extremamente instigante e atualizada Obese fathers lead to an altered metabolism and obesity in their children in adulthood review of experimental and human studies Versão em português acesse o link httpswwwscielobrpdfjpedv93n6pt00217557 jped93060551pdf 48 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA CONSIDERAÇÕES FINAIS Prezados alunos chegamos ao final da Unidade 1 na qual trabalhamos os eventos básicos da Biologia Molecular a replicação a transcrição e a tradução Para isso conectar se com disciplinas que já ocorreram vai ser fundamental principalmente com a Biologia e com a Genética É importante ressaltar que o entendimento dos mecanismos de regulação destes eventos vai ajudálo a compreender muito dos processos biotecnológicos Dando prosseguimento à unidade descrevemos o nosso genoma nuclear e o mitocondrial sendo ambos importantíssimos até para o entendimento da complexa rede de informação que nossos genomas possuem Em adição à temática temos a conexão fundamental que nos embasará para que possamos entender os testes de identificação por vínculo genético paternidade etc Não podemos esquecer que o plasmídeo também compõe o genoma porém sendo bacteriano em sua maioria O bacteriófago está incluso em genoma viral e ambos constaram nesta unidade por serem dois vetores importantes utilizados na tecnologia do DNA recombinante Fechando a unidade o tema da epigenética trouxe muitas novidades e acima de tudo muitos questionamentos porque é um campo aberto de possibilidades o qual cada vez mais avança no campo das ciências comportamentais explicando processos fisiológicos patológicos e uma série de outros eventos em um vasto universo genético 49 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA EXERCÍCIO FINAL 01 CONHECIMENTO O chamado Dogma Central da Biologia Molecular envolve o processo de Replicação Transcrição e Tradução que são fundamentais para duplicação do genoma bem como para sintetizar toda e qualquer proteína pela célula Em função do conhecimento adquirido ao longo desta unidade analise as afirmativas abaixo I Durante o evento de replicação o grupo fosfato de cada nucleotídeo será unido ao nucleotídeo da outra fita por ação da enzima DNA Ligase em uma ligação chamada de fosfodiéster II As regiões promotoras se apresentam como sequências de DNA as quais são reconhecidas pelos componentes envolvidos na transcrição possuindo uma localização adjacente aos genes que serão regulados III Vários hormônios em nosso organismo ao se complexarem com seus respectivos receptores e formarem o complexo hormônioreceptor migrarão para o núcleo e se ligarão em cromossomos específicos nas regiões que são denominadas de acentuadores promovendo desta forma uma regulação transcricional IV Na transcrição a nova fita de RNA sintetizada é idêntica em sequência lembrando que onde for timina no DNA vai ser uracila no RNA com a fita chamada fita molde e complementar à outra fita do DNA que é denominada fita codificadora V O processo de tradução começa a encerrar quando se apresenta ao sítio A ribossomal qualquer um dos códons de terminação sendo fundamental o reconhecimento destes códons nos eucariotos pelo fator de terminação eRF Está correto o que se afirma em a É falsa apenas a afirmativa I b São falsas somente as afirmativas I e III c São verdadeiras somente as afirmativas II III e IV d É falsa apenas a afirmativa IV e São verdadeiras somente as afirmativas II III e V 02 CONHECIMENTO Nosso genoma apresenta longas sequências de DNA contendo as informações que são necessárias na construção de um organismo 50 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA vivo Ao longo deste genoma podem ser encontradas sequências não repetitivas e sequências repetitivas Em função do conhecimento adquirido ao longo desta unidade analise as afirmativas abaixo I A maior parte das sequências de DNA não repetitivo se encontra nas regiões chamadas de subteloméricas II Como repetições dispersas não em tandem podemos citar os transposons e os íntrons III DNA satélite não se observa em procariotos IV As regiões de VNTR são repetições dispersas de sequências não adjacentes V O DNA mitocondrial humano não apresenta íntrons VI O DNA plasmidial coordena sua replicação conjunta com o DNA cromossomal bacteriano Está correto o que se afirma em a É falsa apenas a afirmativa II e VI b São falsas somente as afirmativas I e II c São verdadeiras somente as afirmativas I III e V d É falsa apenas a afirmativa VI e São verdadeiras somente as afirmativas I II III e V 03 CONHECIMENTO As modificações que são feitas em nosso genoma e que não vão alterar as nossas sequências de nucleotídeos mas serão capazes de promover a expressão e inibição de inúmeras sequências gênicas são conhecidas como epigenética Em função do conhecimento adquirido ao longo desta unidade analise as afirmativas abaixo I Nas regiões de eucromatina inativa ou em regiões de eucromatina são observadas as Histonas Hipoacetiladas II A desacetilação das histonas vai promover uma repressão gênica III A metilação da Histona H3 em sua Lisina 9 está amplamente distribuída nas regiões de Heterocromatina como observados nos centrômeros e nos telômeros IV As metilações da guanina ocorrerão em elevado número nas chamadas Ilhas CpG V As Methyl Binding Proteins BMP são proteínas de ligação às ilhas CpG VI A inativação do cromossomo X nas fêmeas dos mamíferos ocorrerá por volta do 13o 51 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA ao 16o dia após a fecundação VII O processo inicia por um gene denominado de XIC Assinale a alternativa correta a São falsas apenas as afirmativas I III e IV b São falsas somente as afirmativas I IV e VII c São verdadeiras somente as afirmativas I III e V d É verdadeira apenas a afirmativa VI e São verdadeiras somente as afirmativas I II III V e VII 52 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA REFERÊNCIAS BALLARÉ C CASTELLANO G GAVEGLIA L ALTHAMMER S GONZÁLEZ VALLINAS J EYRAS E LE DILY F ZAURIN R SORONELLAS D VINCENT G P BEATO M Nucleosomedriven transcription factor binding and gene regulation Molecular Cell Cambridge v 49 p 6779 2013 BIANCO T M ABDALLA DR Epigenética dos Linfomas do Tipo NãoHodgkim Revisão da Literatura JCBS v 2 n1 p 1017 2016 BORGESOSÓRIO Maria Regina Lucena ROBINSON Wanyce Miriam Genética humana 3ª ed Porto Alegre ArtMed 2013 FAULK C DOLINOY D C Timing is everything the when and how of environmentally induced changes in the epigenome of animals Epigenetics Austin v 6 p 791797 2011 FINGERMAN I M ZHANG X RATZAT W HUSAIN N COHEN R F SCHULER G D NCBI Epigenomics whats new for 2013 Nucleic Acids Research London v 41 p D221D225 2013 GRIFFITHS A J F GELBART W M MILLER D T LEWONTIN R C Genética Moderna 1ª Ed Rio de Janeiro Editora Guanabara Koogan 2001 MALACINSKI G M Fundamentos de Biologia Molecular 4ª Ed Rio de Janeiro Editora Guanabara Koogan 2005 NUSSBAUM R L MCINNES R R WILLARD H F THOMPSON J S THOMPSON M W Thompson Thompson Genética Médica 8ª Ed Rio de Janeiro Guanabara Koogan 2016 PASTERNAK J J Uma Introdução à Genética Molecular Humana 2ª ed Rio de Janeiro Guanabara Koogan 2007 PIMENTEL M SANTOSREBOUÇAS C GALLO C Genética Essencial 1ª Ed Rio de Janeiro Guanabara Koogan 2013 WEAVER I C G CERVONI N CHAMPAGNE F A DALESSIO A C SHARMA S SECKL J R DYMOV S SZYF M MEANEY M J Epigenetic programming by maternal behavior Nature Neuroscience New York v 7 p 847854 2004 UNIDADE2 PROJETO GENOMA HUMANO BIOINFORMÁTICA E CARIÓTIPO TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE E PURIFICAÇÃO DE MATERIAL GENÉTICO 54 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA INTRODUÇÃO À UNIDADE Nesta Unidade 2 transitaremos em termas diversos que podem conectarse em maior ou menor grau lembrando que muitos dos conceitos serão embasados por disciplinas anteriores pois a formação profissional é uma escada com cada degrau tendo a sua importância na caminhada do conhecimento Começaremos a segunda unidade pelo Projeto Genoma Humano PGH o qual teve como objetivo primário o sequenciamento de mais de 3 bilhões de desoxirribonucleotídeos do genoma humano Este projeto acabou produzindo uma quantidade de informação enorme além da certeza de que muita informação ainda não foi compreendida e precisa ser amplamente explorada pois em pesquisa quanto mais se sabe mais se certifica de que muito existe para ser descoberto O PGH teve o aporte de poderosa tecnologia tanto em termos de equipamento quanto em programas para análise de dados e criação dos bancos genéticos adentrando na Bioinformática como poderosa ferramenta nas análises Ela é hoje fundamental não só na parte de análise de sequências ou configurações genéticas mas também na área da proteômica a qual terá importante correlação com a área da saúde no desenvolvimento e análise de tratamentos e condutas terapêuticas nas mais diversas patologias que acometem o ser humano O Projeto Genoma Humano também levantou e continua levantando questões éticas as quais necessitam estar sempre em discussão não somente no meio da saúde mas em todos os segmentos sociais uma vez que sendo nosso genoma propriedade individual e inviolável até que ponto estamos protegidos quanto ao direito à reserva da informação gerada pelo Projeto ou por descobertas futuras as quais ainda surgem estando apoiadas no PGH Refletir sobre o assunto é também obrigação profissional e tais questões certamente deverão fazer parte da postura crítica que teremos ao longo dos próximos anos Seguiremos na unidade com o cariótipo sua caracterização importância de se identificar o conteúdo correto dele O Cariograma faz parte da Citogenética e auxilia enormemente os profissionais da área da saúde na obtenção de uma visão geral do genoma como também no diagnóstico e no direcionamento da conduta médica em diversas anormalidades relacionadas ao nosso quadro cromossomal Um passo crucial que nos permitirá aprofundar e trabalhar novos conhecimentos para embasar as técnicas mais utilizadas nos laboratórios clínicos e nas indústrias 55 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA de biotecnologia surge com o que se convencionou como Tecnologia do DNA Recombinante um conjunto de técnicas as quais possuem uma ampla aplicação Reconhecer sua criação e sua aplicabilidade também será fundamental no entendimento dos chamados biofármacos compostos produzidos eou extraídos dos seres vivos através de processos biotecnológicos tendo como princípio ativo um agente biológico O fechamento da Unidade 2 trabalhará no processo de purificação de material genético de diversas fontes e em cada etapa será possível identificar os principais agentes e qual a função de cada um para a obtenção do produto final 22 PROJETO GENOMA HUMANO Apesar de ter iniciado oficialmente no dia 1º de outubro de 1990 a ideia de sequenciar todo o genoma do ser humano começou bem antes no início da década de 80 e oito anos depois 1988 os fundos financeiros americanos foram obtidos pelo Departamento de Energia Department of Energy DOE juntamente com os Institutos Nacionais de Saúde e com o Congresso dos Estados Unidos O Projeto Genoma Humano PGH foi iniciado tendo em sua direção James Watson sim você conhece este nome o cientista que junto com Francis Crick descreveu a estrutura da molécula do DNA Na época ele ocupava a Direção do National Human Genome Research Institute NHGRI sendo posteriormente substituído por Francis Collins Fora dos Estados Unidos a organização multinacional do projeto cabia à fundação Human Genome Organization HuGO Havia uma crescente discussão envolvendo o patenteamento das regiões genômicas e a obtenção de lucro o que acabou atraindo John Craig Venter cientista e empresário no ramo da Biotecnologia Ele acabou fundando a Celera Genomics empresa privada a qual definiu que sequenciaria todo o genoma humano até 2001 dois anos antes das estimativas do consórcio público BORGES OSÓRIO 2013 Na época a Celera trabalhava com uma tecnologia inovadora que era utilizada para sequenciar longas fitas de DNA conhecida como Whole Genome Shotgun O aporte financeiro junto à Celera gerou enorme preocupação ao consórcio internacional fazendo com que o PGH decolasse em definitivo para acelerar seus trabalhos uma vez que a empresa privada poderia patentear suas descobertas e colocar muitos institutos de 56 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA pesquisa e outras empresas dependentes da Celera Esta corrida científica culminou com uma apresentação em 2001 nas duas principais revistas científicas mundiais pelo consócio internacional na Nature dia 15 de fevereiro INTERNATIONAL HUMAN GENOME SEQUENCING CONSORTIUM 2001 e pela Celera na Science em 16 de fevereiro VENTER 2001 tendo a conclusão oficial do projeto ocorrido em 2003 juntamente com as comemorações dos cinquenta anos da descrição da estrutura molecular do DNA Não resta dúvida de que o PGH em um primeiro momento gerou enorme expectativa tanto na comunidade científica quanto fora dela Uma expectativa seria o entendimento e consequente direcionamento para a cura de diversas doenças além de um enorme avanço em todas as áreas das pesquisas biomédicas Apesar destas expectativas as quais soaram muito mais como um imediatismo irreal o PGH trouxe muitos avanços em relação ao conhecimento sobre o genoma humano fazendo com que a comunidade científica entendesse que estava de posse de um quebracabeça com todas as peças contadas e identificadas mas que mesmo finalizado e montado revelando sua figura final seria trabalhoso e requereria bastante estudo análise e novas tecnologias ou seja abriuse um enorme campo diante das ciências envolvidas com a genética direta ou indiretamente Obtidas todas as peças o foco foi se concentrar na montagem dos fragmentos na ordem exata e em seus cromossomos corretos ao identificar seus produtos gênicos e entender o processamento a fim de esclarecer se aquela sequência favoreceria diferentes formas da mesma proteína qual o papel destes produtos gênicos além de muitas outras análises NIH 2020 As informações geradas pelo PGH produziram uma gama enorme de conhecimento como por exemplo o conteúdo de 32 bilhões de nucleotídeos sendo o tamanho médio dos nossos genes em 3000 bases com grande variação o maior dos genes o da distrofina com 24 milhões de pares de base em torno da metade dos genes tem função ainda desconhecida os seres humanos apresentam 999 da sequência do genoma idêntica as sequências repetitivas já abordadas na Unidade 1 constituem mais da metade do genoma humano as quais se rearranjam reformulando o genoma criando genes completamente novos ou modificando os já existentes A se destacar o cromossomo 1 que é o maior do genoma humano apresentando 3168 genes em comparação ao Y que é nosso menor cromossomo com 344 genes NIH 2020 Várias sequências identificadas foram associadas a muitas disfunções e diversas patologias como câncer de mama surdez doenças musculares cegueira etc Um fato extremamente importante foi a localização de regiões que apresentam apenas uma base de diferença em meio às sequências conservadas conhecidas como Polimorfismo de 57 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA Nucleotídeo Único Single Nucleotide Polymorphism SNP que são regiões envolvidas com inúmeras patologias cardiovasculares diabetes câncer artrite etc NIH 2020 As perspectivas se voltaram para a descoberta de novas mutações ligadas a diversas doenças promovendo uma conduta terapêutica mais eficaz através da farmacogenômica eou terapia gênica Tornouse possível também a análise da interação patogênica de substâncias tóxicas químicas ou biológicas com o nosso material genético bem como a avaliação de resistência a estas substâncias A própria Genética de Populações ganha espaço com os estudos de evolução e migração de grupos populacionais Os dados adquiridos permitiram ainda o desenvolvimento de testes e análises para diagnósticos prénatal para indivíduos présintomáticos investigação de inúmeros genes e sequências correlatas a criação de mapas genéticos avaliação de risco individual permitindonos hoje viver a era de uma Biologia Molecular Preditiva na qual médicos e especialistas se antecipam ao problema ao proporem além de tudo um monitoramento mais constante e muitas vezes uma mudança no estilo de vida dos indivíduos ou seja uma terapia individualizada Cabe destacar que o número de doenças monogênicas de mais fácil identificação e tratamento é bem menor quando comparado com o restante das doenças genéticas as quais são multifatoriais e complexas por isso a grande importância que o mapeamento gênico passou a ter e que auxilia consideravelmente no desenvolvimento e montagem dos testes moleculares Não se pode ignorar que a abertura de novas frentes de estudo não se resume à análise genética devendo ser incluída nesta gama de possibilidades a análise dos diversos RNAs principalmente no RNA de interferência RNAi as inúmeras possibilidades de processamento do transcrito primário e a própria análise da estrutura proteica uma vez de posse da sua sequência nucleotídica 221 Projeto Genoma Humano e Bioética Com o desenvolvimento e os achados do Projeto Genoma Humano entrouse na discussão ética sobre as questões de patentear as sequências genéticas descobertas e caracterizadas 58 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA A Declaração dos Direitos Humanos bem como a Declaração Universal do Genoma Humano que foram apresentadas na vigésima nona sessão da Conferência Geral da Unesco ocorrida de 21 de outubro a 12 de novembro de 1997 determinou que o genoma humano era patrimônio da Humanidade e estaria portanto protegido contra a patenteabilidade De acordo com as leis brasileiras e como parte que compõe o organismo do ser humano não é possível ser patenteado Porém a prática tem se mostrado bem diferente já que são muitos os casos nos quais a patente das sequências acaba gerando bloqueio de pesquisas e o desenvolvimento de novas tecnologias O exemplo emblemático aconteceu com a caracterização do gene BRCA1 que está relacionado com a predisposição para o câncer de mama e em alguns casos para o câncer de ovário Este gene foi sequenciado e após uma guerra jurídica pela patente e a compra destes direitos a empresa de biotecnologia norteamericana Myriad Genetics associada com a Eli Lilly indústria farmacêutica adquiriu os direitos gerando um monopólio para todo tipo de estudo e pesquisa que envolvesse o citado gene Como o BRCA1 sofre muitas mutações a Myriad é a única autorizada a fazer pesquisas sobre novas mutações indicando que quem possua interesse em fazer deverá pagar para a empresa detentora dos direitos mediante autorização da empresa O mesmo vale para a exploração comercial de todo e qualquer teste genético envolvendo o BRCA1 23 BIOINFORMÁTICA No item anterior foi trabalhado o Projeto Genoma Humano e seus impactos na área da saúde desde a caracterização de genes ligados a diversas patologias bem como a melhoria de condutas terapêuticas e o desenvolvimento de novos testes moleculares Porém nossos estudos de diversas disciplinas dentre elas a Bioquímica e a Biologia já permitem sua compreensão de que existe uma distância entre a simples identificação do gene e a definição da estrutura tridimensional da proteína gerada a partir deste sendo esta caracterização estrutural fundamental para o desenvolvimento de fármacos e seus derivados E o estudo não precisa estar focado apenas nos genes mas também nas chamadas sequências não codificantes uma vez que estas podem ter a sua expressão regulada por fatores de transcrição proteicos 59 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA A Bioinformática envolve diversas áreas do conhecimento Biologia Molecular Biologia Celular Bioquímica Química Física Matemática Computação dentre outras cada qual tendo uma participação maior ou menor com as suas especialidades A metodologia surgiu na década de 1980 com foco no desenvolvimento de novas abordagens e perspectivas que fossem capazes de revolucionar a análise de informações biológicas e adicionalmente desenvolver novas metodologias que permitissem a resolução de problemas complexos Nas últimas décadas as adaptações e os avanços na área das Ciências da Saúde foram possíveis através do grande desenvolvimento de recursos tecnológicos que promoveram a criação de programas analíticos capazes de armazenar complexas sequências genéticas Isto permitiu à informática assumir importante papel nos estudos da área biológica abrindo novas frentes em áreas de estudos conhecidas como genômica e proteômica VERLI 2014 Neste caderno o foco será a associação da bioinformática com a genômica Ainda de acordo com o autor em uma análise direta e simplificada a Bioinformática será o estudo da aplicação das técnicas computacionais e da matemática utilizadas para gerar bioinformação Ela trabalha com dados brutos gerando informação sobre reconhecimento de sequências gênicas predição de configuração tridimensional de proteínas identificação de inibidores enzimáticos agrupamento de proteínas homólogas organizar e relacionar informações biológicas análise de expressão gênica estabelecimento de árvores filogenéticas entre outras aplicações A Bioinformática vem cada vez mais apoiando seu desenvolvimento nas ciências computacionais na estatística e na biologia molecular com a finalidade de poder organizar os resultados que são gerados em grande quantidade e velocidade pelos sequenciamentos genéticos bem como nos produtos proteicos de muitas destas sequências O desenvolvimento de métodos estatísticos capazes de analisar grandes quantidades de informação dados biológica tem a finalidade de fazer uma analogia para inferir funções de sequências gênicas estabelecendo as relações estruturais entre sequências não codificantes eou genes e as proteínas O desenvolvimento da era genômica através da Bioinformática é apoiado na rapidez e otimização da decodificação de sequências genéticas em poucos minutos Para se ter uma noção numérica uma sequência de 12 mil bases pode ser decifrada em menos de um minuto Em adição às análises de pequenas diferenças em sequências gênicas possibilita o desenvolvimento de ferramentas que melhoram o diagnóstico de diversas doenças e anomalias uma vez que estas diferenças são submetidas à ferramentas estatísticas as quais podem definir maior ou menor possibilidade de manifestação da doença A Bioinformática não pode ser vista apenas como aplicável No que se chama de 60 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA pesquisa básica seu alcance é muito mais amplo e se estende às pesquisas aplicadas pois cada vez mais avançam as pesquisas e o desenvolvimento de modelos que simulam moléculas capazes atuar como princípio ativo para serem utilizadas na construção de produtos terapêuticos Para tanto os estudos se concentram no campo da cinética de reações bioquímicas verificando se as moléculas candidatas aceleram ou inibem processos patológicos e como o fazem Isso pode ser facilmente observado pela grande quantidade de empresas farmacêuticas que investem neste ramo de análise Todos os avanços que surgiram e continuam surgindo na área de Biologia Molecular colocam a Bioinformática com um potencial ilimitado uma vez que novas sequências aparecem novos genes são caracterizados mecanismos regulatórios são descobertos e sem esquecermos que o processamento das sequências não codificantes íntrons podem sofrer variações com a produção de muitas isoformas com estrutura tridimensional e atividades completamente distintas Tal feito já se pode comprovar na prática médica na utilização da Bioinformática como ferramenta para o desenvolvimento de medidas terapêuticas eou preventivas contra tumores e agentes infecciosos BORONI 2020 SVRAKA 2010 Em termos de potencialidades em desenvolvimento e aplicabilidade em um espaço de médio prazo a Bioinformática contribui muito na análise de ausência de atividade de genes permitindo sua restituição ou ainda em uma análise quantitativa pode suprir seu produto em foco oposto ao que a análise de superativação gênica permitiria isto é um controle negativo do mesmo 231 Bioinformática Alinhamento Os bancos de dados crescem paulatinamente muito em função do desenvolvimento e aprimoramento nas técnicas de sequenciamento Em pararelo isto acabou gerando uma demanda pelo aumento da capacidade de armazenamento e pelo desenvolvimento de técnicas de processamento de análise de dados Também foram criados e aperfeiçoados os algoritmos de análise essenciais nas análises das sequências biológicas além das técnicas de alinhamento de sequências as quais são de extrema importância para a Bioinformática que conceitualmente vão se basear na comparação entre duas ou mais 61 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA sequências que analisam caracteres individuais os quais se encontram na mesma ordem nas sequências analisadas VERLI 2014 Quaisquer que sejam as moléculas analisadas nestes programas nucleotídeos de DNA ou RNA e aminoácidos dos peptídeos e proteínas a comparação entre as moléculas será baseada na comparação às respectivas letras Claro que desta forma o processo parece extremamente simples mas a análise de similaridade de sequências é de complexa metodologia e decisiva para as análises de Bioinformática No alinhamento de sequências elas são organizadas em linhas e os caracteres biológicos as letras integrarão as colunas do alinhamento Após esta organização algoritmos específicos farão a busca pela melhor correspondência para as sequências analisadas permitindo a criação de espaços entre estes caracteres a fim de que todas as sequências possuam exatamente o mesmo comprimento Assim a visão da similaridade se torna mais fácil uma vez que caracteres idênticos ou similares integram a mesma coluna e os algoritmos acabam por minimizar as diferenças entre as sequências e proporcionam um alinhamento ótimo Esta similaridade é chamada de identidade e quantifica a porcentagem dos caracteres idênticos entre as sequências analisadas VERLI 2014 Dentro dos diferentes campos da Bioinformática os procedimentos de alinhamento são de grande relevância nas pesquisas de filogenética e análise evolutiva nos estudos de inferência estrutural e funcional das proteínas e em todas as análises de similaridade e identificação nos estudos de genômica 232 Bioinformática Montagem de Genomas Na execução metodológica será feita a quebra cromossomal aleatória o que vai gerar um número variado de fragmentos de DNA denominados de reads que oscilarão em comprimento de algumas dezenas a poucas centenas de pares de base Os reads são alinhados entre si buscando as sobreposições de mesma sequência Com isso formam se os fragmentos contíguos chamados de contigs os quais são definidos como a união de dois ou mais reads que posteriormente após o alinhamento formarão o super contig VERLI 2014 como se pode observar na Figura 14 a seguir 62 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA Figura 14 Montagem de Genomas Fonte Elaborada pelo autor a partir de Verli 2014 Nesta metodologia de sequenciamento foram desenvolvidos algoritmos e os programas de montagem trabalham com a sobreposição os chamados grafos de sobreposição ou grafos de Bruijn os quais identificam reads com possibilidade de compartilharem trechos de sobreposição entre si Muitos programas foram desenvolvidos e utilizados na montagem de genomas utilizando diferentes algoritmos Podemos citar alguns como Celera WGS Assembler para grandes genomas CLC Genomics Workbench para genomas e transcriptomas Phrap para genomas e transcriptomas Velvet para genomas pequenos e transcriptomas etc VERLI 2014 A análise de organismos eucariotos apresenta alguns obstáculos como o número de cromossomos gerando uma grande quantidade de contigs especialmente os eucariotos superiores que apresentam uma vultosa quantidade de sequências repetitivas descritas na Unidade 1 o que torna a montagem mais trabalhosa em função de um alinhamento de alto escore por sequências em comum Outra dificuldade é o tamanho que no caso do ser humano pode chegar a mais de 3 bilhões de base VERLI 2014 63 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA 24 CARIÓTIPO O citologista austríaco Walther Flemming foi o primeiro a publicar imagens dos cromossomos humanos fato ocorrido em 1882 o qual permitiu a criação do termo cromossomo que significa corpo colorido em 1888 pelo citologista alemão Waldeyer Com a redescoberta dos trabalhos de Mendel em 1900 Sutton estabeleceu a Teoria Cromossômica da Herança e nomeou a nova ciência de Citogenética a qual passava a unir as técnicas e conceitos de citologia com a ciência emergente da Genética Já no final do Século XIX e início do XX com os avanços tecnológicos na microscopia aconteceram ajustes para determinação no número correto de cromossomos nas células humanas uma vez que em 1912 von Miniwarter achava que eram 47 nos homens e 48 nas mulheres e depois foi definido como 48 tanto para homens quanto para mulheres por Theophilus Painter em 1921 Foi então que em 1956 Tjio e Levan trabalhando com técnicas de cultivo celular usaram células de tecido pulmonar de embriões humanos e determinaram o número correto de cromossomos nas células humanas definido como 46 Posteriormente houve a padronização que hoje sabemos ser de 44 autossomos par do 1 ao 22 e dois sexuais que na mulher seria o par XX e no homem o par XY Os cromossomos na metáfase são visíveis na sua melhor forma e se constituem por duas cromátides que estão unidas pelos centrômeros estrutura chamada de constrição primária Assim o centrômero divide as cromátides em braços os curtos são chamados de p do francês petit que significa pequeno e por convenção são posicionados acima do centrômero e os braços longos são chamados de q do francês queue que significa cauda e é posicionado abaixo do centrômero Nas extremidades cromossomais são observadas as regiões conhecidas como telômeros NUSSBAUM 2016 Figura 15 64 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA Figura 15 Estrutura Cromossomal 1 Telômeros 2 Braço Curto 3 Braço Longo 4 Centrômero 5 Cromátides Irmãs Fonte Shutterstock 2021 241 Estrutura e Organização Cromossomal Durante a interfase o chamado núcleo interfásico apresenta o nosso material genético como filamentos embolados e bem corados a chamada cromatina que além do DNA também apresenta proteínas conhecidas como histonas e outras chamadas de não histonas além de certa quantidade de RNA fosfatídeos e elementos minerais As histonas são proteínas de carga positiva apresentando grande quantidade de arginina e lisina em sua composição o que favorece a interação com o DNA que como ácido nucleico apresenta carga negativa Vale ainda complementar que a cromatina apresentarseá na forma de eucromatina e heterocromatina sendo esta última a mais condensada e que se cora mais intensamente por corantes básicos no núcleo interfásico além de apresentar atividade gênica menos intensa já a eucromatina permanece descondensada durante a interfase De acordo com Nussbaum 2016 na estrutura cromossomal destacamse Cromômeros que são os grânulos encontrados ao longo da estrutura 65 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA cromossomal justamente porque a cromatina não é um filamento uniforme e os engrossamentos irregulares assumem este aspecto granular Cromátides ou Braços em número de duas são resultantes da separação longitudinal durante a divisão celular e separada uma da outra pelo centrômero Centrômero também chamado de constrição primária que é uma região heterocromática de estrangulamento estrutural e influi no movimento do cromossomo durante a divisão celular Regiões de Satélite porção distal observada em cromossomos acrocêntricos separada do restante da estrutura cromossomal pela constrição secundária onde se observam as regiões organizadoras de nucléolos Telômeros são as porções terminais envolvidas na capacidade de divisão celular e do número de divisões que a linhagem celular vai sofrer Os cromossomos humanos podem ser caracterizados em relação à posição do centrômero e também quanto ao seu tamanho Observe abaixo a divisão em relação à posição do centrômero Figura 16 Metacêntrico apresenta um centrômero no meio da estrutura cromossomal e braços de comprimentos aproximadamente iguais Submetacêntrico centrômero um pouco deslocado do meio da estrutura cromossomal formando braços de comprimentos diferentes em que um é um pouco maior que o outro Acrocêntrico apresenta o centrômero muito deslocado do meio da estrutura cromossomal ao formar braços completamente diferentes em tamanho sendo um bem maior que o outro Já em relação ao tamanho os cromossomos humanos serão grandes médios pequenos e muito pequenos NUSSBAUM 2016 Figura 16 Cromossomo e Posição do Centrômero Fonte Shutterstock 2021 66 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA 242 Classificação Citogenética As palavras gregas karyon que significa nó e typos para forma dão origem à palavra karyotype ou cariótipo que define o conteúdo cromossomal de uma espécie Já a separação cromossomal com sua respectiva classificação é denominada cariograma ou ideograma Em 1956 muitos grupos de cientistas da área da Citogenética humana propuseram muitas classificações e sistemas de nomenclatura para o cariótipo humano Em função disso em 1960 um grupo de pesquisadores se reuniu em Denver Colorado USA e elaborou a primeira proposta de normatização da nomenclatura para os cromossomos mitóticos humanos Até a década de 1970 a classificação cromossomal humana se baseava somente no tamanho e na posição do centrômero Então a partir de 1970 com o desenvolvimento dos processos de coloração cromossomal que acabou resultando na visualização das bandas cromossômicas foi possível a caracterização morfológica de cada um dos 24 tipos de cromossomos humanos Houve um salto na caracterização e na análise muito mais precisa de todos os cromossomos metafásicos Para criar uma uniformização nos critérios de análise cromossomal várias conferências internacionais foram realizadas a fim de criar uma nomenclatura internacional comum an International System for Human Cytogenetic Nomenclature ISCN No sistema de classificação simplificado os cromossomos são divididos quanto ao tamanho em ordem decrescente de tamanho em sete grupos denominados A B C D E F e G conforme podemos observar no quadro abaixo Quadro 1 Grupos Cromossomais GRUPOS CARACTERÍSTICAS PARES A Grandes metacêntricos e submetacêntricos 1 2 3 B Grandes submetacêntricos 4 5 C Médios maioria submetacêntrico 6 7 8 9 10 11 12 X D Médios acrocêntricos 13 14 15 E Pequenos metacêntricos e submetacêntricos 16 17 18 F Muito pequenos metacêntricos 19 20 G Muito pequenos acrocêntricos 21 22 Y Fonte Elaborado pelo autor 2020 67 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA Segundo Nussbaum 2016 Grupo A são 3 pares grandes dois metacêntricos 1 e 3 e um submetacêntrico 2 Grupo B são dois pares grandes e submetacêntricos 4 e 5 Grupo C são 7 pares médios submetacêntricos mais o X de tamanho intermediário ao 6 e 7 6 7 8 9 10 11 12 e X Grupo D são 3 pares médios e acrocêntricos 13 14 e 15 Grupo E são 3 pares de cromossomos pequenos um metacêntrico 16 e dois submetacêntricos 17 e 18 Grupo F são dois pares muito pequenos e metacêntricos 19 e 20 Grupo G são dois pares muito pequenos e acrocêntricos 21 e 22 mais o Y A organização física do cariótipo era feita a partir de fotografias dos cromossomos as quais eram ampliadas e os cromossomos recortados para serem organizados aos pares em função da forma e tamanho em uma folha padronizada para este fim Atualmente utilizase a abordagem computadorizada que gera um mapa cromossômico rapidamente Além disso as análises cromossômicas se refinam cada vez mais à medida que a tecnologia avança tornandose muito mais descritivas e informativas a fim de se obter a análise cromossomal em um tempo muito menor com uma precisão muito maior 243 Cariótipo Técnica A metáfase da divisão mitótica compreende o momento ideal para se estudar os cromossomos humanos apoiandose no fato de que é nesta fase que os cromossomos apresentam seu grau máximo de espiralização Por isso os tecidos escolhidos para proceder à análise são os que apresentam alta taxa de multiplicação celular para os estudos in vivo ou podese proceder a indução in vitro da multiplicação celular Nos estudos in vivo optamse por células da Medula Esternal ou da Crista Ilíaca da camada de Malpighi da epiderme dos tumores sólidos bulbos capilares e pilosos Para os estudos in vitro os tecidos mais utilizados são fragmentos da pele biópsias 68 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA de tecidos de diferentes órgãos podendo ser usadas também células no líquido amniótico obtidas por punção BORGESOSÓRIO 2013 No entanto o material mais adequado para os estudos de análise cromossomal e construção de cariogramas são os linfócitos do sangue periférico os quais apresentam facilidade de coleta e fácil divisão in vitro desde que estimulados As técnicas mais modernas possibilitam que se analisem os cromossomos em prometáfase significando uma vantagem embora não estejam tão espiralizados pois se encontram mais estendidos o que favorece um maior grau de resolução das bandas obtidas por diferentes técnicas de bandeamento BORGESOSÓRIO 2013 A técnica mais utilizada é a cultura dos leucócitos in vitro chamada de microcultura a qual apresentará basicamente oito etapas segundo BorgesOsório 2013 1a Colher amostra do indivíduo em geral em torno de 5 mL de sangue em tubo contendo o anticoagulante heparina sódica importante 2a Algumas gotas da amostra sangue total serão adicionadas em frasco contendo o meio de cultura apropriado e que geralmente apresentará o soro proteico com mínimo de 10 de proteínas soro fetal bovino ou humano antibióticos em geral penicilina e estreptomicina e a fitoemoaglutinina estimulante mitótico que também ocasiona aglutinação das hemácias importante quando se trabalha com sangue total 3a Incubação do meio de cultura contendo a amostra a 37oC por 72 horas tempo ideal para se obter a taxa máxima da divisão mitótica dos leucócitos com um número considerado de células em metáfase 4a Passado o tempo estipulado será adicionada na cultura a colchicina permanecendo por mais duas horas na mesma temperatura A colchicina é um inibidor proteico que impede a formação do fuso acromático fundamental para a divisão celular Com isso é interrompido o processo na metáfase Vale ressaltar que a separação das cromátides irmãs ocorre mesmo na presença da colchicina 5a Após as duas horas o material será centrifugado por cerca de 5 minutos a 3600 rpm sendo o sobrenadante descartado Adicionarseá ao precipitado uma solução hipotônica em geral cloreto de potássio que ao penetrar na célula gerará um desbalanceamento osmótico ocasionando o inchaço celular e provocando o afastamento cromossomal entre si Esta solução será deixada em contato com a amostra com variação de 6 até 10 minutos 6a Passado o tempo determinado o material será novamente centrifugado 5 minutos3600 rpm e o sobrenadante mais uma vez descartado 7a Precipitado contendo as células a ele será adicionado o fixador sendo o 69 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA mais utilizado o Carnoy 31 três partes de etanol PA para uma parte de ácido acético glacial 8a Para finalizar o material será adicionado na lâmina em geral duas gotas da suspensão Vale lembrar que a lâmina precisa estar extremamente limpa inclinada e após aplicação deixar secando no ambiente Não esquecer da identificação da amostra na lâmina 244 Técnicas de Bandeamento Cromossomal Podemos observar na Figura 17 ainda que seja uma ilustração como seriam as bandas sendo que diferentes captações na quantidade de corante vão gerar maior ou menor intensidade na cor o que confere a cada cromossomo um padrão característico de bandas Figura 17 Idiograma Humano Fonte Shutterstock 2021 70 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA A seguir estudaremos os tipos de bandeamento existentes e qual a melhor opção em função do objetivo da investigação BANDEAMENTO Q O Bandeamento Q é uma técnica desenvolvida na década de 1970 em que se tornou possível a identificação do cromossomo individualmente visto que cada um apresenta um padrão característico de bandas representando um grande avanço para a Citogenética Esta técnica usa quinacrina mostarda disto se origina o nome da técnica uma substância fluorescente a qual criará bandas ou faixas com diferentes intensidades de fluorescência ao originar áreas brilhantes e opacas gerando desta forma o padrão característico O bandeamento Q é muito bom para análise do cromossomo sexual Y uma vez que ele se cora intensamente mesmo quando a célula está em interfase BANDEAMENTO G O Bandeamento G é bem mais simples que o Bandeamento Q pois não necessita de microscópio de fluorescência por isso tornandose a técnica mais utilizada na Citogenética No Bandeamento G os cromossomos sofrem um tratamento com Tripsina Protease para digestão das proteínas que interagem com os cromossomos Depois eles são corados com Giemsa daí o nome da técnica Nesta metodologia os cromossomos vão se corar de forma única ao longo da sua extensão com grau de graduação variado criandose um perfil de bandas claras e escuras sendo estas últimas correspondentes às bandas Q brilhantes As bandas Q escuras são regiões ricas em adenina e timina com poucos genes ativo já as bandas claras são regiões ricas em citosina e guanina e que apresentam muitas regiões gênicas ativas A maior parte das quebras ou dos rearranjos cromossomais acontecem nas regiões ricas em C e G correspondentes às bandas claras BANDEAMENTO R Este procedimento utiliza o mesmo corante do Bandeamento G o Giemsa mas para obtenção das bandas os cromossomos são tratados com calor a fim de se obter uma desnaturação controlada O Bandeamento R recebe este nome porque com o tratamento de calor as bandas se apresentarão de forma reversa R de reversa ao bandeamento Q e G É uma técnica a ser utilizada para as regiões cromossômicas as quais não se coram satisfatoriamente pelas técnicas de bandeamento G eou Q 71 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA BANDEAMENTO C O Bandeamento C após o tratamento com o composto hidróxido de sódio também usa o Giemsa É uma técnica utilizada para corar regiões específicas que neste caso são as regiões cromossomais Tais regiões específicas apresentam DNA altamente repetitivo e elas se encontram nas regiões dos centrômeros e outras que se localizam nos braços q longos dos cromossomos 1 9 e 16 sendo também observadas na região distal do cromossomo sexual Y A técnica recebe este nome porque vai corar a região de heterocromatina constitutiva C de constitutiva BANDEAMENTO NOR O Bandeamento NOR cora especificamente as regiões da organização nucleolar portanto marca especificamente as constrições secundárias cromossomais e os satélites Neste caso serão marcadas as regiões citadas dos cromossomos do grupo D e G exceto o Y deste grupo Vale relembrar que as regiões estão envolvidas na produção do ribossomo e de RNA ribossômico BANDEAMENTO T Técnica utilizada para marcar as regiões terminais cromossomais mais especificamente as regiões teloméricas T de telômeros BANDEAMENTO G DE ALTA RESOLUÇÃO BANDEAMENTO EM PROMETÁFASE Este bombeamento terá como base a metodologia de Bandeamento G ou R mas aplicável em prófase ou prometáfase quando os cromossomos estão ainda em um estado relativamente descondensado Isto viabiliza o aumento da sensibilidade da análise que ao invés de revelar cerca de 450 bandas permite a análise de 850 bandas ou mais Embora seja indicado quando se suspeita de anormalidade cromossômica sutil o método tem sido substituído pela análise de Microarranjos HIBRIDIZAÇÃO IN SITU POR FLUORESCÊNCIA FLUORESCENCE IN SITU HYBRIDIZATION FISH Esta técnica está enquadrada como Citogenética Molecular e representa um dos maiores avanços tecnológicos na Citogenética 72 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA Ela permite ampla aplicabilidade como detectar presença ou ausência cromossomal avaliação do número de cromossomos na célula localização de alguma sequência específica de DNA no cromossomo avaliação da estrutura cromossômica estudo cromossomal em interfase com a possibilidade de dar a resposta em tempo reduzido A chave da metodologia é a construção das chamadas sondas probe as quais são específicas para o objetivo da análise sendo compostas de nucleotídeos quimicamente modificados pela incorporação de moléculas fluorescentes de fita simples complementares à região de detecção Existem vários tipos dependendo do objetivo do que se busca a Sondas Centroméricas sequências de DNA repetitivo que estão localizadas no centrômero e região pericentromérica cromossomal sondas específicas do cromossomo em análise Ampla utilização para caracterização das aneuploidias mais comuns como as trissomias do 13 18 e do 21 b Sondas de Sequência Única Cromossomoespecíficas são sondas específicas para locus único muito utilizadas na identificação de deleções e duplicações chamadas submicroscópicas e que constituem as microdeleções Podem ser utilizadas em conjunto com as sondas Centroméricas específicas para os cromossomos 18 X e Y com o objetivo de um rápido diagnóstico prénatal de algumas alterações numéricas c Sondas Teloméricas permitem a análise em conjunto da região subtelomérica de cada cromossomo em uma única lâmina São utilizadas para identificar pequenas alterações subteloméricas que são pouco perceptíveis como se observa em deleções e translocações as quais acometem crianças com deficiência mental D Sondas para DNASatélite amplamente utilizadas na determinação do número de cópias de um determinado cromossomo e Sondas para Cromossomo Inteiro consistem em uma mistura de sondas na qual o cromossomo inteiro fica fluorescente em uma única hibridização Este tipo de procedimento é muito utilizado para a detecção de rearranjos complexos como os observados em pequenas translocações para identificação da origem de material cromossômico extra e também para identificação de cromossomo em anel 73 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA F Cariotipagem por Espectro Multicolorido esta técnica usa um conjunto de sondas que vai abranger todo o conteúdo cromossômico humano também chamado de Cariótipo Espectral cada par de cromossomos homólogos por coloração única sendo a análise do resultado computacional É utilizada para detecção de rearranjos cromossômicos constitucionais observados em indivíduos com anormalidades no desenvolvimento e também em anormalidades adquiridas como no câncer 25 TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE A Genética sempre se focou no seu propósito de estudar genes genomas estruturas ligadas à hereditariedade Com Mendel foi possível entender as questões de distribuição de caracteres hereditários com as proporções fenotípicas em cruzamentos controlados e mais uma infinidade de conceitos e correlações Embora tenha sido fácil isolar o DNA de células bem no seu início o procedimento obtinha um aglomerado de material e não parecia cabível à época isolar um gene muito menos transferir este conteúdo de um organismo vivo para outro diferente A Tecnologia do DNA Recombinante desenvolveu e forneceu as ferramentas para que grandes saltos ocorressem na área da Genética propiciando o desenvolvimento do que inicialmente foi denominada de Engenharia Genética e atualmente é tratada como Biologia Molecular O passo inicial aconteceu em 1973 na Universidade de Stanford e na Escola de Medicina da Universidade da Califórnia onde um grupo de cientistas conduziu seus experimentos que culminaram na produção dos primeiros organismos possuidores de DNA recombinante Ao inserirem em um plasmídeo um segmento de DNA foi criada a primeira molécula do que se determinou como DNA recombinante daí a derivação do nome da tecnologia que surgia As técnicas desenvolvidas permitiram o isolamento e purificação de sequências de DNA de interesse a sua clonagem e muito importante sua manipulação in vitro A partir disso as moléculas do DNA recombinante podem ser inseridas em organismos diversos inclusive induzindo a produção muitas vezes de seu produto gênico em células que antes não possuíam esta capacidade BORGESOSÓRIO 2013 74 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA Os processos biotecnológicos são aqueles que lançam mão de organismos vivos para o desenvolvimento de produto eou processos de melhoria de vida seja do ser humano ou outro organismo vivo É importante frisar que a Biotecnologia não passou a existir com o advento da tecnologia do DNA recombinante pois é um processo antigo que remonta os tempos das fermentações com a produção de cerveja pelos egípcios sendo os processos de fabricação de iogurte vinho queijo produções igualmente biotecnológicas A Biotecnologia evoluiu rapidamente com a incorporação da capacidade de manipulação genética o DNA recombinante sendo inúmeras aplicações na saúde energia agropecuária indústria alimentícia indústria química etc Na área da saúde o desenvolvimento de testes diagnóstico consequentemente o auxílio nos tratamentos e na conduta terapêutica o avanço tecnológico permite a análise detalhada de genes normais e suas formas mutantes com capacidade de associar as mutações como desenvolvimento clínico do paciente 251 Clonagem Molecular Antes de prosseguirmos é necessário frisar que algumas das ferramentas citadas aqui serão amplamente descritas à medida que o conteúdo do caderno for sendo desenvolvido Na clonagem molecular uma das primeiras etapas será isolar o segmento de DNA de interesse e colocar este fragmento em um vetor de clonagem sendo o agente transferidor do material genético para outro organismo Em geral são utilizados os plasmídeos podendo ser também o bacteriófago este vetor Após esta transferência o microrganismo que recebeu o material será cultivado e a intenção é que possam ser produzidas múltiplas cópias por célula do material transferido permitindose o isolamento de uma forma pura do material de interesse para posterior utilização SPEROTTO 2014 Segundo BorgesOsório 2013 para o preparo da inserção do fragmento de DNA a ser clonado no vetor é necessário clivar este e o vetor plasmidial com a chamada enzima de restrição Elas são enzimas chamadas de nucleases as quais cortam ácidos nucleicos Quando se corta tanto o fragmento de DNA que vai ser clonado quanto o vetor plasmidial 75 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA criamse extremidades que se encaixam como uma peça de lego fazendo com que o material passe a ser parte integrante do vetor plasmidial Assim ocorrerá a hibridização e a DNA Ligase fará a conexão entre o fragmento de DNA e o vetor plasmidial como pode ser visto na Figura 18 Figura 18 Clonagem Molecular 1 Vetor de Clonagem e Fragmento de Dna 2 Extremidades do Vetor e do Fragmento de Dna são unidos pela Dna Ligase 3 Dna Recombinante Fonte Shutterstock 2021 Quando esta inserção é feita naturalmente surgirá a pergunta O fragmento foi inserido no vetor plasmidial A resposta será obtida ao se fazer um gel de agarose que permite verificar o tamanho de moléculas de ácidos nucleicos neste caso mais especificamente do DNA Quando o procedimento começa já se sabe o tamanho de cada peça separadamente Ao correr o gel de agarose as amostras correrão no gel separadamente a saber A fragmento de DNA B vetor plasmidial e C suposto vetor plasmidial com fragmento de DNA inserido O tamanho da amostra na qual se quer confirmar o sucesso do processo tem que ser o somatório de A B Os procedimentos de eletroforese serão descritos adiante mas neste caso como demonstra a Figura 19 os fragmentos mais próximos da origem são os maiores Podemos calcular o tamanho de cada molécula em função da migração no gel porque junto com a amostra teremos o que se chama de Padrão de Peso Molecular 76 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA Figura 19 Eletroforese em Gel de Agarose 1 Padrão de Peso Molecular Fonte Shutterstock 2021 Para relembrar os plasmídeos são moléculas de DNA circular dupla fita que possuem os elementos básicos para a replicação independente Em geral também portam um gene de resistência a algum antibiótico podendo variar em tamanho normalmente apresentando mais de uma cópia por célula Quando se constrói um vetor plasmidial para ser utilizado nas clonagens algumas características são obrigatórias e outras desejáveis conforme Griffiths 2001 a Possuir o gene ORI Origem de Replicação que permite a replicação plasmidial independente da replicação cromossomal da célula hospedeira b Um ou mais genes que conferem resistência a um antibiótico funcionando como um marcador seletivo para confirmar se as células receberam o plasmídeo de interesse Isso será possível ao se usar uma cepa sensível ao antibiótico em questão se crescerem as colônias significa que o plasmídeo foi absorvido e as células antes sensíveis transformamse em resistentes porque o plasmídeo passa a fazer parte da célula e confere esta resistência Na figura estão representados por ampR ampicilina e tetR tetraciclina c Apresentar o que se chama de múltiplos sítios de clonagem MSC ou seja regiões que são passíveis de serem cortadas por mais de um tipo de enzima de restrição permitindose uma escolha adequada para o local de inserção do fragmento de DNA que será clonado Na figura compreendem os pontos de corte por Pst1 PvuI EcoR1 ClaI HindIII BamH1 Sal1 PuvuII 77 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA d Se a intenção da clonagem for criar uma célula que precisará expressar o produto do gene o qual foi inserido no vetor o plasmídeo vai necessitar de um promotor ou seja uma região que regulará e promoverá a transcrição do gene com consequente formação do RNAm correspondente e posteriormente a proteína de interesse Estas características estão presentes em um plasmídeo muito usado o pBR322 como se visualiza na figura abaixo Figura 20 Vetor Plasmidial Fonte Shutterstock 2021 252 Transformação Bacteriana Depois que o vetor recebe fragmento de DNA de interesse e a clonagem é bem sucedida esta molécula recombinante será transportada para o interior da célula hospedeira a qual será preparada para receber este material exógeno O processo de entrada deste material recebe o nome de Transformação cujo método clássico de preparo de células competentes vai se basear na exposição das células a uma solução fria de cloreto de cálcio ou outro íon divalente cloreto de lítio ou magnésio seguido de um choque término de curta duração o que provoca a formação de poros uma vez que em geral a membrana celular bacteriana não é permeável do DNA 78 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA O método da eletroporação é extremamente eficiente para a transformação celular com DNA plasmidial Ele consiste inicialmente na preparação celular para se tornarem competentes a este recebimento As células serão submetidas à alta voltagem e esta vai ocasionar uma desestabilização da membrana externa com a consequente formação de poros possibilitando a entrada do DNA exógeno Para a transformação por eletroporação um equipamento específico será necessário o Eletroporador Esta metodologia permite a utilização para vários tipos celulares bactérias Gram negativas e positivas leveduras fungos filamentosos células vegetais e animais Além disso o equipamento sempre será ajustado para cada tipo celular levando em consideração parâmetros como capacitância intensidade e duração do pulso elétrico 26 BIOFÁRMACOS A Biotecnologia permite a produção de muitos compostos que são utilizados nas mais diversas áreas Entre estes compostos destacamse os chamados Biofármacos extraídos de seres vivos a partir de microrganismos animais e plantas que foram modificados geneticamente para este propósito A ANVISA 2020 define medicamentos biológicos como moléculas complexas de alto peso molecular obtidas a partir de fluidos biológicos tecidos de origem animal ou procedimentos biotecnológicos por meio de manipulação ou inserção de outro material genético tecnologia do DNA recombinante ou alteração dos genes que ocorre devido à irradiação produtos químicos ou seleção forçada A necessidade de regulamentação do que seria medicamento biológico e como os classificar fez com que a ANVISA estabelecesse limites de abrangência nas normas que regulamentam os registros desta categoria medicamentosa Com isso foi criada a RDC no 55 de 2010 Segundo a RDC nº 552010 são produtos biológicos I Vacinas II Soros III hemoderivados IV Biomedicamentos classificados em medicamentos obtidos a partir de 79 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA fluidos biológicos ou de tecidos de origem animal e medicamentos obtidos por procedimentos biotecnológicos V Anticorpos monoclonais VI Medicamentos contendo microrganismos vivos atenuados ou mortos 261 Hemoderivados Utilizase o plasma sanguíneo para a fabricação dos medicamentos sendo eles obtidos através da técnica de fracionamento que é um conjunto de métodos e técnicas laboratoriais básicas em que após a homogeneização utilizase de processos químicos e ou físicos neste caso a partir do plasma humano Atualmente existem muitas proteínas utilizadas para fins terapêuticos as quais usarão a técnica de fracionamento e purificação de obtenção dos hemoderivados Fator VIII de Coagulação FVIII Fator IX de Coagulação FIX Imunoglobulina Complexo Protrombínico Fator devon Willebrand FvW 262 Terapia Celular A Terapia Celular consiste na introdução de novas células nos tecidos do indivíduo sendo elas empregadas no tratamento de determinada doença ao se basear nas propriedades regenerativas das células tronco ou em outros efeitos A Terapia Celular é empregada no tratamento de leucemias 263 Terapia Genética A Terapia Genética é o processo de introdução de genes terapêuticos nas células 80 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA e tecidos as chamadas Vacinas DNA ou então Vacinas Gênicas As pesquisas levam à localização e clonagem dos genes para os antígenos porém nestes casos diferente das vacinas recombinantes o DNA é injetado diretamente no músculo do indivíduo ou do animal que será vacinado e isto espalha o DNA nas células musculares 264 Anticorpos Monoclonais Para produzir Anticorpo Monoclonal é fundamental a purificação do antígeno para o qual se deseja o anticorpo Podem ser utilizadas as técnicas de cromatografia e eletroforese O animal será inicialmente imunizado com o antígeno de interesse Em geral utilizase principalmente o camundongo mas também pode se valer de coelho cavalo etc A introdução do antígeno é acompanhada com substâncias que promovem a ativação do sistema imune do animal Passados alguns dias o sangue do animal inoculado é retirado e com posterior centrifugação da amostra separase o plasma sanguíneo que é onde se encontram os anticorpos Atualmente existe o desenvolvimento de anticorpos monoclonais dirigidos a praticamente qualquer alvo molecular com produção de ligações com alta afinidade e especificidade Hoje muitas dezenas de anticorpos monoclonais estão disponíveis para o tratamento de diversas enfermidades 265 Vacinas O sistema de vacinas apresentou enorme avanço com a Biotecnologia em função das descobertas de novos antígenos adjuvantes vetores novos sistemas de entrega etc As primeiras vacinas se baseavam em patógenos bactérias ou vírus atenuados ou inativos e em alguns casos a eficiência nem sempre era uniforme e constante As vacinas de primeira geração trabalham com os agentes patogênicos os quais 81 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA são atenuados ou inativados As de segunda geração promovem a indução de anticorpos focados em alvo único como uma toxina que pode ser a responsável pela doença Já nas de terceira geração chamadas de Vacina DNA ou Vacina Gênica como descrito anteriormente o DNA é injetado no músculo e as células musculares passam a expressar os antígenos levando ao desencadeamento da resposta imunológica que se deseja Nas vacinas Recombinantes o indivíduo será inoculado com o gene responsável pela codificação de uma proteína típica do agente agressor o que acarretará a produção pelo organismo da proteína exógena estimulando o sistema imune 266 DNA Recombinante Esta tecnologia em biofármacos consiste em linhas gerais no isolamento do DNA que interessa e clonagem do mesmo Após esta clonagem haverá um processo de indução de transcrição para posterior produção da molécula alvo Assim a primeira abordagem vai trabalhar o sucesso da inserção deste DNA alvo no vetor de clonagem e consequentemente será formado o DNA recombinante Em uma segunda etapa a molécula recombinante será introduzida em uma célula hospedeira Em geral escolhese a bactéria Escherichia coli a qual é de fácil manipulação e crescimento produzindo muitas colônias com muitas bactérias contendo enorme quantidade do DNA recombinante Esta introdução se dá através do processo de transformação e posteriormente o microrganismo será induzido para a produção do produto gênico Os exemplos clássicos dos chamados medicamentos recombinantes são Insulina Hormônio do Crescimento Citocinas interferonas a eritropoietina o fator de crescimento de granulócitos e as interleucinas Heparinas Trombolíticos Fator anti hemofílico Anticorpos monoclonais 82 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA 27 PURIFICAÇÃO DE MATERIAL GENÉTICO DE CÉLULAS VIVAS Agora que foram vistos os principais processos biotecnológicos e a tecnologia do DNA recombinante começaremos a entender os processos de obtenção deste material genético Importante destacar que muito do que será descrito vai fazer parte da metodologia e rotina das indústrias de biotecnologia e também de laboratórios de análises clínicas mais especificamente no ramo de Biologia Molecular O trabalho com material genético necessita da preparação de ao menos quatro tipos diferentes de amostras de ácido nucleico o DNA celular total RNA DNA Plasmidial e DNA de Fago O DNA celular total pode ser obtido a partir de uma cultura de células bacterianas animais ou vegetais ou qualquer organismo vivo que seja utilizado para estudo Para o RNA serão observadas inúmeras etapas em comum e em determinado momento um tratamento diferenciado permitirá a separação do RNA do restante de DNA Já a obtenção do DNA Plasmidial necessita de um grau de pureza e vai apresentar etapas comuns também com a obtenção de DNA total No entanto ao final será explorada a diferença de tamanho e configuração do DNA plasmidial e DNA cromossômico A purificação do DNA de bacteriófago em geral preparase de partículas virais necessitando de técnicas especiais de remoção do capsídeo viral Cabe ressaltar que nosso foco será descrever os elementos principais de cada etapa e como estes vão agir em função do objetivo proposto em cada uma das etapas Podemos nos deparar com kits comerciais vendidos com nomes específicos pelas indústrias especializadas mas todos os componentes ou seus derivados aqui abordados farão parte do conteúdo básico de cada um dos kits 271 Preparação de Extrato Celular De modo geral as indústrias trabalham bastante com bactérias principalmente Escherichia coli Neste caso será preciso crescer o microrganismo para obtenção do 83 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA extrato e o mesmo vale quando se trata de uma indústria de biotecnologia que trabalhará com célula animal eou vegetal Já quando estamos tratando de um Laboratório de Análises Clínicas em Biologia Molecular o próprio paciente é o meio de cultura vivo A amostra será colhida podendo ser de células do próprio indivíduo ou de locais onde possam estar presentes os microrganismos a serem pesquisados A multiplicação bacteriana pode ser obtida sem maiores dificuldades e para isso a escolha do meio de cultura é fundamental Muito sobre meio de cultura inóculo e outros conceitos foi abordado na disciplina de microbiologia não sendo destaque neste caderno Como sabemos o meio de cultura fornecerá os nutrientes essenciais em uma concentração os quais permitirão o desenvolvimento e divisão apropriados Em geral a opção é o meio líquido e este pode ser o meio definido ou indefinido ou complexo Como exemplo de meio definido temos o M9 Por ter todos os componentes conhecidos ele é classificado como tal uma mistura de nutrientes inorgânicos para prover elementos essenciais como nitrogênio magnésio e cálcio além de glicose como fonte de carbono e energia Caso seja necessário é possível suplementar o meio M9 O meio definido é utilizado quando se precisa de um crescimento extremamente controlado do microrganismo O meio indefinido complexo mais utilizado é o LuriaBertani LB para bactérias ou o YPD para levedura Significa que a identidade bem como a quantidade precisa dos seus componentes não são conhecidas porém fornecem tudo de que o microrganismo precisa para crescer e se desenvolver A triptona e o extrato de levedura que são misturas complexas onde a triptona no YPD é a peptona vai suprir o microrganismo com aminoácidos e pequenos peptídeos e o extrato de levedura preparação de leveduras secas parcialmente digeridas supre a demanda de nitrogênio de glicídios e todos os nutrientes orgânicos e inorgânicos O microrganismo crescerá em geral a 37oC 28oC para leveduras com aeração normalmente de 150 a 250 rpm e posteriormente será medida a densidade para aferição da quantidade de célula que se obtém após o período determinado de cultivo Para o monitoramento a densidade óptica DO será feita a 600nm em espectrofotômetro simples Neste comprimento de onda uma unidade de DO corresponde a aproximadamente 08 x 109 célulasmL No preparo do extrato celular será necessário separar as células do meio de cultura Para tanto realizase uma centrifugação em geral em velocidade moderada sendo o sobrenadante dispensado depois do processo Neste caso o precipitado são as células as quais serão ressuspendidas em um volume bem menor do que o volume do meio de cultura 84 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA Para o preparo do extrato celular precisamos lembrar que a bactéria é envolvida pela membrana plasmática e por uma parede celular rígida sendo que algumas bactérias apresentam ainda uma segunda membrana externa e todas estas barreiras precisam ser rompidas para a liberação do material de interesse As células podem ser rompidas por métodos físicos através de forças mecânicas com o uso do dounce por exemplo e existem também os métodos químicos os quais se basearão na lise através da exposição a agentes químicos que afetam a integridade das barreiras citadas Quando o método químico for utilizado haverá a necessidade de um agente que ataque a parede celular Neste caso é comum utilizar uma mistura com lisozima uma proteína que destrói os proteoglicanos presentes na parede celular bacteriana e Tetracetato de Etilenodiamina EDTA um quelante de Mg2 o qual ajuda a desestabilizar a parede celular existindo aqui uma função adicional Ao inutilizar o Mg2 impedese que nucleases ataquem os ácidos nucleicos a serem obtidos no processo Este tratamento anterior pode romper por completo as células mas é recomendável o uso de um detergente como o Dodecilsulfato de Sódio SDS a fim de auxiliar na remoção completa dos lipídeos e consequentemente rompimento de todo o sistema membranar Depois da lise celular será fundamental a remoção dos resíduos celulares insolúveis obtida através de uma centrifugação mais vigorosa em alta velocidade Os resíduos celulares e moléculas grandes se movem e fazem parte do precipitado com a manutenção no sobrenadante de uma mistura basicamente de DNA RNA e proteínas Para as células animais bem como leveduras o EDTA será utilizado junto com o SDS e se a intenção for trabalhar apenas com DNA seja cromossômico ou plasmidial devese tratar a amostra com RNAse no momento final porém nem sempre é necessário para o sucesso na execução dos exames clínicos 272 Purificação de DNA Total e RNA a partir de Extrato Celular Como vimos na fase anterior a etapa encerra com a obtenção de um sobrenadante contendo DNA RNA e proteínas Nesta situação o primeiro foco será a remoção das proteínas etapa conhecida como desproteinização 85 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA O método padrão de desproteinizar é a utilização da mistura de fenol clorofórmio álcool isoamílico 25241 Estes solventes orgânicos precipitam as proteínas mas mantêm em solução os ácidos nucleicos DNA e RNA O fenol é um agente desnaturante e junto com o clorofórmio auxilia nesta desproteinização fundamentado na propriedade proteica hidrófoba que vai apresentar afinidade pelos solventes orgânicos O fenol empregado nesta solução possui pH alcalino 80 porque do contrário o DNA vai se deslocar para o que se chama interface junto com as proteínas impedindo sua purificação ou para a fase orgânica inferior junto com os solventes impedindo igualmente sua purificação O clorofórmio possui também a função de remoção do fenol residual e o álcool isoamílico evita a formação de espuma facilitando a separação da fase orgânica e da fase aquosa Entre estas duas fases existe uma camada a interface onde vão se localizar todas as proteínas desnaturadas pelo fenol e clorofórmio SPEROTTO 2014 Como se observa na Figura 21 na chamada fase aquosa superior transparente temos o DNA e pequenos RNAs na interface as proteínas e peptídeos e na fase orgânica inferior amarelada os solventes e moléculas maiores de RNA Figura 21 Desproteinização com Fenol 1 Fase Aquosa Dna e Pequenos Rnas 2 Interface Proteínas e Peptídeos 3 Fase Orgânica Solventes Orgânicos e Rnas Mensageiros Maiores Fonte Elaborada pelo autor 2021 Descrita a solução seus componentes e função a mesma é adicionada à amostra valendo aqui uma importante observação existem protocolos que recomendam centrifugar 10 minutos em 1700 g outros recomendam agitação vigorosa no vórtex e ainda tem uma terceira opção que é verter o tubo gentilmente sem agitação Depois deste procedimento a fase superior aquosa será removida com muito cuidado para 86 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA evitar levar qualquer conteúdo que se encontra na interface e na fase orgânica Para tal devese introduzir a ponteira da pipeta automática próximo da interface sem no entanto tocar a mesma SPEROTTO 2014 Caso exista na amostra um alto teor proteico não é recomendável fazer extrações sucessivas com o fenol pois podem ocorrer quebras da molécula de DNA Nestes casos devese fazer antes do fenol clorofórmio um tratamento com uma protease Pronase ou Proteinase K para auxiliar a remoção do conteúdo proteico sendo indesejável o RNA pode ser removido utilizandose antes da desproteinização a RNAse para tal objetivo 2721 Para o RNA Para a obtenção de uma amostra de RNA seguirseão todos os passos No entanto será utilizada uma solução de Trizol que nada mais é do que o fenol clorofórmio acrescido de Tiocianato de Guanidina responsável pela queda do pH Como vimos anteriormente com pH ácido o RNA se torna solúvel enquanto as outras macromoléculas como DNA e proteínas são menos solúveis permanecendo o RNA total na fase aquosa superior transparente e o DNA com as proteínas na interface e até na fase orgânica inferior rosada como observado na Figura 22 Figura 22 Desproteinização com Trizol 1 Fase Aquosa Rna 2 Interface Dna Proteínas e Peptídeos 3 Fase Orgânica Solventes Orgânicos e Proteínas Fonte Elaborada pelo autor 2021 87 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA 2722 Concentração da Amostra de Ácidos Nucleicos Mesmo uma preparação feita com todos os protocolos seguidos à risca pode culminar em uma solução de ácido nucleica diluída o que ocasionará a necessidade de concentração da amostra ou seja precipitar o ácido nucleico para ressuspensão em água ou solução tampão O método corriqueiramente utilizado é a precipitação com etanol absoluto gelado Será necessária a solução de um sal especificamente cátions monovalentes como o sódio Na associado ao etanol absoluto estocado a 20o C O etanol vai se depositar nas moléculas de ácidos nucleicos induzindo uma transição estrutural ao fazer com que se agreguem com consequente precipitação Em seguida a amostra será precipitada em velocidade elevada 1700g 2 min o sobrenadante descartado e o precipitado ressuspenso agora em etanol 70 para remoção dos resíduos do sal utilizado gerando nova precipitação e nova centrifugação nas mesmas condições descritas novo descarte de sobrenadante Devese deixar o precipitado pellet secar em temperatura ambiente para posteriormente ressuspender a amostra em água MiliQ ou em tampão como o Tris EDTA TE 273 Preparação de DNA Plasmidial Quando se parte para a purificação de plasmídeos a partir de culturas bacterianas a estratégia utilizada é a mesma para preparo do DNA total ou seja obtenção do extrato celular ocorrendo a desproteinização como descrito Quando o objetivo é o DNA plasmidial haverá necessidade de separar este do DNA cromossômico uma vez que em um processo biotecnológico se o foco é o plasmidial qualquer DNA cromossômico pode ser considerado como material contaminante Para este fim serão exploradas as diferenças físicas entre estes dois tipos de DNA A maior parte dos plasmídeos apresenta apenas 8 do tamanho de DNA cromossomal de Escherichia coli mas podemos observar plasmídeos bem menores também Então técnicas que explorem esta diferença de tamanho podem ser utilizadas 88 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA porém o mais eficiente é explorar outra característica física que é a conformação molecular 2731 Separação com Base no Tamanho Este fracionamento pelo tamanho será executado correspondendo à fase de preparo de extrato celular A separação com base no tamanho será iniciada pelo rompimento celular o qual deve ser brando a fim de não gerar muita quebra cromossomal formando fragmentos do mesmo tamanho do DNA plasmidial o que poderia atrapalhar a separação entre estes dois tipos da amostra cromossômico e plasmidial As células serão lisadas através da utilização de uma solução de EDTA para quelar o magnésio e lisozima na presença de sacarose uma vez que os poros gerados pela lisozima ocasionarão um inchaço da célula com a entrada da sacarose Para rompimento brando devese utilizar um detergente não iônico o Triton X100 desfazendo o envoltório membranar de forma branda não ocasionando inúmeras quebras no DNA cromossômico Após o rompimento a amostra será centrifugada como já foi descrito em item anterior e o precipitado vai conter restos celulares e grande quantidade de DNA cromossômico que estava aderido à membrana bacteriana No sobrenadante haverá grande concentração de DNA plasmidial O problema é que esta amostra ainda vai conter algum DNA cromossômico o que não torna este fracionamento com base no tamanho definitivo 2732 Separação com Base na Conformação Antes de descrever a metodologia devemos frisar que o plasmídeo apresenta duas formas conformacionais sendo a mais presente a Conformação Superenrolada que ocorrerá com ambas as fitas polinucleotídeas intactas e recebe o nome técnico de DNA 89 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA Circular Covalentemente Fechado Quando uma das fitas é rompida a dupla hélice retorna a um estado mais relaxado com o plasmídeo adotando a conformação aberta tecnicamente chamada de DNA Circular Aberta e esta conformação está em clara minoria se comparada à Conformação Fechada a Desnaturação Alcalina Existe uma estreita faixa de Ph na qual o DNA de Conformação Aberta é desnaturado enquanto o plasmídeo de Conformação Fechada não é Será adicionada na amostra de extrato celular uma solução de hidróxido de sódio com pH ajustado para 120 a 125 com isso desfazendo as ligações hidrogênio do DNA Total e do DNA Plasmidial de Conformação Aberta mas a dupla fita do DNA Plasmidial de Conformação Fechada vai permanecer íntegra Depois será adicionada uma solução ácida o que vai acarretar uma completa agregação aleatória das fitas desnaturadas formando uma massa desorganizada que vai ser facilmente separada do DNA Plasmidial de Conformação Fechada através de uma centrifugação em velocidade elevada O sobrenadante contendo DNA plasmidial será coletado e posteriormente concentrado conforme já foi descrito b Centrifugação em Gradiente Esta técnica promoverá um gradiente de densidade através da utilização de Cloreto de Césio CsCl a uma velocidade muito elevada uma vez que a força centrífuga muito elevada puxa os íons de Césio e do Cloreto em direção ao fundo do tubo A migração acontece por difusão e se estabelece um gradiente com maiores densidades de CsCl em direção ao fundo do tubo fazendo com que as moléculas orgânicas se localizem em faixas distintas do tubo de acordo com a concentração de CsCl em cada faixa da solução Por exemplo o DNA possui uma densidade de flutuação de cerca de 17 gcm3 e ele migrará até à faixa da solução onde a concentração de CsCl é a mesma 17 gcm3 Com esta metodologia é possível evitar a desproteinização ou separar o que resta de conteúdo proteico como DNA DNA plasmidial RNA e proteína 90 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA 274 Preparação de DNA de Bacteriófagos As partículas do fago são muito pequenas e precisam ser sedimentadas por centrifugação em velocidades bastante elevadas ultracentrifugação por isso a coleta dos fagos é feita por precipitação com polietilenoglicol PEG Este composto é polimérico com uma cadeia extremamente longa Na presença de um sal a água é absorvida fazendo com que as macromoléculas como os fagos precipitem Após a precipitação aí sim o material poderá ser coletado através de uma ultracentrifugação e ressuspenso em um volume reduzido A desproteinização do precipitado de PEG pode ser o suficiente porém se a amostra apresentar quantidades de resíduos bacterianos vindos da célula hospedeira incluindo DNA bacteriano é possível promover a separação dos contaminantes ao se utilizar a centrifugação em gradiente com CsCl Em geral as partículas de bacteriófagos geram a banda característica em uma densidade de 145150 gcm3 e com isso as partículas do fago podem ser coletadas com uma micropipeta nesta faixa de concentração A remoção do CsCl é feita por diálise resultando em uma amostra pura de fagos e promovendo posterior extração do DNA com fenol clorofórmio ou com o uso de proteases conforme já estudado 275 Medição da Concentração de DNA Para as indústrias de Biotecnologia a quantificação do DNA será fundamental para o prosseguimento de etapas na obtenção de produto final o qual será comercializado ou mesmo nas pesquisas para a obtenção destes A concentração de uma solução contendo DNA poderá ser aferida através de espectrofotometria de absorbância com a utilização de radiação ultravioleta UV uma vez que a absorção desta é diretamente proporcional à quantidade de DNA na amostra Via de regra a absorbância será medida em um comprimento de onda a 260 nm cuja leitura de 10 unidade a 260 nm A260 corresponde a 50µg de DNA dupla fita por mL Outra aplicação da absorbância de UV será empregada para verificar a pureza de 91 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA uma preparação de DNA fundamental também para a indústria O aparelho fará a razão das absorbâncias a 260 nm e a 280 nm A260 A280 e esta razão precisa ser de 18 pois razões menores indicam que a amostra está com contaminante proteico ou com fenol Na Figura 23 podemos observar resumidamente o passo a passo para chegar à obtenção da amostra purificada Figura 23 Preparação de DNA 1 Crescimento Celular 2 Separação das Células do Meio de Crescimento 3 Obtenção do Extrato Celu lar 4 Purificação do ácido nucleico5 Concentração da amostra final Fonte Shutterstock 2021 92 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA CONSIDERAÇÕES FINAIS Tendo finalizado a Unidade 2 metade do caminho foi percorrido Iniciamos com um marco importantíssimo o Projeto Genoma Humano que agregou dados incontáveis e ainda nos deixou muitos questionamentos além da certeza de que muitos estudos e novas frentes de conhecimento foram abertos com esta conquista Do estudo do PGH conectamonos com a Bioinformática ferramenta das mais importantes que se tornou imprescindível à área da saúde bem como à área biotecnológica Dando prosseguimento à unidade estudamos o cariótipo e as metodologias para confecção do Cariograma ferramenta extremamente importante para a conduta dos diversos profissionais da saúde e um componente fundamental para embasamento do Aconselhamento Genético Os últimos 4 tópicos da segunda unidade estão extremamente vinculados como a Tecnologia do DNA Recombinante em que foi possível traçarmos um histórico do surgimento da tecnologia e toda a sua aplicação e importância ao destacarmos a função e os principais biofármacos criados e suportados por ela Para fecharmos a Unidade 2 vimos as principais etapas e elementos necessários para se obter o material genético fundamental a inúmeros procedimentos com destaque de cada componente e sua função neste processo 93 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA EXERCÍCIO FINAL 01 CONHECIMENTO O Projeto Genoma Humano PGH foi um marco na Genética e abriu uma fronteira grande de conhecimento que será ainda muito explorado pois os dados mostram que muitas das sequências ainda não foram caracterizadas ou entendidas Sobre o PGH assinale a alternativa falsa a O PGH teve início como um consórcio de instituições americanas e diversos laboratórios espalhados pelo mundo b Um fato extremamente importante foi a localização de regiões que apresentam apenas uma base de diferença em meio às sequências conservadas os SNPs c Os dados adquiridos também permitiram o desenvolvimento de testes e análises para diagnósticos prénatal para indivíduos présintomáticos d O PGH auxiliou em demonstrar que o transcrito primário é sempre processado de uma única maneira não permitindo diferentes formas da mesma proteína e A Declaração dos Direitos Humanos bem como a Declaração Universal do Genoma Humano determinou que o genoma humano era patrimônio da Humanidade 02 CONHECIMENTO O cariótipo será definido como o conjunto de cromossomos contidos nas células de um organismo Do ponto de vista morfológico os cromossomos são identificados diferenciados e classificados levando em conta o tamanho e localização do centrômero Em função do conhecimento adquirido ao longo desta unidade analise as afirmativas abaixo I No cromossomo acrocêntrico o centrômero está um pouco deslocado do meio da estrutura cromossomal com isso se formam braços ligeiramente diferentes em tamanho II No sistema de classificação cromossomal humano o grupo C é o mais numeroso e inclui entre vários autossomos também o cromossomo X III Atualmente as tecnologias mais modernas possibilitam que se analisem os cromossomos em anáfase o que pode significar uma vantagem IV O fixador mais utilizado contém etanol PA e ácido acético glacial V A técnica de bandeamento Q é muito utilizada para analisar o cromossomo sexual Y isso porque este se cora intensamente mesmo quando a célula está em interfase 94 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA VI O bandeamento NOR cora especificamente as regiões da organização nucleolar VII O FISH está enquadrado como Citogenética molecular representando um dos maiores avanços tecnológicos na Citogenética Assinale a alternativa correta a São falsas apenas as afirmativas I e IV b São falsas somente as afirmativas I e III c São verdadeiras somente as afirmativas II III IV V e VII d É falsa apenas a afirmativa VII e São verdadeiras somente as afirmativas II III e VI 03 CONHECIMENTO O preparo de material genético através da sua purificação é de suma importância para que se obtenha material que permita a destinação correta seja ela material para algum exame laboratorial por biologia molecular ou para a utilização em algum processo biotecnológico que vise à obtenção de um produto final Em função do conhecimento adquirido ao longo desta unidade analise as afirmativas abaixo I O método químico utilizado no preparo do extrato celular usa vários compostos dentre eles o Tetracetato de Etilenodiamina EDTA que funciona como quelante de Mg2 II O meio indefinido é utilizado quando se precisa de um crescimento extremamente controlado do microrganismo III No processo de purificação de RNA um dos diferenciais é a utilização do Tiocianato de Guanidina que tem como função a queda do pH da solução IV A separação plasmidial baseada no tamanho vai utilizar a técnica de desnaturação alcalina V Na desproteinização o principal componente é o fenol em pH alcalino VI Na fase de desproteinização a amostra de DNA vai se encontrar na fase aquosa É correto o que se afirma em a São falsas apenas as afirmativas II e IV b São falsas somente as afirmativas II e III c São verdadeiras somente as afirmativas II III IV e V d É falsa apenas a afirmativa IV e São verdadeiras somente as afirmativas I II III V e VI 95 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA REFERÊNCIAS ANVISA Definição de Medicamentos Biológicos Disponível em httpswwwgov branvisaptbracessoainformacaoperguntasfrequentesmedicamentosconceitose definicoes Acesso em 27 de Dezembro de 2020 ANVISA RDC no 552010 Disponível em httpbvsmssaudegovbrbvssaudelegis anvisa2010res005516122010html Acesso em 27 de Dezembro de 2020 BORGESOSÓRIO Maria Regina Lucena ROBINSON Wanyce Miriam Genética Humana 3ª ed Porto Alegre ArtMed 2013 BORONI M ZONARI A OLIVEIRA C R ALKATIB K CRUZ E BRACE L E CARVALHO J L Highly accurate SkinSpecific methylome analysis algorithm as a platform to screen and validate therapeutics for healthy aging Clin Epigenetics 12 1 105 2020 GRIFFITHS A J F GELBART W M MILLER D T LEWONTIN R C Genética Moderna 1ª Ed Rio de Janeiro Editora Guanabara Koogan 2001 INTERNATIONAL HUMAN GENOME SEQUENCING CONSORTIUM Initial Sequencing and Analysis of the Human Genome Nature v 409 p 860921 15 Fev 2001 MALACINSKI G M Fundamentos de Biologia Molecular 4ª Ed Rio de Janeiro Editora Guanabara Koogan 2005 NIH National Human Genome Research Institute Disponível em httpswww genomegov Acesso em 09 de Dezembro de 2020 NUSSBAUM R L MCINNES R R WILLARD H F THOMPSON J S THOMPSON M W Thompson Thompson Genética Médica 8ª Ed Rio de Janeiro Guanabara Koogan 2016 PASTERNAK J J Uma Introdução à Genética Molecular Humana 2ª ed Rio de Janeiro Guanabara Koogan 2007 SPEROTTO R A Org Raul Antonio Sperotto Org Protocolos e Métodos de Análise em Laboratórios de Biotecnologia Agroalimentar e de Saúde Humana Lajeado Univates 2014 SVRAKA S ROSARIO K DUIZER E AVOORT H BREITBART M KOOPMANS M Metagenomic sequencing for virus identification in a publichealth setting J Gen Virol 91 Pt 11 284656 2010 96 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA TJIO J H LEVAN A The chromosome number of man Hereditas vol 42 p 1 6 1956 VENTER J C et al The sequence of the human genome Science v 291 n 5507 p 1304 1351 16 Fev 2001 VERLI H Org Bioinformática da Biologia a Flexibilidade Molecular São Paulo SBBq 2014 UNIDADE3 MANIPULAÇÃO DE MATERIAL GENÉTICO PURIFICADO 98 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA INTRODUÇÃO À UNIDADE Na unidade anterior as amostras foram preparadas e purificadas e estudamos várias aplicações desta tecnologia que ganhava o mundo Nesta unidade vamos nos concentrar nas ferramentas e na parte metodológica com seus equipamentos podendo trabalhar a partir do material de interesse obtido A clivagem e união de fragmentos dos ácidos nucleicos técnicas que multiplicam enormemente a amostra de ácido nucleico inicial estender a molécula encurtar copiar RNA em DNA e multiplicar a amostra separar por tamanho muitas coisas estão inclusas na Unidade 3 As técnicas que compreenderemos são utilizáveis in vitro o que alavancou enormemente a possibilidade de uso das amostras de ácidos nucleicos permitiu o desenvolvimento de técnicas de biotecnologia bem como os avanços na área do diagnóstico laboratorial Para o desenvolvimento de muitas das técnicas que vamos aprender foi fundamental a descoberta e purificação de uma gama de enzimas Muitas das ferramentas com as quais trabalharemos aqui existem na natureza e fazem parte da fisiologia celular de muitos seres vivos Como exemplo podemos citar as enzimas de restrição que protegem a célula bacteriana de invasão externa o primer parte fundamental do processo de replicação celular assim como as DNA ligases que se envolvem na replicação e no sistema de reparo do material genético etc Outro fato importante é que tendo sido estas enzimas ou componentes celulares utilizados como ferramentas fomentouse o surgimento e crescimento de indústrias no ramo de Biotecnologia responsáveis pelos estudos purificação e melhoria de tudo o que se utiliza hoje na área da Biologia Molecular 31 ENZIMAS PARA MANIPULAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS A fim de facilitar o entendimento as principais enzimas de manipulação do DNA serão agrupadas 99 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA a Nucleases enzimas que vão clivar os ácidos nucleicos encurtando eou degradando estas moléculas b Ligases enzimas que unem os ácidos nucleicos fazendo ligações fosfodiéster c Polimerases enzimas responsáveis por fazer cópias das moléculas de ácidos nucleicos d Enzimas Modificadoras removerão ou adicionarão grupamentos químicos nas moléculas dos ácidos nucleicos Algumas das enzimas podem ter múltipla atividade como é o caso de certas Polimerases que possuem também atividade de nuclease o que será explorado para algumas metodologias de Biologia Molecular 311 Nucleases As nucleases agem degradando as ligações fosfodiéster que unem os ribonucleotídeos adjacentes seja em uma fita de DNA como também de RNA As nucleases podem ser divididas em exonucleases quando vão remover os nucleotídeos um de cada vez a partir das extremidades de uma molécula de ácido nucleico já as endonucleases quebram as ligações fosfodiéster no interior da molécula Figura 24 Vale enfatizar que algumas já foram mencionadas ao longo deste caderno como nos múltiplos sítios de clonagem plasmidial a RNAse utilizada para se obter amostra pura de DNA livre de RNA e assim por diante Figura 24 Tipos de Nucleases Fonte Elaborada pelo autor 2021 100 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA Existem diferenças na atuação das exonucleases para DNA algumas degradam ambas as fitas como é o caso da Bal31 gerando fragmentos cada vez mais curtos conforme o tempo de exposição à mesma enquanto a Exonuclease III degrada apenas uma das fitas de DNA deixando como produto final uma fita única de DNA Em particular sobre as nucleases um grupo específico dentro desta família enzimática merecerá um destaque à parte item 33 em função de sua grande importância na Biotecnologia e nos Laboratórios de Análises Clínicas na área da Biologia Molecular as chamadas endonucleases de restrição ou simplesmente enzimas de restrição 312 Ligases A função das Ligases é completar as descontinuidades que observamos no DNA celular sejam elas fruto dos primers removidos e união dos fragmentos de Okazaki durante a replicação ou mesmo participando dos eventos em que o chamado Mecanismo de Reparo celular atua A maioria das enzimas desta família pode unir os dois fragmentos de DNA dupla fita restaurandoa ou permitindo a construção de novo DNA recombinante como foi estudado na união de fragmento de DNA com o plasmídeo Apenas para relembrar a ligação fosfodiéster nos ácidos nucleicos será feita entre o fosfato do carbono 5 da pentose desoxirribose para o DNA e ribose para o RNA e o oxigênio da hidroxila do carbono 3 da pentose do nucleotídeo adjacente Figura 25 Figura 25 Ação da DNA Ligase Fonte Elaborada pelo autor 2021 101 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA 313 Polimerases As polimerases são enzimas que sintetizam moléculas de ácidos nucleicos tendo como molde uma outra molécula do mesmo grupo A maioria das polimerases só funcionará se o molde possuir uma região de dupla fita mesmo quando esta região for um pequeno trecho formado pela fita molde e o chamado primer descrito anteriormente Um exemplo clássico é a DNA Polimerase envolvida na replicação que como não consegue fazer síntese de novo necessitará deste iniciador primer Algumas das polimerases são utilizadas nas indústrias de Biotecnologia eou em Laboratórios Especializados em Biologia Molecular incluindo os de Análises Clínicas A DNA Polimerase I termolábil a qual geralmente é obtida de E Coli é utilizada para se ligar a uma dupla com um fragmento de DNA e à outra fita íntegra À medida que sintetiza a nova fita complementar à molde vai degradando a fita preexistente conforme segue na sua atividade de polimerização dupla atividade polimerização e nuclease tendo sido também utilizada no início dos ensaios de amplificação in vitro do material genético As DNA Polimerases Termoestáveis permitiram grande avanço nas técnicas de Biologia Molecular A mais utilizada ainda é a Taq DNA Polimerase sendo obtida da bactéria Thermus aquaticus Ela passou a ser usada nos métodos de amplificação do material genético substituindo as enzimas termolábeis Hoje existem outras DNA Polimerases sendo amplamente comercializadas como a Tbr de Thermus brocianus a BstI de Bacillus stearothermophilus e outras Em geral as DNA Polimerases fazem a polimerização das fitas de DNA no sentido 53 Outra Polimerase muito utilizada é a Transcriptase Reversa responsável por utilizar uma molécula de RNA como molde criando uma molécula de DNA complementar dupla fita o cDNA Comercialmente as duas mais utilizadas são as Transcriptases Reversas AMVRT Transcriptase Reversa do Vírus da Mieloblastose Aviária e a Transcriptase Reversa do Vírus da Leucemia Murina de Moloney MMLVRT 102 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA 314 Enzimas Modificadoras Muitas enzimas atuam modificando quimicamente o DNA através da adição ou remoção de grupamentos químicos específicos A Fosfatase alcalina é responsável pela remoção do grupamento fosfato no carbono 5 do nucleotídeo impedindo assim adição de moléculas de DNA extras nesta extremidade Já a utilização da Polinucleotídeo quinase tem o efeito reverso de adicionar o fosfato na extremidade 5 livre liberando para adição de moléculas extras de DNA nestas pontas 32 ENZIMAS DE RESTRIÇÃO As chamadas Endonucleases de Restrição foram descobertas no início da década de 50 ao se demonstrar que algumas bactérias estavam imunes na infecção por bacteriófagos restrição controlada pelo hospedeiro Levou cerca de 20 anos para que seu mecanismo de restrição fosse totalmente elucidado Esta restrição ocorre a partir da degradação do DNA do fago por ação enzimática não sendo possível que o vírus tenha tempo de se replicar e produzir novas partículas virais BORGESOSÓRIO 2013 Então se existe uma enzima que vai quebrar o DNA do hospedeiro e sendo o DNA universalmente formado pelos mesmos nucleotídeos como o DNA da célula hospedeira bacteriana não é degradado A resposta é relativamente simples o DNA bacteriano está protegido através de metilações nos locais sequências onde a enzima que a bactéria possui cortaria o DNA Desta forma a metilação impede a ação degradativa da enzima As enzimas degradativas denominadas Endonucleases de Restrição são sintetizadas pelas bactérias e até o momento já são mais de 1000 enzimas descritas e caracterizadas Descrevemse três classes diferentes de Endonucleases de Restrição cada classe sendo caracterizada por diferenças sutis em sua estrutura no seu mecanismo de ação e nos locais de reconhecimento e clivagem As enzimas da classe I e III são bem complexas e sua aplicação no ramo da Biologia Molecular é muito limitada Já as Endonucleases de 103 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA Restrição do Tipo II possuem um papel de destaque na importância que agrega à clonagem gênica pois são proteínas monoméricas ou diméricas as quais apresentam um perfil de corte característico BORGESOSÓRIO 2013 A nomenclatura para caracterizar estas enzimas será baseada na abreviação do nome do microrganismo em que foi identificada e isolada a enzima A primeira letra representa o gênero seguido de duas letras que determinam a espécie o algarismo romano eou outra letra em seguida indica a ordem de descoberta eou a cepa na qual a enzima foi isolada Por exemplo EcoRI foi purificada de Escherichia coli que carrega o fator de transferência de resistência RI já a HindIII foi isolada de Haemophilus influenzae cepa d III a HinfI foi igualmente isolada de Haemophilus influenzae mas de outra cepa 321 Especificidade de Sequência A característica principal desta classe de endonucleases é reconhecer e clivar uma sequência específica na molécula de DNA Ao apresentar esta especificidade a enzima deixa qualquer outra sequência no DNA intacta Poucas podem apresentar o que se chama de sequências de reconhecimento degeneradas ou seja existe uma sequência padrão mas no meio dela uma das posições pode ser qualquer um dos nucleotídeos é o caso da HinfI sequências mais adiante Em geral a sequência de reconhecimento chamada de sítio é uma Sequência Palindrômica ou seja quando a sequência é lida em direções opostas ela é idêntica As enzimas apresentam tal especificidade para reconhecer as sequências em geral de 4 a 8 pares de base e com isso fazem dois cortes um em cada fita Quadro 2 Outro fato igualmente importante é a natureza exata do corte que a enzima de restrição vai promover na dupla fita de DNA pois isto influencia bastante na estratégia que será escolhida para a clonagem molecular principalmente Já para os exames com base na análise dos fragmentos gerados por estas enzimas explicação sobre RFLP mais à frente é indiferente a natureza do corte Existem dois cortes distintos promovidos pelas enzimas de restrição a os dois cortes seguem o mesmo eixo de simetria ou seja a dupla fita é cortada exatamente no mesmo ponto gerandose extremidades abruptas e b a clivagem de forma desencontrada nas duas fitas em geral os pontos de corte se separam um do outro por dois a quatro 104 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA nucleotídeos gerando fragmentos de DNA nas extremidades que apresentam pequenas projeções de fita simples as quais são chamadas de adesivas ou coesivas Figura 26 Enzima Microrganismo Sítio de Reconhecimento Extremidade BamHI Bacillus amyloliquefaciens GGATCC CCTAGG Coesivas EcoRI Escherichia coli GAATTC CTTAAG Coesivas HindIII Haemophilus influenzae AAGCTT TTCGAA Coesivas SalI Streptomyces albue GTCGAC CAGCTG Coesivas HinfI Haemophilus influenzae GANTC CTNAG Coesivas SacI Streptomyces achromogenes GAGCTC CTCGAG Coesivas PvulI Proteus vulgaris CAGCTG GTCGAC Abrupta SmaI Serratia marcescens CCCGGG GGGCCC Abrupta HaeIII Haemophilus aegyptius CCGG GGCC Abrupta Quadro 2 Enzimas de Restrição com Sítios de Clivagem Local de Corte da Enzima Fonte Elaborada pelo autor 2021 Figura 26 Perfil de Corte das Endonucleases 1 Extremidades Abruptas 2 Extremidades Coesivas Fonte Elaborada pelo autor 2021 105 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA 322 Condições de Digestão Devemos relembrar que as enzimas de restrição serão amplamente utilizadas na indústria de Biotecnologia na maior parte das vezes para a clonagem celular ou para gerar fragmentos para sequenciamentos de trechos do DNA enquanto nos Laboratórios De Análises Clínicas elas são utilizadas para gerar fragmentos e com isso permitir a análise de microrganismos patogênicos a genotipagem destes e também para detecção de mutações ligadas a várias patologias Assim as condições para que o DNA seja digerido por estas enzimas são fundamentais por isso as enzimas comercialmente vendidas apresentam todas as informações necessárias para ocorrer a digestão Ainda que existam diferenças nas condições de digestão as similaridades são muitas e aqui descreveremos as condições básicas A maioria das endonucleases de restrição trabalhará em máxima atividade em um pH próximo da neutralidade levemente alcalino em torno de 74 existindo uma variação na exigência enzimática quanto à força iônica Sendo necessário para haver a reação a variação deve ser suprida por uma solução de Cloreto de Sódio NaCl além da adição de Magnésio Mg2 fundamental para a atividade desta família proteica É recomendável que se adicione um agente redutor em geral o Ditiotreitol DTT o qual estabiliza a enzima e evita sua inativação Para finalizar a maioria acaba trabalhando a 37o C de temperatura mas pode haver variação entre as enzimas É imprescindível ter atenção em todas as condições sob risco de se ter uma baixa atividade enzimática e alteração na especificidade enzimática o que pode levar a quebras inespecíficas invalidando os resultados pretendidos O tempo de incubação oscila muito de enzima para enzima mas hoje existem as classificadas como fast digestion possibilitando que a reação ocorra com alto rendimento de produto em poucos minutos em geral em menos de 10 minutos Quando a utilização das enzimas de restrição envolverem pesquisa e experimentos em clonagem molecular é bem provável que seja necessária a inativação eou destruição da proteína uma vez que poderiam ocorrer digestões de outras moléculas de DNA que possam ser adicionadas em etapas posteriores Nesta situação a incubação a 70o C normalmente inativa as enzimas todavia podese precisar de uma etapa de desproteinização como já descrito Havendo exigência de uma solução com o DNA puro outra possibilidade é a adição de EDTA que como quelante de magnésio acaba por impedir a ação das endonucleases de restrição 106 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA 33 ELETROFORESE Como já mencionamos quando estudamos a clonagem em várias situações é necessário confirmar se moléculas de DNA foram conectadas se os fragmentos gerados estão corretos fazer uma análise entre o número e o tamanho dos fragmentos para associação com patógenos com doenças genéticas Existem uma metodologia e um procedimento matemático que nos permitem calcular os tamanhos dos fragmentos gerados não se tratando meramente de uma análise visual BORGESOSÓRIO 2013 Toda vez que estivermos quantificando algo desconhecido isto só será possível se compararmos os resultados de nossa amostra desconhecida com uma amostra do mesmo tipo mas de valores conhecidos ou seja o chamado padrão o qual existe na Biologia Molecular na Bioquímica na Imunologia em diversas áreas e não apenas na saúde Uma técnica laboratorial extremamente eficaz e simples para atendermos tais necessidades é a Eletroforese Ela utiliza corrente elétrica promovendo a separação de moléculas carregadas proteínas e ácidos nucleicos Esta metodologia teve origem no início de 1900 através dos estudos de Michaelis que observou o movimento proteico quando as moléculas eram submetidas a um campo elétrico e podiam ser separadas em frações Em 1949 Linus Pauling desenvolveu o Fracionamento Eletroforético da Hemoglobina Falciforme HbS usando papel filtro A técnica foi empregada no uso laboratorial para análises específicas nos estudos de proteínas séricas lipoproteínas e hemoglobinas embora precisasse de 12 a 18 horas para fracionar proteínas além de ter baixa reprodutibilidade Somado a isto o papel utilizado por não ser transparente dificultava a quantificação das frações proteicas Por isso foi desenvolvida a Imunoeletroforese que acabou aprimorando o processo ao permitir a quantificação através de densitometria com ótima reprodutibilidade e sensibilidade Além disso uma evolução muito grande na metodologia foi a descoberta do gel de agarose possibilitandose trabalhar com uma gama maior de amostras para exame soro plasma líquor hemolisado e sendo possível a análise em um único gel o que tornou a técnica extremamente prática e aplicável com facilidade na rotina laboratorial Posteriormente ao desenvolvimento da agarose foi introduzido o gel de amido o qual acabou em desuso Depois surgiu a acrilamida que com a polimerização vinílica com a bisacrilamida gerou a poliacrilamida bastante utilizada Os principais tipos de eletroforese são acetato de celulose gel de ágar foco deste caderno gel de poliacrilamida focalização isoelétrica e eletroforese capilar 107 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA 331 Preparo do Gel de Agarose No gel a migração das moléculas ocorrerá pela diferença de carga elétrica e em função do peso molecular A velocidade de migração depende da forma e da razão entre carga e massa isto porque como o gel é uma estrutura porosa as partículas menores vão passar por ele com mais facilidade do que as maiores Então ao final de determinado tempo concluise que as partículas menores estarão mais afastadas da origem do gel em relação às moléculas maiores Figura 27 BORGESOSÓRIO 2013 Figura 27 Estrutura do Gel de Eletroforese Mixture of macromolecules Mistura de Macromoléculas Porous gel Gel poroso Electrophoresis Eletro forese Fonte Shutterstock 2021 Dentro deste procedimento o primeiro passo será preparar o gel Neste caso será abordado o Gel de Agarose produto obtido a partir das algas A concentração do gel vai variar muito em função dos tamanhos dos fragmentos que se quer analisar mas em geral variam entre 1 a 2 sempre dissolvendo a agarose em pó em 100 mL de tampão 1 seria 1 grama dissolvido em 100 mL do tampão por exemplo Após esta mistura a agarose não dissolve por completo então colocase para aquecer pode ser em um microondas utilizado apenas para esta função A cada 10 segundos é aconselhável retirar o recipiente e mexer Quando toda a agarose tiver sido dissolvida no tampão em geral acontece entre 30 a 45 segundos em potência máxima o mesmo é deixado para a temperatura abaixar um pouco tendo atenção para não apresentar bolha 108 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA Um gel de agarose 05 possui poros relativamente grandes e será usado para moléculas de DNA entre 1 e 30 kb permitindo ótima separação entre moléculas de 10 a 12 kb Uma opção para separar fragmentos bem pequenos de até 300 pb é usar poliacrilamidae não agarose O próximo passo é a adição do corante Brometo de Etídeo É necessário ter cuidado porque o composto é carcinogênico devendo ser adicionado no gel após resfriamento parcial homogeneizado para ser aplicado na cuba de eletroforese O Brometo de Etídeo vai se intercalar entre as bases nitrogenadas e ao ser exposto ao UV ele vai acender o que permite a visualização do DNA Alguns protocolos sugerem correr o gel sem o brometo de etídeo e após corar o gel com uma solução contendo este corante Na cuba de eletroforese terá um pente e assim que o gel solidificar ele deve ser retirado estando formados os poços local onde as amostras serão aplicadas Figura 28 Figura 28 Pente da Eletroforese Confecção dos Poços Fonte Shutterstock 2021 332 Preparo da Amostra A amostra precisa receber alguns componentes e vamos entender a razão disto O primeiro ponto a se destacar é que nossa amostra de DNA seja ela purificada fruto do corte com enzima de restrição ou fruto de qualquer outra fonte não tem cor alguma Sendo uma solução completamente incolor ao aplicarmos a amostra no gel 109 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA seria impossível depois de um tempo saber onde a amostra se encontra no gel Para solucionar adicionase um corante à amostra em geral é o azul de Bromofenol ABF para formar o que se chama de linha de base Figura 29 À medida que o tempo passa veremos esta linha azulada se mover indicando que parte da amostra já se encontra indo em direção ao final do gel Figura 29 Linha de Base na Eletroforese Fonte Shutterstock 2021 O segundo ponto a se entender é que o gel sendo colocado na cuba fica submerso em solução tampão ou seja ao aplicarmos a nossa amostra nos poços a tendência seria a amostra se difundir e se espalhar pela solução tampão impedindo que esta penetrasse no gel Pois bem como resolver isso e fazer com que nossa amostra fique no fundo do poço a fim de não se perder Resolvese adicionando glicerol na amostra tornandoa pesada para se assentar no poço Portanto a amostra que será aplicada por nós no gel receberá azul de bromo fenol e glicerol Figura 30 110 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA Figura 30 Aplicação da Amostra nos Poços Fonte Shutterstock 2021 333 Dando Início à Eletroforese Após aplicação da amostra a cuba de eletroforese será conectada a uma fonte geradora de campo elétrico com uma carga negativa no lado da origem do gel e positiva ao final do gel Como os ácidos nucleicos possuem carga negativa por conta da ligação fosfodiéster eles farão o caminho ao longo do gel e sua migração será dependente da forma e tamanho como já foi mencionado Figura 31 Figura 31 Eletroforese Buffer solution Solução tampão Sample wells Poços das amostras Electroto Eletrodo Power supply Fonte de energia Fonte Shutterstock 2021 111 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA 334 Aferição de Tamanho de Ácido Nucleico Refaçamos a pergunta Como vou conseguir estimar o tamanho dos fragmentos de DNA que estão em minha amostra A princípio verificamse os fragmentos presentes através do gel de eletroforese e a estimativa de tamanho virá pois junto com a amostra trabalhada fará parte da eletroforese em um ou mais poços um fragmento conhecido de DNA digerido com enzima de restrição específica gerando uma série de fragmentos de tamanho conhecido o chamado Padrão de Peso Molecular ou Ladder Um dos padrões de peso molecular mais utilizados é o lambda DNA digerido com HindIII com fragmentos que vão de 23130 pb até 125 pb Os padrões gerados nos diferentes Ladders comercializados serão fornecidos pelo fabricante Uma vez que o mercado oferece opções bem variadas ter uma ideia dos tamanhos dos fragmentos investigados auxilia bastante na escolha do padrão de peso molecular adequado O padrão de peso molecular será utilizado como a base de cálculo dos fragmentos investigados isso porque é necessária a construção de um gráfico tendo no eixo das ordenadas o tamanho de cada fragmento conhecido do padrão e no eixo das abscissas a migração em centímetros dos fragmentos deste padrão Isto é feito com a utilização uma régua medindo se quando cada fragmento avançou no gel desde a origem até o fim da eletroforese Uma vez traçado o gráfico basta medir quanto migrou dos fragmentos desconhecidos jogar no eixo das abscissas encontrar a curva e traçar a linha de encontro no eixo das ordenadas Figura 32 Figura 32 Aferição de Tamanho de Ácidos Nucleicos A Gel com o Padrão de Peso molecular mais uti lizado o lambda DNA digerido com Hind III B Gráfico do perfil de migração dos fragmentos do padrão de peso molecular C Gel exposto ao UV com o padrão de peso molecular nas colunas 1 e 20 Fonte A e B elaboradas pelo autor 2021 e C Shutterstock 2021 112 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA SUGESTÃO DE VÍDEO A Eletroforese foi uma técnica desenvolvida que permitiu a visualização de proteínas e ácidos nucleicos os quais podem ser observados utilizando como material a agarose e a poliacrilamida principalmente O princípio básico é o tamanho e carga que determinarão a migração destas estruturas ao longo do gel Neste vídeo sugerido veremos desde a montagem do equipamento como trabalhamos em nossa leitura e também a técnica em si Vamos associar nossa leitura à medida que o vídeo for acontecendo Acesse o link httpswwwyoutubecomwatchvvL3EfRx78P0t5s 34 TRANSFERÊNCIA EM BLOTTING Existem muitas situações que não podem ser resolvidas com um gel de eletroforese o que vale para o gel de proteínas e também para os de ácidos nucleicos Desta limitação foram desenvolvidas a metodologias de transferência de amostras biológicas de um gel para uma matriz sólida o Blotting A hibridização dos ácidos nucleicos em uma matriz sólida envolverá sempre fita simples indicando que no caso do DNA haverá necessidade de desnaturação da dupla fita Esta necessidade existe para que as chamadas sondas façam o pareamento correto e hibridizem sob condições adequadas Nosso estudo dará ênfase às técnicas de transferência de ácidos nucleicos Southern Blot DNA e Northern Blot RNA 113 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA 341 Western Blot Para a eletroforese de proteínas as moléculas orgânicas presentes em uma matriz gelatinosa não eram adequadas para provas moleculares que buscavam proteínas específicas ou regiões proteicas de interesse Inclusive muitos dos testes apresentavam a chamada reação cruzada tornando as provas moleculares não tão precisas quanto se desejava O problema foi sanado em 1979 com o surgimento da técnica que se denominou Western Blot que foi desenvolvida a partir do Southern Blot e do Northern Blot Inicialmente a técnica de Western Blot foi utilizada para o diagnóstico de infecções as virais e as bacterianas posteriormente passaram a ser ferramenta importante também na parasitologia A técnica Western Blot permitiu que as proteínas uma vez imobilizadas possam estar facilmente acessíveis para diferentes ligantes Além disso as membranas de fixação são extremamente fáceis de se manusear não necessitando de reagentes extremamente elaborados e em grande quantidade Uma vez fixadas na matriz sólida as proteínas podem ser marcadas por anticorpos específicos para a proteína de interesse sendo quantificadas por quimiluminescência ou reação cromogênica Por ser a detecção de anticorpos e proteínas de agentes infecciosos extremamente sensível e com grande especificidade a técnica é indicada como teste padrão Ouro na detecção de inúmeros patógenos 342 Southern Blot A técnica recebeu este nome em função do pesquisador que a desenvolveu em 1975 Edwin Southern Ela consiste na detecção de fragmentos de interesse de DNA que foi transferido de um gel para a matriz sólida Após a desnaturação da dupla fita de DNA o perfil de DNA é transferido do gel para a matriz sólida que pode ser um papelfiltro de nitrocelulose ou então uma membrana de nylon No equipamento específico o gel será colocado em contato com a matriz sólida 114 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA sendo aplicada do lado do gel uma carga negativa e do lado da matriz sólida uma carga positiva Como o DNA possui carga negativa estes migrarão do gel para a matriz ficando grudados na mesma e exatamente na ordem e orientação que se apresentava no gel Outra possibilidade é usar um tampão de alta concentração salina no lado do gel e por capilaridade o DNA vai passar do mesmo modo do gel para a matriz sólida Após concluída a transferência colocase a matriz em uma solução contendo as sondas marcadas quimicamente Toda a sonda deve ser complementar à sequência a qual se deseja detectar uma vez que hibridizando por complementariedade o local será marcado na matriz sólida indicando inclusive a presença da sequência de interesse Após tempo especificado para que a hibridização ocorra a matriz sólida deverá ser lavada para remoção do que não se ligou procedendose à revelação de acordo com o tipo de marcação das sondas utilizadas 343 Northern Blot Técnica equivalente ao Southern Blot mas que trabalha com RNAm de um ou mais genes específicos O RNA analisado por este mecanismo será digerido com enzimas como o DNA porém se separa o RNA em função do tamanho através da eletroforese em gel de agarose com posterior transferência do RNA do gel para a matriz sólida e a mesma estratégia descrita no item anterior É uma metodologia muito útil quando se quer por exemplo estudar e analisar a expressão de um gene em linhagens celulares ou a expressão em situações específicas 35 VARIAÇÃO NO COMPRIMENTO DOS FRAGMENTOS DE RESTRIÇÃO RFLP Como vimos na Unidade 1 os seres humanos apresentam altíssima similaridade entre si embora existam pequenas diferenças nas sequências nucleotídicas que se situam em regiões ligadas aos genes e suas sequências correlatas tornandose mudanças 115 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA neutras ou silenciosas As diferenças observadas entre os grupos de mesma espécie são chamadas de Polimorfismo de Sequência do DNA Este polimorfismo pode ser detectado e analisado por meio do uso de enzimas de restrição para cortar o DNA porque com as pequenas diferenças observadas entre os grupos os locais de corte para enzimas de restrição também serão deslocados gerando fragmentos diferentes em tamanho e com isso separando grupos entre si Tais sequências são chamadas de sítios de restrição ou sítios de reconhecimento conforme foi citado também para os plasmídeos Quando cortamos o DNA dupla fita e geramos um perfil de bandas fragmentos características chamamos de Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos de Restrição RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism ou seja são fragmentos de tamanhos diferentes gerados depois de cortar o DNA com uma enzima de restrição Ao se trabalhar com DNA Total estratégia que deu origem ao chamado DNA Fingerprint a quantidade de fragmentos gerados é muito grande e inviável de se analisar através de um gel de eletroforese Nestas situações o material será transferido para uma membrana matriz sólida através da técnica de Southern Blot sendo o perfil dos fragmentos determinado por meio da utilização de sondas específicas No entanto quando se gera um número pequeno de fragmentos típico de situações onde se amplifica apenas uma sequência de interesse a análise pode ser feita em gel de eletroforese Na Figura 33 segue um exemplo hipotético de amplificação da mesma sequência genética em 4 pessoas diferentes Após a amplificação será promovida a quebra com a mesma enzima de restrição enzima hipotética também e observaremos como a região apresenta pequenas diferenças entre os indivíduos o ponto de corte da enzima vai mudar de posição eou outros locais de corte vão surgir conseguindose assim diferenciar os 4 indivíduos entre si 116 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA Figura 33 Perfil d RFLP A Corte da sequência específica em 4 indivíduos diferentes B Gel de eletroforese perfil de RFLP Fonte Elaborada pelo autor 2021 Com o desenvolvimento da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase PCR Polymerase Chain Reaction tornouse possível amplificar sequências específicas e gerar grande quantidade de material para análise Vários perfis de RFLP são traçados ao ser analisada esta especificidade fornecida pelo PCR com grande utilização em genotipagem de microrganismos e detecção de mutações ligadas a diversas patologias Nas situações onde o PCR possibilita a amplificação de sequência específica o perfil de fragmentos gerado muitas vezes pode ser analisado através de gel de eletroforese Como exemplos bem diretos na Figura 34 temos a análise da presença da mutação que leva à Hemoglobina Falciforme na globina β e na Figura 35 a genotipagem do vírus da hepatite C HCV em que se consegue mapear o genótipo que infecta o paciente 1 2 3 4 5 ou 6 pelo perfil de fragmentos 117 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA Figura 34 Perfil de RFLP para análise de Anemia Falciforme A Gene normal que é cortado pela enzima Mstl I gerando dois fragmentos de tamanho bem próximos e o gene mutado cuja substituição da adenina pela timina perde o local de corte pela enzima obser vandose um único fragmento de tamanho elevado no gel B Gel de eletroforese perfil de RFLP para análise da globina beta Fonte Elaborada pelo autor 2021 Figura 35 Perfil de RFLP para Análise do HCV A análise consiste em uma transcrição reversa posterior PCR para amplificar região específica do HCV e corte com enzima de restrição O surgimento do fragmento de 142 pb confirma genótipo 3 e a de 94 genóti po 1 Corre no gel também o padrão de peso molecular caracterizando o genótipo do HCV do paciente Fonte Elaborada pelo autor 2021 118 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA 36 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE PCR Como estudamos nas unidades anteriores durante muito tempo a única forma de se amplificar fragmentos de DNA era através da clonagem gênica com os vetores e multiplicação dos mesmos para gerar múltiplas cópias técnica que ainda continua sendo utilizada mas com enfoque mais diversificado Um dos marcos em termos de avanço na área da Biologia Molecular foi o desenvolvimento da técnica de amplificação de sequências de DNA in vitro conhecida atualmente como Reação em Cadeia da Polimerase Esta técnica resolveu dois problemas na área que eram contar com quantidade suficiente de material para a análise e aumentar com maior especificidade o fragmento de interesse a ser analisado 361 Histórico do Método de PCR A técnica de amplificação foi iniciada por Saiki 1985 utilizando DNA Polimerase de E Coli o qual não era termoestável precisando ser adicionada a cada ciclo de amplificação Em seguida um pesquisador da empresa Cetus Corporation David Gelfand descobriu a Taq DNA Polimerase extraída da bactéria Thermus aquaticus que vivia nos gêiseres nascente termal que entra em erupção periodicamente e com isso tornouse ferramenta primordial para o aprimoramento da técnica de PCR o que foi feito por Mullis em 1987 pesquisador da mesma empresa também presente no artigo e desenvolvimento feito por Saiki Por conta de todo o trabalho desenvolvido e do método revolucionário criado Mullis foi agraciado com o prêmio Nobel de Química em 1993 Desta forma o órgão de patentes dos Estado Unidos concedeu à Cetus a posse da patente A empresa Perkin Elmer desenvolveu e lançou no mercado o primeiro termociclador automatizado possibilitando o desenvolvimento completo em uma máquina específica para este fim Em 1991 a Roche comprou os direitos da técnica PCR criando a Roche Molecular Diagnostics focada no desenvolvimento de kits para o diagnóstico com método de PCR Em 1992 os primeiros testes passaram a ser comercializados direcionados para Chlamidia trachomatis e HIV1 119 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA 362 Metodologia O método permite que os fragmentos de DNA possam ser amplificados na casa dos bilhões em poucas horas um processo relativamente barato com execução totalmente in vitro e sem a necessidade de células Nesta situação é essencial a obtenção de DNA fita simples para que haja a replicação do molde de interesse e dos primers que precisam ter sequência correta e precisão de orientação O método se vale da DNA Polimerase como já foi descrito as opções são variadas responsável pela polimerização e que estará ativa em cada ciclo de amplificação do método de PCR amplificando portanto o fragmento de DNA desejado em cada ciclo de amplificação a quantidade de DNA dobra Os primers serão os guias para que a DNA Polimerase amplifique corretamente o segmento de interesse uma vez que eles vão hibridizar nos locais que estão próximos à sequência de interesse Como pôde ser observado até aqui os primers são muito importantes no processo por isso vamos entender melhor sobre uma das estruturas essenciais para o PCR A amplificação necessitará de pequenas quantidades de DNA que será desnaturado Os primers farão o pareamento com posterior ação da DNA Polimerase a qual executará a replicação Para que este sistema funcione além da enzima e dos primers também serão adicionados ao sistema in vitro os quatro desoxirribonucleotídeos quando aparecer dNTP significa dATP dTTP dGTP e dCTP o pH será controlado com a adição de tampão e íons magnésio Mg2 cofator enzimático O volume gerado pela adição dos componentes vai variar de 10 a 50 µL Figura 36 Figura 36 Mistura para Realização do PCR Fonte Elaborada pelo autor 2021 a partir de Shutterstock 2021 120 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA 3621 Determinação dos Primers Os primers acabam se constituindo no ponto de sucesso ou fracasso da metodologia do PCR Por isso se forem projetados corretamente resultarão na amplificação do trecho desejado que é exatamente a sequência alvo Entretanto sendo projetados incorretamente podemos não amplificar absolutamente nada caso o primer não encontre local de hibridização ou encontrando amplifique outra região que não a de interesse Os primers são fundamentais para a ligação da DNA Polimerase a qual não consegue se ligar em fita simples precisando de um pequeno trecho de dupla fita que vai se formar entre primerfita de DNA para a enzima iniciar a adição de desoxirribonucleotídeos na extremidade 3 do primer Outro ponto a se destacar é que na fisiologia celular o primer é uma pequena molécula de DNA No entanto como o primer a ser utilizado no método de PCR será construído em laboratórios específicos ele já será uma pequena molécula de DNA e a determinação da extremidade 5 e 3 do primer tem que ser precisa também Observe que precisamos construir dois primers um para cada fita Eles devem hibridizar nas chamadas regiões flanqueadoras não exatamente no início da sequência de interesse mas bem próximo desta O primeiro será o foward no início da sequência e o segundo primer reverse no fim da fita oposta à região complementar da sequência alvo Com isso é fundamental conhecer a sequência flanqueadora ou não haverá hibridização Para tanto o Projeto Genoma Humano trouxe vasta informação sobre nossa sequência nucleotídica Além disso considerase o tamanho uma vez que ele não pode ser muito longo pois influenciaria no ritmo de hibridização primerFita DNA tornandose muito lento permitindo até que a dupla fita fosse refeita Mas o primer também não pode ser pequeno pois ele poderia hibridizar nas sequências alvo mas igualmente em outras partes do genoma gerando amplificações indesejáveis Se não pode ser pequeno nem grande qual o tamanho ideal Vamos partir para um cálculo entendendo o tamanho ideal dos primers utilizados para o nosso DNA Imaginemos um primer com 8 nucleotídeos quantas vezes pode aparecer uma sequência que hibridize com este primer de 8 nucleotídeos O cálculo mostra o seguinte Com os nucleotídeos esperamse sequências de reconhecimento a cada 48 pares de base 4 opções A T C e G 65536 pb Ou seja hibridizou no local 1 depois 121 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA de 65536 pb vai hibridizar de novo e assim por diante Para sabermos quantos pontos de hibridização teremos basta dividir o número de pares de base do genoma arredondando para 3200000000 por 65536 aproximadamente 48828 locais em que o primer de 8 nucleotídeos se ligaria Ou seja é inviável já que o primer vai se ligar em um único local que antecede a sequência de interesse Vamos agora imaginar um primer com 17 nucleotídeos seguindose a mesma linha de raciocínio quantas vezes pode aparecer uma sequência que hibridize com este primer de 17 nucleotídeos O cálculo mostra que Com os nucleotídeos esperamse sequências de reconhecimento a cada 417 pares de base 4 opções A T C e G 17179869184 pb Neste caso nem precisamos continuar os cálculos e por quê O primer hibridizaria no local 1 e só depois de mais de 17 bilhões de pb encontraria outra sequência igual sendo impossível já que nosso genoma possui em torno de 3 bilhões e 200 milhões de pb Então as recomendações englobam tamanho e teor de nucleotídeos de A T C e G e este teor das bases nitrogenadas será tratado no tópico seguinte A saber sobre as principais regras a Estabelecer o tamanho dos primers entre 17 e 24 bases evitando primers com 30 ou mais bases b Assegurar relação de 40 de purinas para 60 de pirimidinas o que garante a especificidade da reação não prejudicando o cálculo que será feito para T2 temperatura de anelamento c Buscar construir o primer com maior concentração de G e C na extremidade 5 e menor na 3 para que seja facilitado o anelamento ao final d Evitar trinca de bases repetidas e Trabalhar com conteúdo de desoxirribonucleotídeos que leve a temperatura de anelamento T2 para a faixa de 52º C a 65o C f Ao calcular a temperatura de anelamento para cada primer elas precisam estar muito próximas e trabalhar com a média 122 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA 3622 Temperaturas e Ciclos de PCR O método consiste em ciclos repetitivos normalmente em torno de 25 a 35 sendo que cada ciclo envolverá 3 etapas T1 T2 e T3 e tudo será realizado nas máquinas chamadas de termocicladores as quais controlam todas as condições de temperatura e tempo de acordo com o número de ciclos BORGESOSÓRIO 2013 Como se pode ver na Figura 37 durante cada ciclo do PCR a mistura é submetida a três temperaturas a A chamada T1 é a temperatura de desnaturação na qual a dupla fita de DNA vai se separar completamente formando fita simples e se tornando acessível à hibridização dos primers em etapa posterior Em geral a temperatura utilizada está em torno de 94o C e o tempo necessário entre 55 segundos e 2 minutos É uma desnaturação que não exige muita complexidade pois a dupla fita está unida por ligação hidrogênio entre as bases nitrogenadas fáceis de serem rompidas com temperatura elevada diferentemente das ligações fosfodiéster que não se rompem nestas condições b A chamada T2 é a temperatura de anelamento dos primers com as fitas simples que foram formadas na etapa anterior É menor que T1 porém precisa ser calculada em função de cada primer é a temperatura média de fusão o Tm Melting Temperature que seguirá a fórmula a ser aplicada para cada um dos primers Tm 4x GC 2x ATC O valor maior o qual multiplica o par GC pode ser facilmente explicado ao lembrarmos que o pareamento GC tem 3 ligações hidrogênio enquanto o par AT tem duas então quanto maior o teor de Cg mais alta será a Tm Se a temperatura for muito elevada não acontecerá a hibridização No reverso os primers vão continuar dissociados podendo ainda haver outra situação em que a temperatura é muito baixa e híbridos incorretos podem ser formados Em geral a temperatura de T2 varia entre 50º C e 60o C sendo fruto da média de Tm dos primers porém a recomendação é que se diminua de 1º C a 2o C da Tm e há laboratórios que recomendam diminuir de 3º C a 5o C da Tm O tempo também varia em função do tamanho dos primers mas está entre 1 e 2 minutos 123 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA c A chamada T3 é a temperatura de extensão em que ocorrerá a síntese de DNA ou seja da segunda fita complementar ao DNA Molde onde os dNTPs serão adicionados fruto da ação da DNA Polimerase A T3 girará em torno dos 72o C mas pode variar em função da temperatura ótima de cada tipo de DNA Polimerase que será utilizada Já o tempo oscila de 50 segundos até 5 minutos dependendo da extensão desejada da sequência alvo Figura 37 Etapas do Ciclo de PCR Denaturation Desnaturação Annealing Anelamento Elongation Alongamento Fonte Shutterstock 2021 Assim que a T3 se fecha o equipamento retorna a temperatura para T1 e novo ciclo de PCR inicia até que o total de ciclos determinado esteja completo Ao final do processo bilhões de cópias são geradas Figura 38 Figura 38 Ciclos de PCR Fonte Shutterstock 2021 124 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA Um ponto que precisa ser observado é a concentração de Mg2 uma vez que o excesso deste ocasionará uma redução na fidelidade da DNA Polimerase aumentando a formação de produtos não específicos Já seu oposto a ausência ou baixa concentração mantém a enzima inativa e não há formação de produto Alguns cossolventes podem ser adicionados à solução para aumentar a especificidade da reação sendo os mais utilizados glicerol dimetilsulfóxido DMSO polietilenoglicol PEG e outros 363 Contaminação Para todo e qualquer método científico aplicado seja na rotina laboratorial ou mesmo em linhas de pesquisas acadêmicas e industriais as medidas de segurança e controle dos procedimentos têm como foco primário evitar contaminações que podem ocorrer inviabilizando todo o processo Os riscos são minimizados ao seguir a seguinte conduta a Preparar a amostra em área separada de onde as reações do PCR são feitas e ambas separadas também de onde fica o termociclador e a sala de reagentes do PCR estoque b Todos os reagentes ficam separados dos equipamentos c Todos os reagentes e instrumentos que podem ser autoclavados precisam se manter estéreis d Sempre que possível aliquotar solução estoque para evitar o processo contínuo de descongelarcongelar muitas vezes e Preparar uma prémistura com os componentes da reação de PCR sem a DNA Polimerase e sem a amostra de DNA f Jamais tocar quaisquer soluções tubos amostra reagentes da biologia molecular não só do PCR sem luva g Os controles negativos são fundamentais para monitorar possíveis contaminações e os controles positivos para atestar o funcionamento de tudo ligado ao processo 125 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA 364 Tipos de PCR A partir da metodologia desenvolvida por Mullis muitas variações foram surgindo e o protocolo básico adaptouse para objetivos específicos Claro que a maior parte segue obedecendo ao que foi desenvolvido pelo criador da técnica mas o campo continua promissor como podemos ver a seguir a PCR Multiplex permite uma amplificação simultânea de mais de uma região do DNA e com tamanhos distintos Existe a necessidade de mais de um par de primer nesta metodologia o que reduz o tempo de trabalho otimizando o tempo evitamse reações sucessivas em diferentes condições ao minimizar a chance de contaminação portanto Muito aplicado na área do diagnóstico como análise de mutações e polimorfismos análises quantitativas detecção de patógenos etc b PCR com Transcriptase Reversa RTPCR de Reverse TranscriptionPCR inicia partindo de um RNA como alvo Ao formar o DNA complementar cDNA usará a Transcriptase reversa e em seguida o produto será submetido a um PCR padrão tendo como molde o cDNA formado Muito utilizado quando se quer fazer investigação de expressão gênica e também para amplificação de DNA viral como HIV e HCV Tenha atenção porque muitos artigos ou a literatura tratam o PCR em tempo real também como RTPCR de Real Time PCR Aos poucos isso tem mudado e o PCR em tempo real vem sendo referido como qPCR de PCR quantitativo c NestedPCR neste procedimento serão utilizados primers mais internos ao primeiro par de primers fazendose um 2o PCR com o produto do 1o PCR em que a maioria ou todos os pares de primers são diferentes O 2o par em geral aproxima se ainda mais da sequência alvo O PCR em Tempo Real será discutido em detalhes na próxima unidade já que é uma metodologia rica em dados procedimentos sendo hoje utilizado em larga escala para fins diagnósticos 126 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA 355 Principais Aplicações do PCR Este tópico destacará três campos de utilização do método como poderosa ferramenta na área da saúde e forense Cabe enfatizar que o PCR é uma etapa e precisa estar associado a outras metodologias para fornecer o diagnóstico final Por exemplo na detecção de alguns patógenos será necessária associação com o gel de eletroforese na clonagem com os vetores muitas vezes o produto do PCR precisa ser digerido com alguma enzima de restrição e posterior gel de eletroforese e assim por diante a CLONAGEM A partir de um molde de DNA ou até de RNA será obtido DNA ou cDNA respectivamente Com a amplificação várias opções podem ser trabalhadas Uma delas é relativamente simples e consiste em correr um gel de eletroforese para verificar se o fragmento corresponde ao tamanho previsto após a checagem um procedimento igualmente simples permite que se corte o fragmento no gel correspondente ao produto do PCR separando quimicamente o DNA de tudo que corresponda ao gel e assim se tem o DNA que foi amplificado Este material agora pode ser clonado em um vetor plasmidial como já foi descrito partindo para o sequenciamento a fim de assegurar que a sequência é 100 correspondente à projetada e para as inúmeras possibilidades que a tecnologia do DNA recombinante permite B DETECÇÃO DE MICRORGANISMOS A partir do desenvolvimento de primers complementares às sequências de microrganismos foi possível detectar a presença destes em diversas amostras biológicas seja um microrganismo patogênico ou não Todavia devemos lembrar que as sequências dos microrganismos precisam ser conhecidas e mais um detalhe muito importante não se constrói primer para hibridizar em sequências variáveis pois eles precisam hibridizar em sequências conservadas Então os patógenos que apresentam muitas variáveis genéticas requerem extremo cuidado até para atualização dos testes cada vez que surge uma nova variante Para os microrganismos que possuem RNA como material genético o processo 127 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA consiste em um PCR com transcrição reversa e depois amplificação de regiões do microrganismo no PCR testes quantitativos carga viral Se com estes microrganismos for detectado o DNA formado pelo vírus é um PCR qualitativo presente ou ausente como resultado Vários microrganismos patogênicos podem ser detectados como por exemplo Chlamydia trachomates Vírus da Imunodeficiência Humana HIV Vírus da Hepatite B HBV Neisseria gonorrhoeae Citomegalovírus Mycobacterium tuberculosis e outros tantos C MEDICINA FORENSE Uma das vantagens já é o fato de poder trabalhar com montante pequeno de amostra ainda mais quando se trata de DNA fruto de evidência criminal Muitas vezes o que se envia para análise pode se resumir a pequenas e diminutas gotas de sangue necessidade de raspagem de tecido mancha labial em copos cigarros etc Quando se tem um teste de paternidade que também é forense e portanto relativo a foro em geral o montante coletado é suficiente para análise Hoje muitos testes nesta área são feitos por sequenciamento automático haja vista que com grande precisão a confiabilidade do teste é muito maior Nos equipamentos ocorrerá uma amplificação interna assemelhandose muito à amplificação gerada pelo PCR Esta área forense será abordada mais detalhadamente na próxima unidade 366 Limitações do Método de PCR Apesar da alta sensibilidade e grande capacidade de amplificação de DNA a técnica de PCR apresenta algumas limitações Requer conhecimento prévio de sequências que podem se hibridizar com primers levando em conta que estas não podem estar muito distantes da sequência de interesse Possibilidade de contaminação por material dos profissionais envolvidos na execução da técnica partículas aerossóis o que requer extremo cuidado separação rígida de ambientes e por isso um gasto mais elevado 128 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA A Taq DNA Polimerase não é capaz de revisão podendose inserir algum desoxirribonucleotídeos incorreto o que ocorre a cada 20000 pb Isso está equacionado uma vez que novas DNA polimerases já estão disponíveis no mercado O tamanho dos fragmentos que podem ser amplificados pela Taq DNA Polimerase em geral é menor que 2000 pb Atualmente usando outras enzimas com capacidade de revisão Temse obtido sucesso para amplificar segmentos maiores de até 50000 pb Necessidade de trabalhar com amostra com grau de pureza elevado uma vez que compostos como grupamentos heme bilirrubina bile e sais inibem o processo de PCR e podem ser observados no material coletado dos pacientes Somado a isso a Taq DNA Polimerase é muito sensível a compostos orgânicos e inorgânicos Dodecil Sulfato de Sódio SDS heparina EDTA isocianato de guanidina O método não tem como mostrar a quantidade amplificada ao final da metodologia muitas vezes quando se parte de pouco material a amplificação pode não ser satisfatória no oposto quando se parte de muita amostra ao final dos ciclos o resultado extrapolou a sensibilidade e os resultados podem não ser confiáveis Por não quantificar o material amplificado necessitará de um método de revelação adicional gerando mais uma etapa o que significa custo adicional SUGESTÃO DE VÍDEO Uma técnica muito bem aplicada a qual abriu portas para as mais diversas abordagens foi a técnica da Reação em Cadeia da Polimerase PCR Este vídeo é bem esclarecedor sendo interessante que você associe com muitos conceitos já aprendidos nesta e em outras disciplinas httpswwwyoutubecomwatchvewt3kC4JbQt4s 129 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA SUGESTÃO DE LEITURA PIMENTA C A M LIMA J M Genética Apli cada à Biotecnologia 1ª ed São Paulo Editora Erica 2015 No capítulo 9 Biotecnologia especificamente no item 92 o livro traz a temática Biotecnologia na Genética e Saú de É uma leitura fácil que vai acrescentar bastante sobre as tecnologias que vimos com as mais diversas aplicações das mesmas 37 CRISPR O mecanismo do CRISPR aplicado como uma tecnologia de Biologia Molecular vai se basear neste sistema que é natural de bactérias O ser humano adaptou a tecnologia para usar as proteínas do sistema como a Cas9 e outras para editar o genoma seja mudando sua sequência bloqueando tantas outras ou minimizando suas expressões Para isso o RNA presente no sistema CRISPR é editado e construído em laboratório de acordo com a sequência alvo que se queira atingir O RNA que será chamado de guia hibridizarseá com a sequência alvo para que as modificações sejam feitas Assim o conhecimento da sequência a qual se deseja modular será fundamental para o uso desta tecnologia na prática da pesquisa básica na medicina e saúde na área veterinária e indústria Um dos enfoques do uso da tecnologia é aproveitar o sistema de reparo celular para modificar sequências de acordo com a estratégia da abordagem que se queira atingir Na prática é uma nova tecnologia de edição do genoma Figura 39 130 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA Figura 39 Sistema CRISPR Fonte Shutterstock 2021 371 Histórico Em 1987 o pesquisador japonês Yoshizumi Ishino com seus colaboradores na Universidade de Osaka identificaram loco diferenciado no genoma bacteriano de Escherichia coli que apresentava uma estrutura muito incomum a qual consistia em sequências repetidas e sequências espaçadoras alternadas apresentando função completamente desconhecida até o momento Muitas pesquisas independentes surgiram e as mesmas sequências foram identificadas nos genomas de diferentes bactérias e Archaea Em 2002 as sequências foram nomeadas como CRISPR Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas JANSEN 2002 As pesquisas que se seguiram identificaram um conjunto de genes que se nomeou CAS CRISPR Associated Genes estando localizados muito próximos ao loco CRISPR Alguns anos depois em 2005 pesquisas independentes mostraram a origem das sequências espaçadoras que se derivavam de plasmídeos ou tinham origem viral mostrando ainda que as bactérias possuidoras destes espaçadores não seriam capazes de serem infectadas por vírus BOLOTIN 2005 Figura 40 131 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA Figura 40 Sistema Genético CRISPR Cas Fonte Elaborada pelo autor a partir de Pereira 2016 Então em função dos vários achados científicos foi postulada uma hipótese de que o complexo CRISPRCas seria um sistema imune adaptativo próprio dos procariotos uma vez que estes espaçadores formariam uma memória celular que preveniria o microrganismo de invasões subsequentes MOJICA 2005 Isto é as moléculas de RNA originadas dos espaçadores seriam complementares ao agente invasor patógeno permitindo um combate baseado em um sistema sequênciaespecífica 372 Função Fisiológica Celular Como já foi mencionado o sistema CRISPRCas é um mecanismo de defesa que previne e protege as células de ataque externo ou seja constituise em um maquinário importante de defesa dos procariotos contra a invasão de elementos genéticos móveis plasmídeos transposons e bacteriófagos É um sistema que guardando as devidas proporções apresentaria semelhança com o sistema imune adaptativo Basicamente seria um mecanismo em três etapas a Adaptação a Biogênese de crRNA e por último a Ação contra o invasor a ADAPTAÇÃO quando acontece a 1a invasão algumas enzimas Cas 1 e Cas 2 são codificadas pelo gene Cas e atacam e clivam o DNA do invasor gerando pequenos segmentos entre 24 a 48 pares de base os quais são integrados no loco CRISPR como novos espaçadores mantendose em alternância com as sequências repetidas Findo este processo a bactéria estará imunizada contra o agente em invasões futuras 132 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA B BIOGÊNESE DO CrRNA ocorrerá a transcrição do loco CRISPR evento mediado pelo sítio promotor região rica em adenina e timina Esta transcrição vai ocasionar a formação de um precursor de RNA correspondente à região de CRISPR précrRNA a qual apresentará várias sequências repetidas alternadas com os espaçadores mas ainda sendo um único e longo RNA Em seguida o précrRNA será processado gerando diversos RNAs menores que são chamados de crRNA cada qual correspondente a um espaçador distinto C AÇÃO DE DEFESA formam complexos dos crRNAs maduros com as proteínas Cas reconhecendo as sequências de DNA invasor e o destruindo 373 Aplicações na Medicina As aplicações do sistema na área da Medicina apresentamse variadas como podemos observar abaixo Alvos Terapêuticos O objetivo é identificar sequências gênicas em patógenos humanos que podem ser alvo da maquinaria de CRISPR construídas especialmente para ter como alvo regiões específicas deste agente patogênico Pesquisas são conduzidas nesta direção e já demonstram que não se previne por completo a infecção patogênica mas sim se ameniza com graus variados os efeitos destes agentes em células de eucariotos superiores Uma vez demonstrado em modelos celulares correlatos o método de CRISPR é capaz de validar possíveis alvos terapêuticos o que leva a indústria farmacêutica a visualizar o desenvolvimento de novas drogas no combate de doenças que afetam os humanos Com a metodologia não só é possível ver a ação em alvos já conhecidos como também testar outras regiões em que não se sabe exatamente qual o papel na fisiologia dos agentes patogênicos 133 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA Bloqueio a Entrada de Vírus O modelo experimental que tem apresentado resultados promissores envolve as pesquisas com HIV1 que trabalha em duas frentes basicamente impedir a entrada do HIV1 nos linfócitos T e eliminar o provírus do HIV1 o qual já se integrou no genoma linfocitário Na infecção do HIV nas células humanas existe um receptor primário que é o CD4 sendo um dos correceptores para a entrada do HIV o CCR5 Está amplamente descrito na literatura médica que indivíduos os quais são homozigotos para algumas mutações que ocorrem neste correceptor incapacitam o vírus a infectar as células Uma das estratégias do uso do CRISPR é provocar um knockout espécie de inutilização no gene do CCR5 para impedir a infeção pelo HIV1 LI 2015 Outro trabalho foi capaz de criar célulastronco homozigotas para ambos os alelos CCR5 mutação feita pelo sistema CRISPR e estas células preservaram a pluripotência e se diferenciaram em macrófagos com resistência à infeção pelo HIV1 KANG 2015 Um trabalho que marcou a área envolvendo o HIV foi obtido por Kaminsk e colaboradores 2016 os quais conseguiram remover o genoma completo do HIV1 que estava integrado aos cromossomos de linfócitos T CD4 e a expressão persistente de componentes do sistema CRISPR ainda protegeu as células de nova infecção pelo HIV1 Estas pesquisas usando metodologia de CRISPR também diminuíram de forma elevada a replicação do vírus e consequentemente a carga viral em cultura de linfócitos T CD4 dos pacientes infectados por HIV1 Câncer Alguns tipos de câncer de mama com índice alto de óbito apresentam alta expressão de 92 genes que pertencem ao sistema de resposta ao estrogênio distante DEREs Hsu e colaboradores 2015 através de componentes do sistema CRISPR conseguiram a deleção total ou parcial dos genes que fazem parte do sistema DEREs Observaram também que os genes intimamente relacionados com a proliferação celular foram reprimidos opostamente os de apoptose celular foram induzidos Tais trabalhos foram realizados com a utilização de linhagem celular de câncer de mama os quais abrem frente para a utilização desta tecnologia no controle de crescimento tumoral aumentando a expectativa de vida do paciente 134 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA Terapia Genética Foram criadas Célulastronco com Pluripotência Induzida iPSCs de um paciente com mutação no gene Ritinitis Pigmentosa GTPase Regulator RPGR que acaba causando uma forma grave de Retinite Pigmentosa RP ligada ao X XLRP Através de componentes do sistema CRISPR contendo uma cópia corrigida do gene RPGR este DNA atuou como um molde de reparo através de recombinação homóloga permitindo a edição específica da mutação com 13 das células apresentando o reparo esperado na região alvo e fazendo o conserto do gene mutado para sua forma selvagem original BASSUK 2016 Controle de Vetores de Doenças Hammond e colaboradores 2015 conseguiram injetar componentes do sistema CRISPR em embriões de mosquitos Anopheles gambiae obtendo um resultado de 99 de modificação no gene AGAP007280 ao levar à infertilidade as fêmeas Este trabalho abre frente importante para a criação de um sistema que interrompa a reprodução do mosquito vetor da malária bem como para vetores de outras doenças Na mesma área Gantz e colaboradores 2015 criaram um mosquito transgênico através do sistema CRISPR resistente ao parasita Plasmodium falciparum 374 Aplicações na Indústria Produção de Biocombustível Com a utilização do sistema CRISPR Ryan e colaboradores 2014 conseguiram isolar uma proteína modificada ligada ao processo fermentativo em leveduras a CDT1 que é responsável pelo transporte de celobiose para dentro das células onde são convertidas em etanol através deste processo fermentativo A proteína modificada aumenta em mais de dez vezes o processo fermentativo e consequentemente a produção de álcool abrindo vasto campo para se otimizarem processos de produção de Bioetanol em larga escala 135 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA Produção de Biomoléculas Através do sistema CRISPR pesquisadores conseguiram induzir alta expressão de βcaroteno em Saccharomyces cerevisiae RONDA 2015 SUGESTÃO DE VÍDEO Como mostramos em nosso caderno a tecnologia do CRISPR abre muitas perspectivas e tem empolgado parte da comunidade científica com a capacidade de edição gênica e muitas das aplicações na saúde na indústria na veterinária etc Porém muitos são os chamados em que a tecnologia ainda apresenta lacunas de incertezas como a dúvida se o aparato de CRISPR não poderia se ligar em outros locais promovendo modi ficações indesejáveis Assista ao vídeo desta tecnologia e faça uma reflexão sobre isso Acesse o link httpswwwyoutubecomwatchv27l7ZVpL7W0t183s SUGESTÃO DE LEITURA Um dos grandes objetivos da Medicina e do enfoque em diversas pesquisas na área da saúde é a Terapia Gênica a qual consiste basicamente na capacidade de corrigir genes ou sequências defeituosas que levem ao desenvolvimento de alguma patologia Uma das tecnologias promissoras é o sistema CRISPR Neste artigo você terá a oportunidade de se atualizar sobre terapia gênica em suas diversas abordagens Terapia gênica avanços desafios e perspectivas Acesse o link httpswwwscielobrscielophpscriptsciarttextpi dS167945082017000300369lngennrmisotlngpt 136 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA CONSIDERAÇÕES FINAIS Na Unidade 3 estudamos ferramentas fundamentais para o entendimento de exames e abordagens utilizadas nas rotinas laboratoriais na indústria e nas pesquisas envolvendo a área da Biologia Molecular Para isso trabalhamos as enzimas hoje utilizadas para manipular ácidos nucleicos com um enfoque nas chamadas enzimas de restrição as quais são fundamentais em outro tópico abordado o perfil das bandas geradas após o corte por estas enzimas o RFLP Vimos ainda exames que são realizados utilizando este princípio Duas ferramentas muito importantes também foram abordadas aqui o gel de eletroforese mostrando que podemos trabalhar ácidos nucleicos e proteínas nesta metodologia e a execução de blots outro procedimento intimamente ligado à eletroforese seja para proteína DNA e RNA Nesta unidade entendemos procedimentos técnicos que são utilizados em amplo campo inclusive na rotina dos laboratórios de análises clínicas com foco na Biologia Molecular o PCR o qual se tornou ferramenta importantíssima para impulsionar a área de exames laboratoriais indústria pesquisas e tantos outros campos Fechamos a unidade com a tecnologia promissora mas ainda muito incerta na potencialidade dos seus afeitos o CRISPR 137 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA EXERCÍCIO FINAL 01 CONHECIMENTO Várias proteínas e enzimas estão envolvidas na interação com os ácidos nucleicos seja no evento da replicação ou durante a transcrição e a tradução Muitas delas foram purificadas pelo ser humano a partir dos microrganismos de origem e hoje são ferramentas fundamentais na manipulação de ácidos nucleicos sendo peça importante no que se chama Tecnologia do DNA Recombinante Diante do exposto assinale qual destas ferramentas é responsável por formar cDNA a Transcriptase Reversa b DNA Ligase c DNA Polimerase d RNA Polimerase e Enzima de Restrição 02 CONHECIMENTO A Reação em Cadeia da Polimerase PCR foi desenvolvida no início da década de 80 e tornou possível a amplificação seletiva de segmentos de DNA preenchendo uma das dificuldades que na época era ter material genético suficiente para procedimentos diversos Em função do conhecimento adquirido ao longo desta unidade analise as afirmativas abaixo I Os primers utilizados para uma amplificação de PCR precisam ser idênticos pois desta maneira a T2 funcionará corretamente permitindo anelamento de ambas as suas fitas correspondentes II Se os primers forem muito pequenos podem hibridizar com múltiplos sítios provocando uma amplificação inespecífica III Não se devem criar iniciadores muito longos porque o comprimento do primer influencia o ritmo no qual ele se hibridiza com o DNAmolde uma vez que iniciadores longos hibridizam em um ritmo bem mais lento Assinale a alternativa correta a É falsa apenas a afirmativa III b São verdadeiras somente as afirmativas II e III c São verdadeiras todas as afirmativas 138 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA d É falsa apenas a afirmativa II e São falsas todas as afirmativas 03 CONHECIMENTO A técnica de PCR apresenta vários ciclos cada um sendo composto de 3 temperaturas cada uma tendo suas funções específicas Além disso para o sucesso da técnica um dos elementos mais importantes é o primer sem o qual a DNA Polimerase não teria como agir na prática Em função do conhecimento adquirido ao longo desta unidade analise as afirmativas abaixo I A T3 do ciclo do PCR precisa ser calculada em função da quantidade de A T C e G II O conhecimento das sequências no DNA é fundamental para o desenho correto do primer e consequente hibridização deste iniciador flanqueando o gene durante a T3 do ciclo de PCR III O ideal é o primer se prender em regiões do DNA de sequências altamente conservadas para permitir o máximo de amplificação possível Está coreto o que se afirma em a É falsa apenas a afirmativa III b São verdadeiras somente as afirmativas II e III c São verdadeiras todas as afirmativas d É falsa apenas a afirmativa II e São falsas apenas as afirmativas I e II 139 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA REFERÊNCIAS BASSUK A G ZHENG A LI Y TSANG S H MAHAJAN V B Precision Medicine Genetic Repair of Retinitis Pigmentosa in PatientDerived Stem Cells Sci Rep 2016 6 19969 BOLOTIN A QUINQUIS B SOROKIN A DUSKO EHRLICH S Clustered regularly interspaced short palindrome repeats CRISPRs have spacers of extrachromosomal origin Microbiology 2005 151 255161 BORGESOSÓRIO Maria Regina Lucena ROBINSON Wanyce Miriam Genética humana 3ª ed Porto Alegre ArtMed 2013 GANTZ V M JASINSKIENE N TATARENKOVA O FAZEKAS A MACIAS VM BIER E Highly efficient Cas9 mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi Proc Natl Acad Sci USA 2015 201521077 GRIFFITHS A J F GELBART W M MILLER D T LEWONTIN R C Genética Moderna 1ª Ed Rio de Janeiro Editora Guanabara Koogan 2001 HAMMOND A GALIZI R KYROU K SIMONI A SINISCALCHI C KATSANOS D A CRISPRCas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae Nat Biotechnol 2015 34 7883 HSU P D LANDER E S ZHANG F Development and applications of CRISPRCas9 for genome engineering Cell 2014 1576 126278 JANSEN R EMBDEN J D GAASTRA W SCHOULS L M Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes Mol Microbiol 2002 Mar 43 6 156575 KAMINSKI R CHEN Y FISCHER T TEDALDI E NAPOLI A ZHANG Y Elimination of HIV1 Genomes from Human Tlymphoid Cells by CRISPRCas9 Gene Editing Sci Rep 2016 6 22555 KANG H MINDER P PARK M A MESQUITTA WT TORBETT BE SLUKVIN I I CCR5 Disruption in Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPRCas9 Provides Selective Resistance of Immune Cells to CCR5tropic HIV1 Virus Mol Ther Acids 2015 4 e268 KRAMER M F DONALD M C Enzymatic Amplification of DNA by PCR 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APLICAÇÕES DOS TESTES EM BIOLOGIA MOLECULAR 142 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA INTRODUÇÃO À UNIDADE Nesta última unidade iniciaremos o conteúdo com PCR em Tempo Real trabalhando seu histórico e toda fundamentação da técnica suas aplicações que ganham ainda mais atenção nos tempos de pandemia Em seguida daremos continuidade ao conteúdo com sequenciamento automático mais uma técnica importantíssima e com fins dos mais diversos inclusive nos casos forenses O DNA microarray e suas derivações é muito utilizado inclusive como pesquisa de inúmeros alvos terapêuticos expressão farmacodinâmica e outras abordagens Também compreenderemos a captura híbrida uma tecnologia amplamente aplicada nos Laboratórios de Análises Clínicas para detecção de patógenos DNA apresentando muitas vantagens em sua utilização na prática laboratorial Para finalizar a unidade e consequentemente nosso caderno trabalharemos os casos forenses de DNA Paternidade e DNA Criminal na Genética Forense seu histórico seus fundamentos científicos e técnicos bem como as regras que vão balizar a validade dos resultados obtidos em ambas situações Fato importante para se ter em mente quando entrar na genética forense é entender que o DNA criminal é uma peça dentro da investigação e desta forma não será único e absoluto instrumento de condenação eou absolvição 41 PCR EM TEMPO REAL QPCR 42 HISTÓRICO Um dos pensamentos que sempre acabou povoando a mente da comunidade científica a qual viu o desenvolvimento do PCR e seu sucesso no uso como uma tecnologia revolucionária de amplificação do DNA foi de adquirir a capacidade de quantificar o material amplificado a cada ciclo de PCR Então em função desta necessidade de poder 143 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA monitorar a quantidade bem como a qualidade do DNA amplificado levou à criação de uma nova e promissora tecnologia chamada de PCR em Tempo Real A técnica foi descrita pela primeira vez em 1993 por Higuchi e seus colaboradores que montaram um aparato no qual havia uma câmera acoplada monitorando a PCR em todos os ciclos e isto permitiu a detecção do aumento de fluorescência durante a reação já que utilizavam o brometo de etídeo no sistema e este se ligava a cada molécula de DNA da dupla fita nova que era sintetizada A técnica se assemelha bastante ao PCR tradicional porém apresenta a inovação que os diferencia a quantificação em tempo real do material amplificado a cada ciclo executado sendo as fases de amplificação detecção e quantificação totalmente automatizados HEID 1996 Vale lembrar que esta é uma enorme vantagem em relação ao PCR tradicional que após ser executado ainda necessita de outra metodologia que revele e quantifique o material para se saber a concentração de partida e o PCR em Tempo Real não precisa disso O aprimoramento da técnica ocorreu rapidamente sendo um dos fatores preponderantes para este objetivo o desenvolvimento de sondas de oligonucleotídeos ou moléculas especiais de fluorocromos além da descoberta que a Taq DNA Polimerase possuía atividade exonucleásica 53 ou seja ela é capaz de remover nucleotídeos pelas extremidades importante para um tipo de PCR em Tempo Real que vai ser abordado Posteriormente o aperfeiçoamento do equipamento também tem permitido todo o aprimoramento da técnica possuindo um sistema onde o termociclador máquina de PCR apresenta um sistema óptico que recolhe a emissão de fluorescência e está acoplado a um computador com software capaz de analisar as reações ocorridas Basicamente o princípio será quanto mais alto for o número de cópias iniciais do DNA alvo mais rápido se observa um aumento significativo da fluorescência Ainda que algumas publicações e a TV usem a designação de RTPCR para Real Time PCR o que também está correto vamos deixar esta nominação para Reverse Transcriptase PCR e usar o qPCR PCR Quantitativo em Tempo Real ou o que é menos comum qRTPCR para o PCR em Tempo Real Quantitativo 144 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA 421 Metodologia O PCR em Tempo Real seguirá o procedimento desenvolvido no método de PCR tradicional apresentando as três fases que caracterizam a maioria das cinéticas enzimáticas a Fase de Crescimento Exponencial possui grande especificidade e precisão o Crescimento Linear caracterizada pelo consumo dos produtos da reação inicia o processo de degradação e a Fase Estacionária é atingido elevado nível de degradação dos produtos de PCR e por isso marca o final da análise Figura 41 Uma das bases do qPCR são os compostos fluorescentes adicionados ao mix de reação e que geram o sinal de fluorescência Sendo o sinal diretamente proporcional à quantidade do produto que será amplificado em cada ciclo de reação a quantificação deverá ser apresentada na forma gráfica Quando se tem um perfil gráfico típico como o apresentado no PCR em Tempo Real a fase do crescimento exponencial é exatamente aquela que apresenta uma eficiência elevada e portanto a mais confiável para os estudos uma vez que a quantidade de produto formado é a mais consistente Desta forma em geral os dados de fluorescência são reconhecidos desde o início da fase de amplificação Para a correta interpretação dos resultados é importante a definição do conceito de Baseline Ponto CT Cycle Threshold e Threshold Figura 41 a Baseline é o limiar mínimo que detecta o sinal de fluorescência consistindo nos ciclos iniciais do método de PCR nos quais acontece uma pequena mudança no sinal de fluorescência em geral entre os ciclos 3 e 15 b Ponto CT número de ciclos necessários para que a fluorescência seja detectável é onde a fluorescência ultrapassa o Threshold ou ponto onde o Threshold cruza com a linha de amplificação e que possibilita fazer a correspondência do aumento da fluorescência com a quantidade inicial do DNA alvo c Threshold linha paralela ao eixo que se refere ao número de ciclos abscissas a qual será traçada na altura de início da fase exponencial da amplificação número mínimo de ciclos para amplificação O valor mínimo deste parâmetro será diretamente proporcional à quantidade de DNA presente no início da amplificação Assim quanto menor for a amostra inicial um maior número de ciclos será necessário para gerar o aumento exponencial do sinal acima da baseline 145 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA Figura 41 Fases do QPCR e Conceitos Interpretativos Fonte Elaborada pelo autor 2021 Como foi mencionado a metodologia de PCR em Tempo Real se vale de métodos químicos de fluorescência e estes podem ser variados mas estarão baseados em um composto fluorescente sendo possível detectar seu sinal ao longo do processo por um laser do equipamento de qPCR chamado de termociclador Figura 42 Figura 42 Funcionamento do Termociclador Fonte Elaborada pelo autor 2021 Os métodos serão divididos em dois grandes grupos em função do tipo de composto ou estrutura fluorescente que determinará o comportamento de emissão da 146 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA fluorescência sendo eles de Corantes Intercalares e de Sondas de Sequência Específica Os equipamentos precisam estar aptos a trabalharem com os filtros específicos para as moléculas fluorogênicas Quando se tem um equipamento de ponta ele possui 5 filtros de excitação e emissão tendo a capacidade de ser calibrado para as moléculas de SYBR Green e os derivados para os reporters FAM VIC JOE NED ROX Texas Red Cy3 Cy5 e HEX e quencher TAMRA Diversos fatores podem influenciar na eficiência do processo tais quais a extensão do que se pretende amplificar a existência de estruturas secundárias o desenho dos primers a presença de inibidores da PCR como hemoglobina heparina ureia íons cálcio etc NA PRÁTICA DA SAÚDE O PCR em Tempo Real tem sido amplamente utilizado na área da saúde por apresentar uma série de vantagens em relação ao PCR Tradicional tendo ganhado destaque com a pandemia por COVID19 Este vídeo reúne muitos conceitos trabalhados na unidade e solidifica conceitos básicos importantes para o entendimento deste processo além de outros trabalhados em nosso cader no Aproveite Link httpswwwyoutubecomwatchvThG02miq4 4211 Corantes Intercalantes Os Corantes Intercalantes são fluorocromos que não apresentam especificidade para sequência específica no DNA Desta forma vão se intercalar na dupla fita de qualquer produto gerado pelo PCR permitindo sua detecção Com o desenho correto dos primers somente a sequência de interesse gerará o produto onde o fluorocromo vai se ligar O primeiro sistema criado dentro deste princípio foi o SYBR Green Em seguida foram desenvolvidos LCGreen Plus e EvaGreen 147 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA a SYBR Green Tem como fundamento a capacidade de moléculas que se ligam covalentemente na dupla fita de DNA e uma vez excitadas farão a emissão da fluorescência de cor verde a qual será captada e convertida em quantidade de DNA Este composto fluorescente não interfere na atividade das DNA Polimerases nem de outras enzimas que podem ser usadas posteriormente Além disso é muito utilizado para detecção de amostras com baixo número de cópias de DNA Uma vantagem adicional desta técnica é que o SYBR Green mesmo sendo mutagênico é de fácil remoção e mais seguro que o brometo de etídeo por exemplo No início do processo a fluorescência é bem reduzida isso porque as moléculas fluorescentes livres não estão ligadas ao DNA dupla fita e desta forma o sinal emitido é muito baixo À medida que se inicia a amplificação pela ação da DNA Polimerase a molécula de fluorocromo vai começar a se ligar na dupla fita que foi sintetizada e ao final de cada ciclo a fluorescência será quantificada e o DNA amplificado vai ser determinado Esta tecnologia apresenta alta sensibilidade e também um custo reduzido com grande facilidade de manuseio de etapas e componentes Os pontos questionáveis da técnica acontecem porque o composto fluorescente pode se ligar a toda dupla fica durante a reação da polimerização incluindose o dímero primerDNA alvo e outros produtos inespecíficos o que significa a possibilidade de acontecer um número subestimado da molécula alvo Outro ponto a se considerar é a questão de otimizar o processo para a detecção do SYBR Green o qual é extensivo uma vez que ele não é específico para a sequência alvo e sim para uma dupla fita recémformada Então apesar de ser uma técnica fácil e barata a otimização para validação dos resultados pode levar mais tempo do que se pretende Figura 43 Figura 43 Sybr Green A Separação da Dupla Fita B Ligação do Primer e do Sybr Green C Ligação de Várias Moléculas de Sybr Green com Emissão de Sinal Luminoso Fonte Elaborada pelo autor 2021 148 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA b LCGreen Plus Este corante apresenta uma sensibilidade elevada nos produtos gerados pelo PCR e o fazem em T2 mais reduzida diferentemente do SYBR Green Este corante é utilizado preferencialmente quando se parte para uma análise da técnica conhecida como High Resolution Melting HRM Abrindo um pequeno parêntese a HRM consiste na adição de um corante os de 3a geração como LCGreen à mistura do PCR e que vai emitir a fluorescência intercalandose na dupla fita formada Após este processo o termociclador executa a HRM que consiste no aumento da temperatura de forma gradativa entre 70º C e 90º C com o objetivo de dissociar a dupla fita de DNA gerando a curva de decaimento da fluorescência a qual é captada pelo sensor do equipamento e uma curva de dissociação curvas de melting associando esta com o material amplificado Uma das vantagens da técnica é que torna possível a detecção de heteroduplexes os quais são formados durante a PCR muito utilizado na detecção de SNPs de inserções e deleções c EvaGreen Este corante apresenta muitas vantagens em relação aos anteriores destacando se a intensidade da fluorescência gerada e uma forte estabilidade térmica e hidrolítica tanto em condições alcalinas quanto ácidas Como se assemelha ao SYBR Green quanto à absorção e emissão as configurações otimizadas para este último servem para o EvaGreen 4212 Sondas de Sequência Específica Neste tipo de técnica são utilizadas sondas compostas de oligonucleotídeos em cujas extremidade fluorocromos serão adicionados as quais apresentam especificidade para a sequência alvo que se deseja amplificar Dentro deste princípio existem a sonda primer Scorpion a Sunrise Sonda de Hibridização FRET e o sistema de sondas TaqMan que será foco de estudo deste caderno No sistema TaqMan como a sonda é composta de desoxirribonucleotídeos e reconhece a sequência alvo ela precisa ser complementar a esta sequência possibilitando 149 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA então a hibridização por complementariedade A técnica permite o monitoramento dos resultados em tempo real Antes de iniciarmos a descrição desta técnica entenderemos o conceito de Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET o qual define que a propriedade de interação dos marcadores fluorescentes será determinada pela distância física entre eles Estes marcadores consistem em uma molécula doadora Reporter R que vai emitir a energia e outra a molécula receptora Quencher Q que absorve a energia levando à extinção da fluorescência Esta capacidade de interação mútua será determinada por uma sobreposição espectral o comprimento de onda onde ambas emitem ou absorvem a radiação e também pela distância física entre as duas Figura 44 Figura 44 Sonda TaqMan Fonte Elaborada pelo autor 2021 No sistema de sonda TaqMan a distância entre o reporter R e o quencher Q pode variar mas devem estar a uma distância onde a proximidade impede a emissão pelo reporter já que está sendo absorvida pelo quencher Uma vez rompida esta proximidade a fluorescência do reporter não será absorvida acontecendo sua emissão O sistema de sondas TaqMan lança o que se chama de oligosondas fluorogênicas destinadas a detectar sequências específicas no DNA à medida que são amplificadas nos ciclos do PCR em Tempo Real O que torna possível a tecnologia com este tipo de sonda é a atividade exonucleásica da Taq DNA Polimerase a qual ocorrerá no sentido 53 Relembrando atividade exonucleásica significa que a enzima vai retirar nucleotídeos pelas pontas Como a orientação é 53 a enzima iniciará a retirada na extremidade 5 removendo conforme se encaminha para a extremidade 3 Além disso podemos observar que a enzima possui atividade dupla de polimerase e nuclease O sistema apresentará elementos básicos do PCR incluindo aí os primers que vão flanquear a sequência de interesse O diferencial está na sonda contendo os elementos fluorogênicos R e Q A sonda deste sistema apresentará em sua extremidade 5 uma molécula do fluorogênico chamado de reporter R e na extremidade 3 a molécula do quencher Q que recebe a energia da molécula do reporter Q dissipandoa na forma de luz ou calor Como na sonda as moléculas R e Q estão próximas fisicamente o Q suprime a emissão da 150 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA fluorescência pelo R Na técnica haverá os ciclos tradicionais Em T2 acontecerá a hibridização dos primers um para cada fita também a hibridização da sonda TaqMan na sequência alvo Na etapa seguinte a Taq DNA Polimerase começa a polimerização a partir dos primers quando encontra a sonda TaqMan Para continuar seguindo sua polimerização ela removerá a sonda da sua frente e o 1o nucleotídeo da sonda é o que tem o R preso Ao deslocar este nucleotídeo o reporter se afasta do quencher e com isso acontece um aumento exponencial da intensidade da sua fluorescência em um nível que permite sua detecção ultrapassando o limiar CT Esta relação inversa entre o número inicial das moléculas de DNA com o valor de CT é a base para o cálculo do PCR em Tempo Real Figura 45 Figura 45 Dinâmica do qPCR Denaturation Desnaturação Annealing Anelamento Light Luz Reporter Dye Corante Reporter Fluorescence Signal Blocked Sinal de Fluorescência Bloqueado Probe Hybridization Hibridização da Sonda Elongation Alongamento Fluorescence Signal Sinal de Fluorescência Probe Degradation Degradação da Sonda Fonte Shutterstock 2021 Uma análise importante usando este tipo de sonda é o Ensaio de Discriminação Alélica que permite avaliar comparativamente genes ou sequências presentes em ambos os cromossomos avaliados Para tal constroemse duas sondas assumindo duas formas possíveis para sequência que se pretende analisar cada uma com um reporter diferente Em geral utilizase muito este tipo de análise para verificar presença de regiões de SNPs No caso em uma análise rápida o fato de acender apenas um reporter indica 151 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA homozigose acendendo ambos os reporters é indicativo de heterozigose Tal análise possui muito valor agregado na investigação de heterozigose para doenças autossômicas recessivas Por que é importante detectar indivíduos heterozigotos que não vão manifestar portanto uma patologia autossômica recessiva Porque para a prática do Aconselhamento Genético o heterozigoto é normal mas portador do gene que leva à patologia podendo passar esta cópia para futuras gerações Assim o ensaio citado é muito importante na prática médica e laboratorial Figura 46 Ensaio de Discriminação Alélica Com qPCR Fonte Elaborada pelo autor 2021 A tecnologia de sonda TaqMan se mostrou extremamente específica na determinação da existência ou não de sequências investigadas uma metodologia muito rápida de execução de elevada sensibilidade com igualmente elevada precisão e ainda apresenta risco baixo de contaminação É um processo automatizado que não precisa de amostra amplificada anteriormente para ser detectada eou quantificada além de permitir múltiplas análises de forma simultânea o chamado Ensaio de Reações Multiplex possível através da construção de sondas específicas cada qual com seu próprio e específico reporter Os pontos negativos se concentram nos seus custos uma vez que o processo requer duas moléculas fluorogênicas reporter e quencher que presam estar ligadas às extremidades da sonda o planejamento para otimização também demanda grande atenção e trabalho porque vai combinar a variável amplificação do DNA alvo e hidrólise da sonda com o máximo de eficiência possível 152 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA 43 SEQUENCIAMENTO AUTOMÁTICO O sequenciamento de DNA é ferramenta fundamental em várias abordagens passando pela clonagem indo pela caracterização de patógenos sequenciamento de genes para observação de mutações análises de SNPs e muitas outras abordagens O sequenciamento como se conhece atualmente foi sendo desenvolvido a partir do método criado em 1977 pelo bioquímico Fred Sanger e seus colaboradores tendo como um dos alicerces a utilização dos didesoxinucleotídeos ddATP ddGTP ddCTP ddTTP ou o conjunto dos quatro como ddNTP método que ficou conhecido como Método de Sanger ou Método de Terminação de Cadeia o qual consiste na síntese in vitro de DNA com comprimento variável Antes de começar a descrever o Método de Sanger fazse necessário focar na função do ddNTP Para isso resgataremos conceitos já aprendidos em outras disciplinas Quando um nucleotídeo é encaixado em outro através da ligação fosfodiéster acontece o envolvimento do grupamento fosfato do carbono 5 de um com a hidroxila OH do carbono 3 do outro Percebese que a presença da hidroxila no carbono 3 é condição obrigatória para que a ligação ocorra No sequenciamento serão utilizados didesoxinucleotídeos os quais são compostos que não apresentam também a hidroxila no carbono 3 e toda vez que forem encaixados em uma cadeia nascente fica impossível adicionar desoxinucleotídeos posteriormente Figura 47 Figura 47 Didesoxinucleotídeo Como se observa a Hidroxima do carbono 3 não está presente Este é um ddGTP mas a estrutura básica da falta da Hidroxila vale para todos os ddNTP Fonte Adaptada pelo autor a partir de Shutterstock 2021 153 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA Na metodologia desenvolvida por Sanger quatro tubos de reação são preparados contendo tudo o que é necessário para o encadeamento nucleotídico mas com uma diferença o tipo de ddNTP em cada tubo será diferente Então em um terá ddATP no outro ddGTP em um terceiro ddCTP e no quarto e último ddTTP Todos eles eram marcados radioativamente e hoje são marcados com corante fluorescente Segue o que é comum a todos os tubos a Molde de fita simples do DNA para ser sequenciado b Um primer c DNA Polimerase d Os quatro desoxinucleotídeos dATP dGTP dCTP e dTTP Em cada tubo ocorrerá a polimerização pela DNA polímeras A partir da hibridização do primer os desoxinucleotídeos serão adicionados até que aconteça a adição de um didesoxinucleotídeo sendo neste momento a polimerização do fragmento interrompida O que resulta ao final do processo Em cada tubo serão formados fragmentos de todos os tamanhos possíveis mas nunca do mesmo tamanho entre os tubos tendo na extremidade o ddNTP correspondente de cada tubo Na metodologia de Sanger posteriormente se fazia um gel de poliacrilamida bem fino o qual era colocado em contato com um filme de RaioX para análise posterior do sequenciamento A leitura do gel no filme de RaioX é feita de baixo para cima porque se começa pelo início da sequência o que representa o fragmento menor Como em cada coluna do gel se corre a amostra de um dos 4 tubos é possível saber qual o nucleotídeo presente A técnica inicial sofreu inúmeros aprimoramentos e modificações e atualmente o sequenciamento é referido como Sequenciamento Automático em que equipamentos robóticos fazem a mistura dos reagentes aplicam as amostras organizam a ordem das bases e fazem a leitura do mesmo Isto se tornou possível uma vez que os ddNTPs passaram a ser marcados com agentes fluorescentes de diferentes cores não necessitando mais de 4 reações separadamente Além disso após a polimerização feixes a lazer excitam os compostos que são detectados e ordenados da forma correta com um computador gerando a sequência para posterior avaliação No início os sequenciadores eram em placa de gel depois surgiram os capilares Embora seja o mesmo princípio básico houve evolução nesta mudança Figura 48 154 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA Figura 48 Sequenciamento Automático A Preparação para ligação de primer e DNA alvo e a marcação fluorescente de cada ddNTP B DNA Polimerase se liga ao primer DNA alvo C Primer é estacado até a representação vermelha e todos os fragmentos possíveis são formados com o ddNTP marcado na ponta permitindo que o laser faça a leitura e determine a sequência D Leitura que o Sequenciador Automático fornece em amostras sub metidas ao sequenciamento não representa o exemplo da sequência hipotética vista em C Fonte Shutterstock 2021 155 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA O chamado Sequenciamento de Nova Geração NGS Sequenciamento Massivo em Paralelo MPS ou Sequenciamento de Alta Performance são os atuais termos utilizados para um grupo de tecnologias mais modernas no sequenciamento de DNA Estas tecnologias passaram a permitir o sequenciamento muito mais rápido muito mais barato e por esta razão permite rápida evolução e aplicação dos seus resultados Os sequenciadores que pertencem a esta classificação podem ler bilhões de fragmentos simultaneamente SUGESTÃO DE VÍDEO O sequenciamento é ferramenta fundamental para detecção de muitos parâ metros tanto na área da saúde quanto na área biotecnológica Foi um método que nasceu em 1997 e com o passar do tempo aprimorouse sendo hoje peça fundamental em todos os estudos genéticos Para melhor entendimento segue o vídeo ilustrativo da técnica de sequenciamento automático Acesse o link httpswwwyoutubecomwatchvwdS3j0TgbjMlistPLDM5pg2LGBtnJHnVzdO2iTqG2QH FbTtcindex5 431 Aplicações O sequenciamento pode ser utilizado nas mais diversas abordagens tanto na área da saúde quanto na biotecnologia A seguir veremos algumas destas abordagens 156 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA 4311 Diagnóstico de Doenças Genéticas Como já foi amplamente mencionado em outras disciplinas as doenças genéticas são provocadas por alterações em nosso DNA seja afetando diretamente as sequências codificantes éxons ou as não codificantes íntrons mecanismos reguladores e etc Uma gama de proteínas das mais diversas podem ser afetadas bem como certo mecanismo fundamental de alguma via metabólica A identificação destas mutações através do sequenciamento é de suma importância para se comprovar a patogenicidade de alguma doença e se houver tratamento para a forma detectada planejar a abordagem terapêutica monitorar através de testes posteriores a saúde do paciente Não podemos esquecer também que o sequenciamento é poderosa ferramenta para avaliar mutações que aumentam a predisposição para o desenvolvimento de alguma patologia antecipandose ao problema e com isso trazendo a possibilidade de o indivíduo aumentar a periodicidade médica bem como exames complementares e autoexame quando for possível Estas mutações estão amplamente descritas na literatura No quadro abaixo seguem exemplos de alguns dos genes sequenciados com a patologia correspondente Quadro 3 Alguns dos Genes Sequenciados e as Patologias a Eles Associadas GENES PATOLOGIA BRCA 1 BRCA 2 CDH1 CDK4 CDKN2A Câncer de mama e ovário RB1 Retinoblastoma BRCA1 BRCA2 BRIP1 CDK12 Câncer de próstata MLH1 MSH2 MSH6 PMS2 Formas nãopoliplóides de câncer colorretal MEN1 e RET Neoplasias endócrinas HAMP HFE HFE2 SLC40A1 TFR2 Hemocromatose Hereditária CD27 CR2 CTLA4 IL21R LRBA Imunodeficiência Comum Variável DLD OGDH SLC25A19 Deficiência de αcetoglutarato desidrogenase Chama a atenção o fato de algumas patologias possuírem muito mais genes analisados citados aqui apenas alguns como no câncer de mama e ovário de próstata e outros Fonte Elaborado pelo autor 2021 157 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA PARA REFLETIR O sequenciamento automático nos permite avaliar a presença de mutações que podem indicar um aumento da probabilidade de desenvolver determinada patologia Neste caso a biologia molecular se antecipa ao problema No entanto existem os que defendem que saber com antecedência é sofrer por algo anteci padamente e que sequer é garantido que vai acontecer Qual a sua posição sobre os testes preditivos Discuta com seu grupo e faça uma reflexão enquanto paciente mas também como futuro profissional da área da saúde 4312 Diagnóstico de Doenças Infecciosas Este sequenciamento envolverá a caracterização dos patógenos virais bacterianos fúngicos e parasitários Pode visar apenas à confirmação do agente mas existem muitas abordagens na tipificação e genotipagem das diferentes variantes presentes As técnicas podem ser aplicadas para humanos plantas e outros animais Um exemplo clássico é o sequenciamento do HIV1 que está infectando o paciente isto porque muitas variantes drogaresistentes estão presentes e através do sequenciamento o médico sabe qual mecanismo prescrever e qual não indicar tudo em função dos dados de sequenciamento de dois genes virais São sequenciados os genes da protease viral completo e da transcriptase reversa porção inicial Então ocorre uma transcrição reversa e o sequenciamento do cDNA dos genes citados sendo estas sequências comparadas com cepa referência de resistência aos antirretrovirais No Quadro 4 seguem algumas das mutações com as respectivas resistências lembrando que a mutação é dada pela mudança no aminoácido por exemplo escrever P500L significa que a prolina da posição 500 com a mutação foi substituída por uma leucina 158 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA Quadro 4 Algumas das Mutações nos Genes da Transcriptase Reversa e da Protease com suas Respec tivas Resistências MUTAÇÃO MEDICAMENTO NÃO SUGERIDO Transcriptase Reversa M184V Lamivudina V75T Estavudina T69D Zalcitabina Protease G48V Saquinavir L90M Saquinavir D30N ou três de quaisquer mutações M36I M46IL A71VT V77I I84V N88D L90M Nelfinavir Fonte Elaborado pelo autor 2021 4313 Clonagem Quando se trabalha com a clonagem gênica não só na pesquisa como também na construção de algum produto comercializável é fundamental seu sequenciamento para se ter certeza de que a manipulação do gene de um vetor sua purificação e inserção em outro organismo não causou a mudança de nenhum nucleotídeo o que inviabilizaria todas as etapas feitas ocasionando o reinicio do trabalho Ou seja é um controle de qualidade crucial para estas áreas obterem sucesso com o objetivo planejado 44 DNA MICROARRAY E CHIP DE DNA A Biologia Molecular assim como diversas áreas do conhecimento está em constante evolução O conhecimento e descoberta de novos genes e sequências 159 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA importantes do nosso genoma acabou levando ao desenvolvimento de uma tecnologia que permitisse a análise da expressão de milhares de genes eou sequências de interesse em um único mecanismo e isto levou ao desenvolvimento da tecnologia conhecida como DNA Microarray ou Chip de DNA ao longo do nosso caderno vamos usar ambos os termos Basicamente é uma metodologia baseada na fixação de sondas de ácidos nucleicos em lâminas sólidas de forma ordenada em áreas específicas que se denominam spots Em cada spot existem milhões de cópias das sondas as quais permitirão a identificação de sequências específicas de cDNA originado da transcrição reversa de um RNAm complementar a esta sequência que foi fixada na lâmina Figura 49 Para o desenvolvimento desta tecnologia contribuiu bastante o surgimento de sistemas robotizados que puderam criar estas lâminas com grande número de spots e também o desenvolvimento dos métodos de detecção de fluorescência que aumentaram significativamente a sua sensibilidade de captar as medidas dos sinais gerados pelos fluoróforos Figura 49 DNA Microarray Fonte Shutterstock 2021 Assim o estudo de sequências gênicas utilizando a tecnologia de DNA Microarray será realizado através da mensuração dos valores da expressão gênica sendo ela relacionada diretamente com a quantidade de RNAm existente na célula A expressão gênica pode ser resultado de inúmeros experimentos condições tipos celulares e tantas outras variáveis as quais podem ser estudadas com esta ferramenta A estrutura dos chips de DNA se constitui de pequenos suportes sólidos de 1 a 5 cm2 em que é possível imobilizar as sequências de DNA que se constituem nas sondas O material para este objetivo é preferencialmente o vidro mas pode ser feito em nylon ou silício Cada chip pode variar no número de locais de testes os spots e estes também podem apresentar tamanho variável normalmente entre 10 até 500 micrometros µm sendo que cada spot possui apenas sondas de um determinado tipo 160 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA 441 Metodologia do DNA Microarray A metodologia que envolve o resultado obtido através do uso do DNA Microarray abrange o preparo das amostras específicas para esta tecnologia a etapa de exposição desta amostra para hibridização nas sondas e o fechamento com a detecção e interpretação dos resultados Antes de continuarmos relembraremos sobre as sondas que são aprisionadas nos spots do chip As sondas sempre serão complementares à sequência de interesse que se quer identificar uma vez que o objetivo destas é aprisionar a sequência que foi expressa e que será objeto da investigação Uma das abordagens mais importantes desta tecnologia é a análise de hibridização comparativa algumas vezes tratada como competitiva a qual envolve a análise de duas amostras distintas simultaneamente em que se avalia o cDNA obtido de amostras teste desconhecida e uma amostra de referência comparativa O primeiro passo é a obtenção da amostra de RNA total como descrito em outra unidade do nosso caderno das amostras celulares utilizadas para investigação Após obtenção do RNAm total ocorrerá uma transcrição reversa utilizando a Transcriptase Reversa porém a população do cDNA formado de cada amostra celular será marcada com corantes de cores diferentes permitindo assim a distinção da origem do RNAm total Esta diferenciação é possível exatamente porque os nucleotídeos serão marcados com as moléculas fluorescentes e ao serem encadeados pela Transcriptase Reversa gerarão um cDNA marcado com a cor correspondente Muitos corantes fluorescentes estão disponíveis no mercado mas para esta tecnologia temse mostrado extremamente útil e precisa a utilização dos marcadores cianina 3 e cianina 5 Cy3 e Cy5 respectivamente Os dois grupos de moléculas de cDNA formados possuirão espectros de emissão e excitação diferentes o que vai permitir a quantificação diferenciada após a hibridização Então depois de formar o cDNA as amostras podem ser misturadas e aplicadas no DNA Microarray para que hibridizem nas sondas correspondentes Após a incubação a lâmina será lavada para retirar toda a amostra de cDNA que não hibridizou No passo seguinte haverá a exposição a um scanner de laser o qual têm como função excitar os corantes fazendo com que eles emitam a sua fluorescência correspondente Assim cada spot reflete a atividade transcricional que ocorreu nas condições determinadas pelo estudo Os spots que emitiram a fluorescência refletem a ligação 161 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA das sequências de interesse em suas respectivas sondas de reconhecimento sendo a intensidade de emissão das radiações em cada spot estimada através de software específico para posterior análise 442 Aplicações do DNA Microarray 4421 Investigação de Alvos Terapêuticos A Investigação de Alvos Terapêuticos é uma das aplicações mais utilizadas através do Chip de DNA Para o entendimento de sua aplicabilidade trabalharemos um exemplo hipotético que auxiliará didaticamente este esclarecimento Um médico precisa ter o entendimento de qual seria o melhor alvo terapêutico diante de um tumor maligno X e para tal necessita saber qual ou quais proteínas precisam ser atacadas através de medicamentos específicos para o objetivo pesquisado Ele faz a coleta de células saudáveis chamadas de Amostra 1 e de células tumorais chamadas de Amostra 2 O próximo passo é extrair o RNAm total das amostras e em seguida fazer o cDNA das duas Porém utilizarseão na Amostra 1 nucleotídeos com fluoróforos verdes e na Amostra 2 nucleotídeos com fluoróforos vermelhos para se construírem cDNAs verdes da Amostra 1 e cDNAs vermelhos da Amostra 2 Na sequência misturamse as amostras e ambas são aplicadas na lâmina referente ao DNA Microarray o qual possui milhares de spots com as sondas representando muitos genes possíveis de serem analisados Passado o tempo de incubação a lâmina será lavada para retirar o que não hibridizou nas sondas e em seguida o scanner passará com irradiação em sequência de um laser verde e depois de um vermelho sendo a razão entre as duas cores calculada As tabelas com os valores são criadas em função do que foi hibridizado apresentando uma relação com os níveis de expressão em cada condição das Amostras 1 e 2 Na interpretação spot em verde significa que são genes expressos nas células normais e o que for em vermelho será representação das células tumorais Não se podem descartar genes que são expressos em ambas as condições eles aparecerão em amarelo sobreposição do verde e do vermelho Figura 50 162 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA O médico focou nos spots que se apresentaram apenas em vermelho Por que não nos amarelos ou verdes Ficou claro que os produtos gênicos indicados pelos spots verdes como só se expressam nas células normais não teriam sucesso com uma terapia agindo nestas proteínas portanto é injustificável colocálas como alvo terapêutico As proteínas da expressão indicada pelos spots amarelos até poderiam ser alvo mas a terapia atingiria também células normais com efeitos adversos que poderiam piorar ainda mais a saúde do paciente Caso não se observassem spots apenas em vermelho os produtos gênicos indicados por estes spots seriam desta forma os melhores e mais indicados alvos terapêuticos Tal abordagem costuma ser chamada de Custom Drug Selection isto é uma Terapia Individualizada baseada na investigação da expressão individual de genes frente a alguma patologia Figura 50 Leitura do DNA Microarray Fonte Shutterstock 2021 SUGESTÃO DE VÍDEO A técnica de DNA Microarray apresenta muitas vantagens em termos de diagnóstico além de abrir enorme campo de investigação de alvos terapêuticos a ponto de permitir o que se define como uma terapia individualizada Vamos relembrar o que foi abordado neste enfoque do Custom Drug Selection através deste ótimo vídeo que vai direto ao ponto httpswwwyoutubecomwatchv6ZzFihESjp0 163 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA 4422 Farmacologia Com o DNA Microarray é possível o desenvolvimento e aprimoramento de novos medicamentos isto porque analisando a intensidade do perfil de expressão é possível saber se o medicamento conseguiu diminuir ou até bloquear a expressão do gene correspondente Em um estágio mais avançado também se podem determinar efeitos positivos e adversos que os medicamentos possuem em organismos normais e organismos doentes 4423 Investigação de SNPs Os SNPs são utilizados para identificar entre indivíduos da mesma espécie as posições nos genomas que apresentam as variações polimórficas conhecidas como Single Nucleotide Polymorphisms ou Polimorfismos de um Único Nucleotídeo São variações importantes uma vez que além de permitirem diferenciar grupos de indivíduos na mesma espécie auxiliando nos exames de vínculo genético podem indicar os efeitos medicamentosos diferenciados entre os indivíduos além de apontar em alguns casos o aparecimento de patologias que acontecem com a troca de apenas um nucleotídeo 4424 Investigação da Dinâmica de Patógenos A Investigação da Dinâmica de Patógenos tem sido cada vez mais utilizada no estudo de patógenos e suas interações com o ser humano mas se usa também na veterinária sendo uma das vantagens a possibilidade da detecção de inúmeras cópias 164 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA das mais variadas de forma simultânea A tecnologia torna possível construir o perfil da expressão gênica de organismos patogênicos fundamental para entender o processo adaptativo pelo qual este agente passa para ter seu poder de infecção bemsucedido envolvendo o aumento de expressão de vários genes consequentemente da produção de uma gama de proteínas características Ao traçar este perfil possibilitase a identificação dos principais alvos terapêuticos visto que o aumento de expressão de um ou mais genes pode estar indicando que a proteína resultante deste aumento é parte importante para o processo infeccioso acontecer e perdurar como também para traçar as adversidades que gera no organismo infectado Com esta abordagem podese desenvolver uma gama de novos medicamentos pois o agente infeccioso pode ser cultivado na presença dos princípios ativos de medicamentos testes e com o auxílio do Chip de DNA é possível monitorar as alterações nos níveis de expressão gênica Vale lembrar que as análises destes estudos podem acontecer em paralelo com a avaliação das células do hospedeiro Desta forma além de monitorar alvos no agente patogênico fará o monitoramento dos efeitos destes novos medicamentos nas células humanas sabendo se os efeitos colaterais são justificados para o uso medicamentoso de novos agentes químicos A análise da expressão gênica do hospedeiro também é fundamental neste entendimento porque permite monitorar os genes envolvidos no mecanismo de defesa do hospedeiro Traçar este paralelo entre a infecção e a resposta auxilia bastante no prognóstico de evolução fornecendo informação sobre os mecanismos de patogenicidade do invasor e o movimento gênico do hospedeiro São abordagens que abrem um vasto campo para entender e traçar uma assinatura genética de cada microrganismo patogênico 4425 Detecção de Microrganismos O uso desta ferramenta tem se ampliado para a identificação e genotipagem de microrganismos É um método confiável e rápido para diagnóstico o qual pode ser aplicado não apenas nas análises clínicas mas na área ambiental alimentícia veterinária entre outras Atualmente as estratégias visam aperfeiçoar a capacidade de detecção e 165 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA os protocolos laboratoriais trabalhando dentro da especificidade do método para que a reprodutibilidade seja máxima Um grupo que vem sendo bastante estudado é o viral Vários tipos têm sido detectados através do Microarray expandindose não somente para detecção do tipo mas de todas as suas variantes genéticas HUA 2015 Da mesma forma que se utiliza para vírus também tem sido empregado para bactérias a detecção de Escherichia coli além de outras bactérias entéricas patogênicas Esta ferramenta tem se mostrado ser uma abordagem promissora para caracterização de cepas da mesma espécie DILL 2009 MILLER 2009 45 CAPTURA HÍBRIDA A tecnologia de Captura Híbrida é um teste de Biologia Molecular qualitativo e quantitativo que terá como princípio molecular a hibridização de sondas de RNA na detecção de DNA de agentes patogênicos Na presença de material do patógeno a sonda de RNA vai se ligar e formar o híbrido DNARNA por complementariedade de bases Os híbridos formados e capturados serão detectados através de reação envolvendo enzima e o substrato com a análise da reação feita por quimioluminescência 451 Metodologia O teste de Captura Híbrida consiste no ensaio que detém anticorpos de hibridização daí se deriva o nome da técnica com a amplificação do sinal que será gerado Basicamente a técnica vai consistir na desnaturação da amostra de ácidos nucleicos na incubação com as sondas de RNA para formação dos híbridos caso a amostra seja positiva na captura dos híbridos RNADNA na adição do conjugado para reação com os híbridos capturados na lavagem da placa de Captura Híbrida finalizando na detecção dos híbridos por quimioluminescência Vale chamar atenção que o sistema só vai capturar híbridos RNADNA Figura 51 166 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA Figura 51 Etapas da técnica de Captura Híbrida Fonte Elaborada Pelo Autor 2021 Quando se trata de agentes infecciosos sanguíneos como citomegalovírus as amostras de DNA serão obtidas como já descrito e posteriormente serão desnaturadas para separação da dupla fita em geral usando alta temperatura e uma solução de NaOH com pH entre 13 e 14 Já as amostras para diagnóstico para HPV Clamídia Gonococos e Herpes Vírus serão preparadas no próprio tubo de coleta específico para a técnica e posteriormente desnaturadas para separação da dupla fita 167 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA Com a obtenção das amostras e separação da dupla fita desnaturação elas serão colocadas em contato com uma solução que contém as sondas de captura híbrida solução em tampão que torna o pH neutro as quais são moléculas de RNA complementares às regiões dos patógenos que se pretende detectar Caso a amostra seja positiva haverá a hibridização destas sondas nas amostras de DNA obtidas O próximo passo é a adição da mistura na placa de captura híbrida para que ocorra a captura dos híbridos Isto é possível porque na superfície dos poços da microplaca existem anticorpos monoclonais universais específicos na captura destes híbridos RNADNA etapa que em geral dura 1 hora na temperatura entre 20 e 25oC Em seguida os híbridos agora imobilizados reagirão com uma solução contendo anticorpos monoclonais antiRNADNA específicos os quais estão conjugados com a fosfatase alcalina Estes anticorpos vão se ligar aos híbridos capturados tempo em torno de 30 minutos em seguida a placa será lavada para remoção de tudo o que não foi hibridizado eou aprisionado Depois da lavagem e secagem da placa será adicionada em cada poço uma solução com substrato quimioluminescente que reagirá com a fosfatase alcalina e clivado com emissão de uma luz a ser medida em Unidades Relativas de Luz URL em um equipamento chamado Luminômetro sendo a luz emitida o indicativo da presença ou ausência de DNA alvo na amostra Os valores lidos serão transmitidos a um computador no qual um software específico fará os cálculos de validação do teste além da quantificação dos controles positivos negativos e da amostra analisada Feito isto o próprio programa vai gerar o laudo para impressão A duração da técnica do seu início até ser finalizada será em torno de 4 horas 452 Vantagens da Captura Híbrida A técnica será executada em microplacas do tipo enzimalike facilitando o manuseio pela maioria dos profissionais de laboratórios que já estão familiarizados com elas o que se reflete em menos tempo de treinamento e rápida adaptação O espaço laboratorial para a realização da técnica não precisa ser reservado ou com equipamentos extras de ponta Como o sistema é fechado a possibilidade 168 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA de contaminação cruzada neste espaço é baixíssima e em função disso tudo o custo de investimento em espaço é muito pequeno Como o tempo de execução da técnica é relativamente curto 4 horas é possível a liberação dos laudos no mesmo dia com resultados consistentes e seguros As amostras não precisam de técnicas de preparo extremamente elaboradas o que facilita o custo e a padronização da técnica Na técnica as sondas de RNA são longas e de alta capacidade de hibridização o que acarreta um aumento na sensibilidade do teste O rápido tempo que foi mencionado permite que se agilize a conduta terapêutica Este método de amplificação dos híbridos que são formados determinará com precisão a quantidade real dos patógenos que estão presentes Uma vez que não apresenta contaminação na coleta e no processamento das amostras não acontecem testes falsopositivos A técnica não utiliza enzimas como polimerase para aumento de amostra então a presença de enzimas proteolíticas que se encontram em diferentes tecidos como no colo uterino não induze o aparecimento de testes falso negativos O Teste de Captura Híbrida é aprovado pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária ANVISA e pelo Food and Drugs Adminstration FDA dos Estados Unidos da América 453 Captura Híbrida e o HPV Existe uma clara associação entre o Papilomavírus Humano HPV e o câncer o que levou a desenvolvimentos tecnológicos muito importantes para detecção e caracterização destes agentes patogênicos incluindo aí os testes moleculares Os testes moleculares são capazes de identificar a presença do vírus mesmo nos pacientes que se apresentam assintomáticos e ainda fazem a separação de vírus de baixo risco dos de alto risco Desta forma os testes moleculares se tornaram extremamente importantes na identificação de mulheres que apresentam uma maior probabilidade de desenvolver lesões précancerosas auxiliando no combate ao câncer do colo de útero Os testes 169 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA passaram a ser utilizados como métodos complementares no acompanhamento e tratamento dos pacientes que apresentem lesões induzidas pelo HPV principalmente naqueles casos inconclusivos Claro que os Testes Moleculares não são os únicos existentes para diagnóstico pois existem também o Clínico o Citopatológico o Colposcópico e o Histopatológico mas na maioria das vezes o diagnóstico da infecção viral é feito pelos métodos moleculares que além da identificação da presença viral torna capaz a identificação do tipo viral presente A técnica de Captura Híbrida é capaz de detectar a presença de qualquer dos tipos de HPV de alto risco porém não os individualiza Ela se tornou um dos métodos mais utilizados para a prática clínica com uma sensibilidade extremamente alta a qual pode chegar a 97 Vários programas passaram a utilizar o duplo diagnóstico que consiste na citologia em base líquida e a Captura Híbrida para o rastreamento e o tratamento da população A Captura Híbrida permite a identificação de 13 tipos de HPV de alto risco oncogênico 16 18 31 33 35 39 45 51 52 56 58 59 68 e 5 tipos de baixo risco 6 11 42 43 e 44 apresentando uma sensibilidade bem superior quando comparado ao exame Citopatológico tradicional que é utilizado na identificação do câncer do colo de útero bem como nas suas lesões precursoras CAETANO E COL 2006 TULIO E COL 2007 Outros testes moleculares como o PCR e qPCR ficam mais restritos ainda porém o último vem ganhando mais espaço devido ao custo operacional quando comparado à Captura Híbrida e também pela complexidade do espaço físico como já foi discutido Uma vantagem do qPCR é a possibilidade de conseguir identificar vários tipos do HPV e não somente separálos em alto e baixo risco sendo capaz também de quantificar a carga viral com maior exatidão e reprodutibilidade SUGESTÃO DE LEITURA STRACHAN T READ A Genética Molecular Humana 4ª ed Porto Alegre Artmed 2017 No Capítulo 18 Testes Genéticos em Indivíduos o livro traz uma série de testes que podem ser trabalhados na genética além de sua importância como diagnóstico laboratorial sendo a leitura recomendada para abrir o campo de visão neste enfoque específico 170 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA 46 GENÉTICA FORENSE A tentativa de vínculo genético é bem antiga tendo evoluído muito ao longo dos anos e ainda continua evoluindo O caminho feito com base na ciência foi gradativo Hoje observamos os testes que foram aplicados em seu início mas que para a época significavam um grande avanço No entanto foram os avanços promovidos pela biologia molecular que aperfeiçoaram os testes de vínculo genético permitindo que os testes tradicionais fossem gradativamente substituídos ao inaugurar uma nova etapa na Genética Forense 461 Histórico A tentativa de agrupamento por vínculo genético começou em 1900 com Landsteiner o qual demonstrou que os seres humanos poderiam ser agrupados através da capacidade dos seus soros aglutinarem ou não as hemácias dos seus semelhantes Esta aglutinação era fruto da presença dos anticorpos no soro que acabavam reagindo com os antígenos presentes nas hemácias dos seus semelhantes não sendo observados no soro dos indivíduos ou seja o soro deles não continha os anticorpos que corresponderiam aos antígenos de suas hemácias Este trabalho lhe valeu o Prêmio Nobel de Medicina e Fisiologia em 1930 e Landsteiner contribuiu com muitos outros trabalhos para a ciências da saúde Com a utilização dos testes de aglutinação possibilitouse a identificação dos antígenos eritrocitários e a realização do agrupamento dos indivíduos com base nesta característica além de iniciar os estudos de parentesco O sistema ficou conhecido como ABO sendo ele constituído de basicamente dois antígenos o A e o B que acabam gerando quatro grupos sanguíneos a saber A B AB e O Em 1910 Von Dungern e Hirszfeld conseguiram demonstrar a utilidade do sistema ABO na determinação de paternidade RACE e SANGER 1968 Claro que o sistema era melhor do que apelar apenas para fenótipos corpóreos mas ele não era ainda muito 171 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA informativo ou preciso para uma inclusão segura a probabilidade de inclusão de paternidade é de 13 como foi demonstrado por Silva em 1982 No meio do caminho em 1927 foi descrito o sistema MN que se constitui de 2 antígenos o M e o N determinante de 3 genótipos MM MN e NN Neste processo em 1939 somouse a estas ferramentas de identificação a caracterização do fator Rhesus ou Rh sendo a complexidade genética do sistema Rh descrita em 1943 RACE e SANGER 1968 Todos os sistemas eram muito inconclusivos para serem utilizados em inclusões de paternidade mas quando associados era possível excluir em torno de 70 de indivíduos acusados como supostos pais SILVER 1982 O que muito auxiliou a Genética Forense foi a descoberta e descrição em 1954 nos seres humanos do Sistema de Histocompatibilidade chamado de Histocompatibility Leucocyte Antigen HLA Ele consiste em um conjunto de genes que são codominantes se apresentam em conjunto não existe dominância e se localizam no cromossomo 6 sendo divididos em classes Até o início dos anos 80 o sistema utilizava os antígenos HLA com os do sistema ABO que junto com outras proteínas polimórficas haptoglobinas Fator C do Complemento entre outras forneciam grande probabilidade de uma inclusão no grau de parentesco mas ainda assim para um número razoável de casos os resultados eram inconclusivos em geral 5 a cada cem podem ser inclusos 4611 Uso do DNA na Identificação de Vínculo Genético A jornada envolvendo o DNA como ferramenta de vínculo genético começa em 1984 através do geneticista britânico Alec Jeffreys que estudava as diferenças genéticas no gene da mioglobina Em seus estudos o pesquisador observou trechos de DNA repetitivo em sequência tandem e o número destas sequências variava de um indivíduo para outro Jeffreys também constatou que estes trechos de DNA repetitivo não eram observados apenas no gene da mioglobina mas também estavam presentes por todo o genoma com uma pequena variação entre um trecho e outro mas estas sequências curtas eram praticamente idênticas em torno de 15 nucleotídeos sendo denominadas como minissatélites JEFFREYS 1985a 172 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA O Britânico então desenvolveu o chamado DNA fingerprint tendo a oportunidade de aplicar a técnica pela primeira vez em 1985 em um caso que envolvia uma criança e determinação de filiação Um jovem ganês de 13 anos morava com a família na Inglaterra e ao viajar para seu país natal para passar um tempo com seu pai teve a entrada de volta negada com a acusação de que possuía documentação falsificada para tentar residir no Reino Unido Jeffreys ao ser chamado pelo governo fez uso de sua tecnologia e comprovou que o menino pertencia à família biológica em questão o que possibilitou a entrada do mesmo e a regularização da situação JEFFREYS 1985b Depois de um ano aconteceu a oportunidade de utilização da técnica em um caso criminal que ficou conhecido como Enderby no qual uma adolescente foi estuprada e morta em novembro de 1983 em Narborough Leicestershire e a segunda igualmente estuprada e morta em julho de 1986 em Enderby Leicestershire Os crimes apresentavam características similares levando à suspeita de que seria obra do mesmo indivíduo Inicialmente um homem confessou o assassinato no primeiro caso mas por meio do sêmen coletado da vítima ele foi descartado Com a estratégia de divulgar a doação de sangue mais de quatro mil homens de três vilarejos próximos tiveram seu DNA analisado sem se constatar qualquer analogia com o perfil genético obtido nos locais do crime Porém um ano depois um indivíduo informalmente comentou que havia ido doar sangue no lugar de um amigo de nome Colin Pitchfork Uma testemunha do fato foi à polícia e denunciou Então a polícia convocou Colin Pitchfork interrogou e fez a coleta de sangue do suspeito Após a análise o perfil genético dele era o mesmo que foi obtido a partir das amostras de sêmen levando Colin Pitchfork à prisão perpétua em 22 de janeiro de 1988 o qual acabou admitindo ambos os assassinatos TANDE 1989 Nos EUA em 1986 pela primeira vez uma corte americana aceitou o DNA como prova criminal no caso conhecido como Florida x Andrews material usado para a identificação de um suspeito de invasão a 20 residências seguindose de estupro No ano seguinte o FBI e os laboratórios criminais de vários países passaram a se valer de amostras de DNA como provas criminais 173 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA 462 Polimorfismo Para esta parte de nosso conteúdo será muito necessário o que já foi aprendido regiões do genoma conceitos ferramentas da Biologia Molecular e técnicas da área Então se alguma dúvida persistir volte aos conceitos trabalhados e os reforce para que se possa dar o fechamento que desejamos a esta importante disciplina de sua carreira profissional O princípio básico do teste de paternidade e do caso criminal será baseado em comparação de perfil genético No teste de paternidade observase o perfil do filho identificando o que é materno e a sobra será checar se está no suposto pai já nos casos criminais é traçado o perfil genético de alguma amostra ligada ao crime mancha de sangue pelos pele etc para comparar com o perfil genético de um ou mais suspeitos Em nosso genoma observamos inúmeras regiões polimórficas por locus dois ou mais alelos possuem frequências gênicas maiores que 001 na população Quando este valor não está presente o locus é monomórfico Em nosso genoma as regiões classificadas como polimórficas podem apresentar o polimorfismo de tamanho ou de sequência 4621 Polimorfismo de Tamanho Os locus polimórficos de tamanho fazem parte de regiões utilizadas para os exames de vínculo genético podendo apresentar repetições consecutivas de número variável quanto maior o número de repetições maior será a região Estas regiões se dividem nas Variable Number of Tandem Repeats VNTR ou minissatélites Repetições Consecutivas Curtas chamadas de Short Tandem Repeats STR ou microssatélites e no polimorfismo que surge quando ocorrem deleções e inserções no genoma INDEL a VNTR Minissatélites são as sequências de tamanho médio podendo variar de 10 a 100 pb este número pode ser diferente de acordo com a literatura pesquisada e o número de repetições pode variar de duas até vinte em geral É comum os minissatélites serem instáveis Frequentemente o número de cópias de 174 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA uma sequência em particular vai aumentar ou diminuir de uma geração para outra resultando na alta variabilidade no comprimento destes locus na população e até entre o mesmo núcleo familiar b STR microssatélites são pequenas repetições que podem variar de 1 a 5 nucleotídeos o número pode diferir de acordo com a literatura pesquisada podendo o número de repetições oscilar bastante entre os indivíduos mas em geral entre 50 a 100 pb Estas sequências estão espalhadas pelo genoma humano de forma homogênea com um número aproximado de 30000 loci diferentes ocorrendo 1 STR a cada 6 ou 10 kb normalmente Os loci são então bastante abundantes com um grande número de diferentes alelos maior que VNTR tendo se tornado mais úteis nas análises de vínculos genéticos Nas investigações de vínculo genético a utilização de locus STRs tem acontecido com bastante frequência com a vantagem adicional de poderem ser usadas quando se tem pouca quantidade de material de análise ou amostras potencialmente degradadas uma vez que sendo menores apresentam chance menor de estarem incompletas Claro que quando comparadas às VNTRs necessitam de análises de vários loci STRs pois o poder de discriminação é menor que de VNTRs Mas com o número de locus corretos são suficientemente polimórficos e permitem as identificações inequívocas de indivíduos possibilitando colocar um indivíduo na cena de um crime com elevado grau de certeza c INDEL este tipo de polimorfismo se enquadra no grupo de polimorfismo de comprimento sendo gerado pela ocorrência de inserções deleções as quais podem envolver um ou mais nucleotídeos sendo considerados marcadores de evolução lenta em função da alta estabilidade e baixa taxa mutacional Tais regiões podem ser observadas na forma multialélica ou bialélica A forma multialélica acontece quando um segmento de DNA se repete várias vezes em local específico mas em quantidades vaiáveis já a forma bialélica mais da metade em geral é composta somente do alelo de inserção eou deleção do segmento Quando a forma é bialélica é possível se observarem três fenótipos o de Homozigose do Alelo Inserção ii Homozigose do Alelo Deleção dd ou Heterozigose id Esta forma se constitui no polimorfismo em número mais abundante e gira em torno de 8 estando logo abaixo dos mais numerosos dos polimorfismos que são os SNPs Sua distribuição no genoma humano é ampla podendo ela estar presente tanto 175 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA em regiões codificantes quanto em não codificantes Quando estão presentes nas regiões codificantes podem se refletir em variações qualitativas e quantitativas nas proteínas e com isso acontecerem alterações fenotípicas Porém esta forma de polimorfismo é mais comumente observada nas regiões não codificantes sem consequência direta para o gene no sentido de não modificar a estrutura proteica 4622 Polimorfismo de Sequência Dentro do Polimorfismo de Sequência que começa a ganhar espaço nos testes de vínculo genético existe o polimorfismo de Substituição de Nucleotídeos Únicos SNP Single Nucleotide Polymorphism a SNP Estas regiões acabam surgindo por mutações pontuais ocorridas em nosso DNA e também em outras espécies observadas nas transições que são as trocas entre bases purínicas AG eou pirimidínicas CT e transversões as trocas de purínicas por pirimidínicas e viceversa AT GC São as classes mais abundantes observadas no genoma humano e nos eucariotos em geral No caso do genoma humano os SNPs representam 90 deste Mais de 15 milhões de regiões SNPs foram identificadas nos seres humanos estando elas amplamente distribuídas ao longo do genoma tanto em regiões codificadoras éxons quanto não codificantes íntrons e regiões intragênicas Vale lembrar que o entendimento de SNPs em regiões codificadoras necessita do estudo de mutações pontuais e suas consequências sejam prejudiciais ou vantajosas No entanto a maior parte dos SNPs está nas regiões não codificantes Como foi mencionado apesar das descobertas de SNPs terem se iniciado no genoma humano eles são amplamente distribuídos na natureza e se constituem na principal forma de variação intraespecífica Com o aumento dos estudos nestas regiões percebese que ainda existe muito para se aprender a respeito dos SNPs tanto sobre seu surgimento quanto seu papel nos 176 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA genomas dos seres vivos mas já se sabe que possuem efeitos biológicos importantes por estarem associados com doenças complexas sua sintomatologia evolução clínica e a resposta aos tratamentos administrados Observase a influência ou papel de destaque de SNPs na obesidade em alguns tipos de cânceres doença coronariana etc De que forma estes SNPs estariam modulando ou controlando todos estes sistemas são questionamentos que abrem uma frente ampla e inesgotável de pesquisa e investigação mostrando que ainda temos muito a aprender sobre os SNPs Além disso atualmente são regiões utilizadas em muitas áreas de pesquisa como marcadores moleculares conforme se observa nos estudos evolutivos melhoramento genético ecológicos etc É também uma importante ferramenta na análise genética do ser humano estudos antropológicos e na identificação humana de vínculo genético o que será estudado adiante 463 Análises de Polimorfismos 4631 Análises de VNTR STR e INDEL a VNTR A metodologia desenvolvida por Jeffreys baseavase na detecção das regiões polimórficas através da técnica de RFLP ver unidade anterior que são os fragmentos de tamanhos diferentes gerados após o corte com enzimas de restrição O DNA cromossômico era cortado com enzimas de restrição gerando os fragmentos de DNA que continham VNTRs Depois era feito o gel de poliacrilamida longo e extremamente fino e o passo seguinte era promover a desnaturação do DNA ocasionando a separação de todas as duplafitas Então procediase à transferência de todo o material do gel para uma matriz sólida por meio de uma transferência de Southern Blot Esta matriz sólida após toda transferência do material genético ter ocorrido era incubada com sondas radioativas as quais se prendiam por complementariedade nos seus alvos A matriz era colocada em contato com um filme de RaioX que depois de um 177 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA tempo marcava o filme e apresentava o perfil genético analisado A tecnologia que envolvia os novos achados e técnicas levou ao desenvolvimento de sondas para os loci VNTR o que permitiu a análise de RFLPs As Sondas Multilocus Multilocal MLP como o nome já sugere ligamse a várias sequências de DNA produzindo inúmeras bandas de reconhecimento Durante um tempo elas foram as sondas utilizadas mas apresentavam uma baixa resolução ao final da autorradiografia com bandas que se sobrepunham dificultando a análise No entanto a alta resolução em boa parte da autorradiografia permitia que a analogia fosse feita chegandose às conclusões de vínculo genético que eram propostas b STR Dentro deste mesmo sistema posteriormente foram desenvolvidas as Sondas Unilocus Unilocal SLP que se ligam a um único locus do DNA O sistema passou a ser utilizado para a identificação humana em função da sua grande sensibilidade apresentando um resultado bem mais fácil de ser interpretado e consequentemente mais preciso As Sondas Unilocus são elaboradas a partir do objetivo de se ligarem a um alvo em cada conjunto cromossômico Como os fragmentos ligados a elas apresentam variedade em tamanho são visualizados como duas bandas em diferentes posições na autorradiografia salvo casos de homozigose ou seja uma materna e outra paterna Na Figura 52 seguem exemplos hipotéticos de 4 locus analisados também hipotéticos mostrando a correspondência em um suposto teste de Inclusão de Paternidade Lembrese de que a grosso modo o cálculo explicação adiante será feito sobre os locus presentes no filho e observados no suposto pai Reparar que se deve identificar a região do cromossomo materno do filho sendo o que sobrar de fato o mesmo alelo que o pai apresenta 178 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA Figura 52 Análise Hipotética de uma Inclusão de Paternidade Fonte Elaborada pelo autor 2021 As regiões de minissatélites possuem muitos locus polimórficos mais que os microssatélites Em geral 5 loci de VNTR teoricamente fornecem resultados satisfatórios para análise enquanto que normalmente a análise de STR necessita em torno de 13 ou mais loci para serem analisados Porém com o tempo VNTR caiu em desuso pela necessidade de uma quantidade considerável de DNA não degradado e por ser uma metodologia trabalhosa e demorada Com a utilização do método de PCR foi possível tipar regiões de STR através da utilização de um sistema multiplex em que se adicionam vários primers na reação os quais orientam as reações simultâneas de amplificação com geração de produtos de múltiplos loci Os resultados dos alelos são separados em eletroforese com gel de poliacrilamida e corados por prata para posterior análise Hoje com os avanços tecnológicos foram desenvolvidos os testes em sequenciadores automáticos que fazem análise de loci STR Os primers são marcados com diferentes fluoróforos e um sistema de detecção a laser como já foi descrito na unidade anterior com a leitura sendo feita por capilar Neste sistema é possível a amplificação simultânea de 15 até mais de 30 loci STR para análise e também é necessário usar 2 STR 179 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA para identificação eou confirmação do sexo dos periciados A amelogenina que nas mulheres apresenta alelos iguais com 106 pb enquanto no homem um alelo tem 106 pb e o outro 112 pb também podendo ser analisado o STR do DS391 do cromossomo Y Com esta tecnologia é possível a identificação de um indivíduo em um único tubo onde múltiplas reações de amplificação são processadas Ela também possibilita a análise de muitos marcadores genéticos consumindose pouco volume da amostra sendo que o processo diminui a manipulação com isso reduza possibilidade de contaminação do processo e para finalizar a automatização do processo analítico é também facilitada BUDOWLE 2011 De acordo com a recomendação da Sociedade Internacional de Genética Forense ISFG quando se nominam os alelos STR deve ser feito de acordo com o número de unidades repetidas por exemplo se para o locus D5S818 aparecer o valor 7 significa que são 7 repetições AGAT típica deste locus ou para TPOX aparecer o valor 11 são 11 repetições AATG e assim a regra se aplica aos loci analisados Se um alelo apresenta uma sequência de repetição que ao final está incompleta devese colocar o ponto e quantos nucleotídeos aparecem após o ponto por exemplo uma variante do locus TH01 é 93 e isto significa que são 9 repetições TCAT e em seguida à nona aparece a tríade TCA c INDEL Uma das razões do interesse nas regiões de INDEL para as análises de vínculo genético devese à abundância e grande distribuição destes marcadores polimórficos por todo o genoma Outras razões de interesse é que tais regiões apresentam diferenças significativas de frequência alélica entre as populações geograficamente distintas neste caso se tornando marcadores importantes de ancestralidade Além disso apresentam um número significativo de alelos passíveis de serem genotipados em pequenos fragmentos o que auxilia bastante nas análises de amostras degradadas PEREIRA 2009 RIBEIRO RODRIGUES 2009 A possibilidade de detecção usando PCR seguido de eletroforese em gel de poliacrilamida com posterior coloração por prata uma análise de baixo custo e de rápida execução tornouse atrativa para a utilização destas regiões na análise de vínculo genético 180 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA 4632 Análises de SNP Os SNPs são extremamente numerosos apresentando mais de 10 milhões de regiões identificadas e descritas em nosso genoma as quais permitem amplificação Como são muito curtos podem ter a vantagem de utilização em amostras degradadas ou com pouca quantidade As SNPs também apresentam limitações como a necessidade de grande número de regiões que precisam ser analisadas para se ter validade conclusiva 4 vezes ou mais regiões do que o número de STRs o que eleva os custos além de ainda não ser possível contabilizar se haveria vantagem real no uso substitutivo de algumas análises por STR Desta forma o uso de STRs continua apresentando maior simplicidade e um custo bem mais baixo somado à solidez dos resultados já obtidos com o STR ao longo de mais de uma década 464 Regiões de Análises e Respectivos Marcadores Muitos marcadores são desenvolvidos para análise de vínculo genético sendo uma das grandes referências os chamados marcadores CODIS desenvolvidos nos Estados Unidos mas muito utilizados no mundo inteiro Mais adiante em Banco de Dados Genéticos você vai tomar conhecimento do sistema CODIS e seu funcionamento O European Standard Set que é também uma lista de marcadores está contida na listagem CODIS A lista do Federal Bureau Investigation FBI dos loci CODIS segue no Quadro 5 com os loci e entre parênteses o cromossomo onde se localiza Quadro 5 Marcadores CODIS D1S1656 1 TPOX 2 D2S441 2 D2S1338 2 D3S1358 3 FGA 4 D5S818 5 CSF1PO 5 D7S820 7 D8S1179 8 D10S1248 10 TH01 11 D12S391 12 vWA 12 D13S317 13 D16S539 16 D18S51 18 D19S433 19 D21S11 21 D22S1045 22 Fonte Elaborado pelo autor 2021 181 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA 465 Cromossomo Y Muitos testes têm sido desenvolvidos para as análises das regiões polimórficas do cromossomo Y e com isso tem aumentado o painel dos loci de análise STR Os testes envolvendo o Y são muito utilizados para estudos de genealogias e nos crimes sexuais que possam envolver a presença de fluidos biológicos tanto masculinos quanto femininos Caso predomine material proveniente da vítima do sexo feminino em relação ao do violador tornase difícil a tipagem do DNA masculino pelos testes de análise convencional de STR então os testes envolvendo o Y são de grande utilidade As análises de YSTR focam o estudo no material genético exclusivamente masculino Os alelos de origem masculina são herdados em bloco e esta herança em bloco de alelos de diferentes STR do mesmo cromossomo é denominada Herança Haplotípica como conjunto dos alelos denominados Haplótipos Os testes envolvendo o cromossomo Y apresentam algumas desvantagens sendo uma das principais o baixo poder discriminatório quando se compara com as análises convencionais de STR e a incapacidade de distinguir homens na mesma linha paternal Mas por que isso Simples o Y que o filho recebe é exatamente aquele que seu pai tinha o qual ele recebeu do avô deste filho e assim sucessivamente O interesse nas investigações forenses tem feito aumentarem os estudos em regiões de SNPs do cromossomo Y YSNPs ainda mais quando muitos destes alvos mostram especificidade regional fornecendo uma gama de importantes informações sobre a origem geográfica de um sujeito ou de um vestígio sob investigação O que se soma a este estudo é o baixo índice de mutações favorecendo a presença dos mesmos haplótipos por várias centenas de anos O local dos marcadores do cromossomo Y apresenta uma frequência típica na população por isso há um banco de dados especializado o qual está disponível em www ystrorg Com a análise de mais de 8 loci no cromossomo Y é possível matematicamente traçar a existência ou não da relação genética entre indivíduos sem afirmar o grau de parentesco É possível estabelecer uma exclusão de paternidade quando o suposto pai é falecido e se analisa o pretenso filho e homens aparentados com o suposto pai Alguns dos loci de STR do cromossomo Y são DYS19 DYS389 I DYS389 II DYS390 DYS391 DYS392 e outros Uma das investigações envolvendo o cromossomo Y e seus haplótipos envolveu 182 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA a identificação de Saddam Hussein a partir da comparação entre ele e o DNA que foi extraído do corpo dos filhos Uday e Qusay Hussein 466 DNA Mitocondrial As análises do polimorfismo do DNA Mitocondrial DNAmt e das regiões de SNPs são feitas através de sequenciamento automático de regiões específicas Como já foi trabalhado em nossas unidades o DNAmt é um DNA circular com 16569 pb e somente as regiões polimórficas serão analisadas Ao contrário do DNA nuclear que ocorre em pares cromossômicos o mitocondrial apresenta apenas uma estrutura então não ocorrem recombinações gênicas Na identificação humana a região do DNAmt analisada é conhecida como alçaD em razão da sua alta variabilidade de sequência nucleotídica região não codificante com cerca de 1100pb que apresenta duas regiões hipervariáveis e por esta razão o método mais preciso e indicado é o sequenciamento automático É importante destacar que as análises de DNAmt são muito sensíveis produzindo resultados satisfatórios nas amostras que não são muito indicadas para análise de amostras de material genético das regiões cromossômicas Podem ser utilizadas em fios de cabelo com o bulbo degradado ou em ossos e dentes de amostras antigas uma vez que o DNAmt estará presente em milhares de cópias por célula preservando seu material genético com maior eficiência O poder discriminatório do DNAmt é mais limitado Por serem originários de uma herança materna os testes não podem distinguir indivíduos de mesma linhagem maternal Observamse algumas pequenas variações nos perfis de DNAmt de células diferentes e a razão disto é a ocorrência de mutações a heteroplasmia o que se torna um problema para associação de dois perfis analisados a fim de atestar ou não se as amostras são coincidentes Somado a isto o custo é maior do que as análises feitas das regiões cromossomais mas os avanços tecnológicos vão barateando o processo e igualando seus custos O fato de o material ser muito conservado o maior valor agregado deste tipo de análise acontece em casos de grandes catástrofes cujas amostras estão severamente degradadas acidentes aeroviários materiais achados em regiões adversas como alta concentração salinas etc 183 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA 467 Banco de Dados Uma ferramenta de grande auxílio para os casos de vínculo genético são os Bancos de Dados Genéticos As inovações geradas com o avanço tecnológico na área da Biologia Molecular permitiram a resolução de inúmeras questões relacionadas ao vínculo genético em particular no uso das análises em casos criminais a identificação segura de um indivíduo suspeito com materiais achados nas cenas de crimes ou até mesmo no corpo da vítima Todo este processo é sem dúvida alguma acelerado quando se utiliza um banco de dados de perfis genéticos que permite o armazenamento das informações de milhares de indivíduos com possibilidade de comparação do perfil genético de amostras coletadas nas cenas criminais a Estados Unidos As discussões para criação de um Banco de Dados Genéticos foram iniciadas nos Estados Unidos ao final da década de 80 tendo sido criado um sistema chamado CODIS Combined DNA Index System lançado oficialmente em 1990 Em 1991 cerca de 15 estados americanos criaram leis autorizando que se implementasse um banco de dados com amostra de DNA criminal O sistema CODIS iniciou como projeto piloto e em 1994 permitiu que o FBI conseguisse otimizar a implantação do banco de dados no território americano tendo ligação direta com seu objetivo de ser utilizado nas investigações criminais O sistema CODIS possui dois arquivos diferentes de perfis o índice forense reúne perfis genéticos obtidos a partir de cenas de crimes e o índice de criminosos reúne os perfis genéticos de criminosos condenados por crimes sexuais e violentos As atividades do CODIS acontecem em vários níveis sendo mantido no banco de dados denominado Local DNA System LDIS Em 2016 o CODIS possuía 14464461 perfis criminais com 12205768 de criminosos e 2258693 de detidos além de 895 mil perfis forenses b Reino Unido A Inglaterra criou em 1995 o Banco de Dados Reino Unido National DNA Database NDNAD Esta base de dados cresce em torno de 30 mil amostras a cada mês a partir das amostras que são obtidas nas cenas de crimes e amostras de suspeitos detidos 184 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA e presos Até 2013 o Banco continha 6737973 perfis individuais cadastrados e 428634 perfis arquivados de locais de crime c Brasil No ano de 2010 o Brasil estabeleceu um acordo com o Federal Bureau of Investigation FBI para a utilização do Sistema CODIS sistema dos EUA que é utilizado em mais de 30 países A chamada Rede Integrada de Bancos de Perfis Genéticos RIBPG foi criada através de decreto no dia 12 de março de 2013 nº 79502013MJ com o objetivo de manter compartilhar e possibilitar a comparação dos perfis genéticos para auxiliar a apuração criminal eou na instrução processual A Rede Integrada de Banco de Perfis Genéticos envolve a Polícia Federal e as Secretarias Estaduais de Segurança Pública com a Secretaria Nacional de Segurança Pública SENASP Este sistema integrado permite que os perfis genéticos sejam compartilhados em todo o país através de um banco central em que todos os laboratórios forenses estaduais estejam interligados pela rede Os perfis genéticos gerados através dos laboratórios da RIBPG obedecem aos critérios que são estabelecidos no Manual de Procedimentos Operacionais tendo seus dados enviados ao Banco Nacional de Perfis Genéticos BNPG onde é possível a comparação no território nacional com todos os perfis gerados pelos 20 laboratórios de genética forense que fazem parte da RIBPG e até encaminhados para outros países através da INTERPOL Seguem os dados até 29 de novembro de 2018 possuem laboratórios especializados que participam desta rede além do Distrito Federal os seguintes estados Amazonas Amapá Bahia Ceará Espírito Santo Goiás Maranhão Minas Gerais Mato Grosso do Sul Mato Grosso Pará Paraíba Pernambuco Paraná Rio de Janeiro Rio Grande do Sul Santa Catarina e São Paulo além do laboratório da Polícia Federal que está credenciado no sistema O Banco Nacional de Perfis Genéticos BNPG apresenta um total de 14922 perfis genéticos oriundos de amostras relacionadas a casos criminais sendo assim distribuídos 7872 vestígios criminais 6536 perfis de condenados 441 perfis de identificados criminalmente e 73 perfis de decisão judicial Outro ponto a se destacar é que o BNPG possui 829 dos perfis de familiares de pessoas desaparecidas 008 de referência direta de pessoa desaparecida e 012 de pessoa de identidade desconhecida 185 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA 468 Cálculo para o Teste de Paternidade O Cálculo de um teste com a mãe o filho e um suposto pai envolverá a distribuição dos vários alelos e seus índices estatísticos em cada grupo populacional Um passo fundamental é calcular o chamado Índice de Paternidade IP para cada locus que for utilizado no exame o Índice Cumulativo de Paternidade ICP e a Probabilidade Cumulativa Positiva de Paternidade W a Parte 1 IP O IP será calculado dividindose X por Y mas quem é quem IP XY X Probabilidade de transmissão do alelo materno m multiplicado pela probabilidade de transmissão do alelo obrigatório paterno p X m p Y Probabilidade de transmissão do alelo materno m multiplicado pela frequência do alelo paterno na população de mesma origem f Y m f IP m p m f Os valores de m ou p vão variar De 1 quando a mãe ou o pai são homozigotos De 05 quando a mãe ou o pai são heterozigotos O f é um índice matemático o qual reflete a frequência do alelo paterno detectado em uma região que pode ser o estado país etc b Parte 2 ICP O ICP é calculado multiplicando os Índices de Paternidade IPs para os vários loci analisados as análises recomendadas partem de um mínimo de 13 loci Este índice pode não ser um número inteiro c Parte 3 W A Probabilidade Cumulativa de Paternidade W envolverá a Probabilidade a Priori PP e o Índice Cumulativo de Paternidade ICP O valor de PP por convenção é 05 ou 50 representando um fator numérico que vai garantir a imparcialidade do cálculo Na Figura 53 temos a fórmula para cálculo 186 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA Figura 53 Cálculo da Probabilidade Cumulativa de Paternidade Fonte Elaborada pelo autor 2021 Caso um locus do filho não apareça no suposto pai não se pode calcular o IP refletindose em uma exclusão para o locus analisado 469 Amostras Biológicas A identificação de uma amostra biológica representa um fato muito importante nos casos de paternidade e nos casos criminais No teste de paternidade a princípio as partes voluntariamente farão o teste e a opção ideal é a coleta de sangue que pode ser feita em tubo a vácuo com anticoagulante preferencialmente EDTA em cartão FTA ou caso se opte por outro material que não sangue a opção é o swab oral Porém nos casos criminais o objetivo de identificação da amostra nem sempre será uma tarefa simples nesta caminhada ao objetivo final em função dos vestígios que são coletados muitas vezes em condições bem adversas Para que a análise possa ocorrer pesa bastante a experiência e habilidade do coletador obedecendo ao princípio de que os vestígios submetidos para análise de DNA são obrigatoriamente de natureza biológica Os vestígios coletados se executados com resultado satisfatório podem ligar uma pessoa à outra a um objeto ou a um lugar mas pode também desvincular um indivíduo de um crime Não podemos nos esquecer de um conceito MUITO IMPORTANTE o DNA é uma peça no todo do processo e não pode ser encarado como prova única e definitiva de absolvição ou condenação de um indivíduo Assim sendo sobre as amostras adequadas para análise de DNA Sangue pode ser encontrado em qualquer local onde ocorre o delito Pode estar presente na forma de gota salpicado em poça mancha ou crosta sendo 187 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA o indício biológico mais encontrado nos locais de crimes e nos vestígios Sêmen presente em crimes relacionados ao sexo que muitas vezes não deixa uma mancha detectável a olho nu Técnicas auxiliares ajudam na detecção destas manchas como a luz UV e análises químicas Saliva pode ser encontrada nas células da pele na região bucal nem sempre são visíveis mas alguns objetos apresentam alta probabilidade de conter esta amostra como guimbas de cigarro ou similares mordaças máscaras copos canudos comida chicletes escova de dente marcas de mordida etc Pelos e Cabelos independentemente de onde se origina o foco são as células que rodeiam o bulbo As amostras que não apresentam esta estrutura bulbo são utilizadas para análise de DNA mitocondrial Células da Pele muito observado por baixo da unha típico de se encontrar em arranhadura quando acontece briga com um agressor podendo até apresentar sangue luvas bonés e gorros mistura de suor e células como se observa em partes de uma camisa cava por exemplo Urina são encontradas células do revestimento uretral e também leucócitos Restos Humanos comum em vítimas de delitos acidentes ou pessoas não identificadas O material coletado pode acontecer nas cavidades cardíacas onde se coletam amostras de sangue mechas de cabelo desde a raiz pedaço de músculo Em caso de cadáver em estado adiantado de decomposição com putrefação generalizada devese escolher preferencialmente ossos longos Fêmur e Tíbia e dentes seguindo a ordem de preferência em molar prémolar canino e incisivo não restaurados restaurados é segunda opção Somados às características da amostra existem os procedimentos que são importantes para o sucesso da análise a saber a Fotografar o vestígio antes da coleta b Antes de recolher elementos para análise de DNA considerar outros vestígios como impressão digital por exemplo c Usar kits especiais para coleta e embalagem das amostras d Recolher vestígios líquidos com seringas estéreis tubo de coleta com EDTA cartão absorvente algodão gaze swab estéril e secar à temperatura ambiente ou congelar para evitar a ação de microrganismos e Manchas em algum objeto que possa ser transportado não são extraídas no local devendo ser embaladas para encaminhamento ao laboratório de análise Se tiver sangue úmido é necessário secar antes de embalar f Manchas não transportáveis devem ser coletadas com swab levemente umedecido 188 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA raspandose a mancha com instrumento limpo em pequenas gotas pode ser usada fita adesiva quando forem manchas em tapetes carpetes e estofados devese cortar o suporte onde está contida a amostra secando à temperatura ambiente g Pelos e cabelos são recolhidos com pinça e colocados em embalagem estéril h Tecidos órgãos osso e dentes não serão secos e sim congelados antes do envio ao laboratório 189 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA CONSIDERAÇÕES FINAIS Na Unidade 4 começamos o estudo com PCR em Tempo Real Neste caderno tratamos o tema de qPCR mas em muitas publicações e na TV percebemos que acertadamente tratase como RT PCR Real Time PCR O motivo desta utilização foi para não confundirmos com o uso da Transcriptase Reversa Reverse Transcriptase RT É importante compreender que o qPCR possibilitou a quantificação do material amplificado durante os seus ciclos capacidade que o PCR Tradicional não possui além de oferecer outras inúmeras possibilidades O sequenciamento automático é uma tecnologia das mais importantes sendo sustentáculo em inúmeras abordagens na área da saúde bem como em processos biotecnológicos Conhecer as moléculas de ddNTP foi muito importante para compreender como funcionam as reações que possibilitam ao final do processo serem lidas gerando o sequenciamento nucleotídico com aplicações das mais diversas Na sequência entramos no entendimento do DNA Microarray ou Chip de DNA tecnologia que ganha cada vez mais espaço sendo utilizada por muitas indústrias de biocosméticos farmacêuticas na área da oncologia dermatologia e tantas outras Ela consiste basicamente de sondas fixadas em uma lâmina que detectará a presença de sequências de interesse Um ponto muito importante desta tecnologia foi demonstrado na explicação sobre a terapia individualizada em que existe a possibilidade de se analisar a expressão de genes em situações fisiológicas contra a expressão de genes em células patológicas permitindo desta forma selecionar os alvos com base na expressão dos genes que só se manifestam na patologia A técnica de Captura Híbrida é muito utilizada principalmente em patógenos que possuem DNA como material genético Esta técnica não precisa de amplificação prévia como o PCR não requer reações sucessivas e com isso apresenta uma série de vantagens que justificam sua utilização em um laboratório de Biologia Molecular Como a técnica possui destaque nos exames envolvendo p HPV este ganhou um tópico dentro da temática da Captura Híbrida A Unidade 4 encerra na Genética Forense com um histórico extremamente relevante contextualizando a evolução da identificação humana Em seguida o entendimento das regiões do nosso genoma que serão os alvos da investigação do vínculo genético e como será a metodologia de análise destas regiões 190 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA Merecendo destaque em nossa temática citamos os marcadores CODIS utilizados no mundo inteiro e referência nos testes de vínculo genético Fazendo o link com estes marcadores trabalhamos nos Bancos Genéticos suporte na elucidação de investigações e ações de combate aos crimes dos mais diversos Foi trabalhada ainda a importância dos exames no cromossomo Y e o papel das análises do DNA mitocondrial Por fim analisamos e discutimos a base do cálculo dos testes de paternidade além de como se deve proceder à obtenção das amostras para os exames de vínculo genético Em relação ao teste de paternidade atualmente a diferenciação não é possível mas os estudos cada vez mais buscam desenvolver tecnologias para que isso seja possível a um médio prazo Espero que tenham aproveitado o estudo e que os conhecimentos aqui compartilhados sirvam de suporte para a formação de um ótimo profissional pronto para encarar um campo dos mais promissores na área da saúde e na área biotecnológica 191 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA EXERCÍCIO FINAL 01 CONHECIMENTO O método de PCR em Tempo Real abriu novas perspectivas nos exames clínicos além de muitas possibilidades analíticas que não eram possíveis com a utilização da Reação em Cadeia da Polimerase Em função do conhecimento adquirido ao longo desta unidade analise as afirmativas abaixo I O que permite a quantificação conforme ocorre a amplificação no PCR em Tempo Real é a presença dos fluorogênicos ligados à sonda que acendem cada vez que são retirados destas estruturas II No PCR em Tempo Real existe a sonda que é complementar às regiões flanqueadoras do gene o qual se pretende identificar III Em uma reação de multiplex utilizando o PCR em Tempo Real é importante a determinação das moléculas de reporter utilizadas pois cada uma ligada às respectivas sondas vai possibilitar a identificação de diferentes genes IV FAM HEX e Cy5 são exemplos de reporters utilizados no PCR em Tempo Real Marque a opção correta a É falsa apenas a afirmativa I b São verdadeiras todas as afirmativas c São verdadeiras somente as afirmativas I III e IV d É falsa apenas a afirmativa IV e São verdadeiras somente as afirmativas I II e IV 02 CONHECIMENTO A técnica da chamada PCR em Tempo Real foi descrita pela primeira vez por Higuchi e colaboradores no ano de 1993 Os pesquisadores montaram um sistema onde tinha uma câmera acoplada que monitorava a PCR em todos os ciclos permitindo desta forma a detecção do aumento de fluorescência durante a reação Analise as afirmativas abaixo I Um dos problemas observados no PCR Convencional é que poderia apresentar uma saturação do sistema que só era identificada após a execução do mesmo significando um prejuízo de tempo e reagentes Já o PCR em Tempo Real ao apresentar o sistema saturado interrompe as reações e quantifica o resultado final O PCR em Tempo Real ocorre em um tempo menor devido a esta interrupção dos ciclos II No qPCR a primeira molécula a se acender e ser quantificada é o reporter 192 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA III Quando fazemos um 2º PCR tendo como material uma amostra amplificada anteriormente por um 1º PCR chamamos de qPCR IV A DNA Polimerase utilizada na metodologia do PCR em Tempo Real possui atividade endonucleásica permitindo sua utilização nesta metodologia Assinale a alternativa correta a São falsas apenas as afirmativas I e III b São verdadeiras somente as afirmativas II e III c São falsas todas as afirmativas d É verdadeira apenas a afirmativa II e São falsas apenas as afirmativas II e IV 03 CONHECIMENTO As técnicas atuais de Biologia Molecular trouxeram grandes avanços em diversas áreas principalmente na saúde O conhecimento de conceitos básicos bem como o avanço das tecnologias serão fundamentais para o entendimento de todo o procedimento de utilização destas poderosas ferramentas Classifique as afirmativas abaixo como verdadeiras V ou falsas F No histórico da identificação de vínculo familiar temos a análise do fenótipo dando se início ao processo de identificação Logo em seguida surgiu a análise do HLA depois deste a identificação baseada no sistema ABO Rh e por fim a análise do DNA No sequenciamento automático utilizase ddNTP ligado a fluorocromos As análises das bandas referidas em um teste de paternidade são analisadas em um gel de eletroforese comparando mãe filho e suposto pai O PCR em Tempo Real permite a validação dos resultados sem o perigo de quantificação fora da faixa confiável do método As sondas de paternidade podem analisar regiões únicas do genoma ou diversas regiões simultaneamente sendo estas últimas as mais utilizadas Separamos o produto do sequenciamento automático por capilar Sobre as afirmativas acima ao classificar as mesmas como verdadeiras V ou falsas F a ordem correta é a V F F V V V b F V F V F V c F V F F F V d F F F V F V e F V V V F V 193 BIOLOGIA MOLECULAR E BIOTECNOLOGIA REFERÊNCIAS BUDOWLE B GE J CHAKRABORTY R EISENBERG A J GREEN R MULERO J LAGACE R HENNESSY L Population genetic analyses of the NGM STR loci Int J Legal Med v 125 p 101 109 2011 BORGESOSÓRIO Maria Regina Lucena ROBINSON Wanyce Miriam Genética humana 3ª Ed Porto Alegre ArtMed 2013 CAETANO R VIANNA C M M THULER L GIRIANELLI V Custoefetividade no diagnóstico precoce do câncer de colo uterino no Brasil Physis 2006 16 1 99 118 DILL K GHINDILIS A Electrochemical Detection on Microarrays In Dill K Ghindilis A editors Microarrays Preparation Microfluidics Detection Methods and Biological Applications New York Springer 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