Tecnologia de PCR e RTPCR em Tempo Real e Suas Aplicações na Área Médica

See discussions stats and author profiles for this publication at httpswwwresearchgatenetpublication284719832 Tecnologia de PCR e RTPCR em tempo real e suas aplicações na área médica Article in Revista Brasileira de Medicina November 2010 CITATIONS 5 READS 20718 1 author Eloah Rabello Suarez Universidade Federal do ABC UFABC 23 PUBLICATIONS 423 CITATIONS SEE PROFILE All content following this page was uploaded by Eloah Rabello Suarez on 26 November 2015 The user has requested enhancement of the downloaded file 11262015 Moreira Jr Editora RBM Revista Brasileira de Medicina httpwwwmoreirajrcombrrevistasaspidmateria4499faseimprime 19 Home Busca Avançada Normas de Publicação Assinaturas Fale Conosco Contact Us CopyRight Grupo Editorial Moreira Jr Edições por Data de Publicação Gostou do artigo Proibida a reprodução sem autorização expressa RBM Revista Brasileira de Medicina Pediatria Moderna curta nossa página no Facebook Tecnologia de PCR e RTPCR em tempo real e suas aplicações na área médica Real time PCR and RTPCR technology and its applications in the medicine field Sabrina Nascimento Estudante de Mestrado Disciplina de Bioquímica da Faculdade de Medicina do ABC Eloah Rabello Suarez MSc Mestre Disciplina de Bioquímica da Faculdade de Medicina do ABC Disciplina de Biologia Molecular da Universidade Federal de São Paulo Maria Aparecida da Silva Pinhal PhD Disciplina de Bioquímica da Faculdade de Medicina do ABC Disciplina de Biologia Molecular da Universidade Federal de São Paulo Correspondência Maria Aparecida da Silva Pinhal Professora titular da Disciplina de Bioquímica Faculdade de Medicina do ABC Avenida Príncipe de Gales 821 CEP 09060650 Santo André SP Tel 11 49935499 Fax 11 49935426 Email maspinhalyahoocombr RBM Nov 10 V 67 Especial Oncologia Indexado LILACS S003472642010006400002 Unitermos RTPCR PCR em tempo real técnicas de pesquisa aplicação médica Unterms RTPCR real time pcr investigative techniques medical aplication Sumário O dogma central da biologia molecular é formado por três processos a síntese de DNA replicação síntese de RNA transcrição e síntese de proteínas tradução Tais processos podem ocorrer in vitro por mecanismos que mimetizam os mecanismos de replicação e transcrição por reação de amplificação em cadeia da DNA polimerase PCR e por RTPCR que corresponde à reação de transcrição reversa seguida da amplificação por PCR Howard Temin em 1961 foi pioneiro em juntar evidências que comprovaram certa inconsistência com o dogma central da biologia molecular para provar a existência da transcriptase reversa Temin focava seus estudos em retrovírus o Rous sarcoma vírus RSV capaz de transformar células normais em células tumorais Temin propôs que o mecanismo de transformação do RSV seria a conversão do seu material genético RNA em DNA e comprovou que o mecanismo de transformação de células normais em tumorais era bloqueado por inibidores da síntese de DNA Tal hipótese foi confirmada por outro pesquisador David Baltimore na mesma época que conseguiu isolar a enzima transcriptase reversa do vírus de leucemia murina Rauscher RMLV Temin e Baltimore receberam o Prêmio Nobel de Fisiologia e Medicina em 1975 pela descoberta da transcriptase reversa1 Tal descoberta promove continuamente o desenvolvimento de inúmeras técnicas para pesquisas em saúde e avanço nas áreas de investigação clínica e precisão no diagnóstico e tratamento de doenças Este artigo tem como objetivo revisar os princípios e atualidades da tecnologia de amplificação por tempo real e suas importantes aplicações em medicina Sumary The molecular biology central dogma is composed by three process DNA synthesis replication RNA synthesis trsnacription and protein synthesis translation These processes can occur by in vitro mimetic replication and transcription mechanisms using polymerase chain reaction PCR and RTPCR that correspond to the reverse transcription followed by PCR amplification In 1961 Howard Temin began to gather evidence that was inconsistent with the molçecular biology central dogma in order to prove transcriptase reverse existence Temin focused his studies on Rous sarcoma vírus RSV capable of transforming normal cells into cancerous cells Temin proposed that the transforming mechanism is converting RNA of RSV into DNA and proved that the mechanisms to transform normal cells to tumoral cells was inhibit by DNA synthesis This hypothesis was confirmed by another research David Baltimore at the same time was able to isolated the enzyme transcriptase reverse from leukemia murine Rauscher virus RMLV Temin and Baltimore received the Nobel Prize for Physiology and Medicine in 1975 for the discovery of reverse transcripatase1 This discovery promotes continuously so many development of techniques for health research and improvement in the clinical investigation and more precise diagnostic and disease treatment This article has the aim to revise the actual principles of real time amplification technology and its important medical applications Numeração de páginas na revista impressa 7 à 19 Resumo O dogma central da biologia molecular é formado por três processos a síntese de DNA replicação síntese de RNA transcrição e 11262015 Moreira Jr Editora RBM Revista Brasileira de Medicina httpwwwmoreirajrcombrrevistasaspidmateria4499faseimprime 29 síntese de proteínas tradução Tais processos podem ocorrer in vitro por mecanismos que mimetizam os mecanismos de replicação e transcrição por reação de amplificação em cadeia da DNA polimerase PCR e por RTPCR que corresponde à reação de transcrição reversa seguida da amplificação por PCR Howard Temin em 1961 foi pioneiro em juntar evidências que comprovaram certa inconsistência com o dogma central da biologia molecular para provar a existência da transcriptase reversa Temin focava seus estudos em retrovírus o Rous sarcoma vírus RSV capaz de transformar células normais em células tumorais Temin propôs que o mecanismo de transformação do RSV seria a conversão do seu material genético RNA em DNA e comprovou que o mecanismo de transformação de células normais em tumorais era bloqueado por inibidores da síntese de DNA Tal hipótese foi confirmada por outro pesquisador David Baltimore na mesma época que conseguiu isolar a enzima transcriptase reversa do vírus de leucemia murina Rauscher RMLV Temin e Baltimore receberam o Prêmio Nobel de Fisiologia e Medicina em 1975 pela descoberta da transcriptase reversa1 Tal descoberta promove continuamente o desenvolvimento de inúmeras técnicas para pesquisas em saúde e avanço nas áreas de investigação clínica e precisão no diagnóstico e tratamento de doenças Este artigo tem como objetivo revisar os princípios e atualidades da tecnologia de amplificação por tempo real e suas importantes aplicações em medicina Introdução Para que a amplificação de segmentos de DNA ocorra por PCR convencional também denominado PCR semiquantitativo é necessário um par de oligonucleotídeos iniciadores específicos que reconheçam o DNA que deve ser amplificado denominado primers desoxirribonucleotídeos trifosfatados e a enzima DNA polimerase como exemplo a Taq DNA polimerase muito utilizada nos ensaios em laboratórios Os ciclos da PCR estão esquematizados na Figura 1 e são representados por desnaturação da dupla fita do DNA por rompimento das pontes de hidrogênio reconhecimento dos primers com o segmento específico do DNA anelamento ou hidridização seguido da polimerização da nova fita de DNA pela incorporação dos nucleotídeos à extremidade 3 dos primers iniciadores assim as cadeias sofrem extensão no sentido 5 3 Pode ser observado na Figura 1 que os ciclos de anelamento e extensão da PCR em tempo real ou PCR quantitativo qPCR ocorrem concomitantemente isto porque o produto obtido em tal reação deve apresentar no máximo 100 pb o que não ocorre para o PCR semiquantitativo A reação de transcrição reversa seguida da reação da polimerase em cadeia RTPCR possui como molde inicial a molécula de RNA como previamente citado e gera cDNA a partir de desoxirribonucleotídeos trifostatados A reação inicial de transcrição reversa ocorre em geral a 420C por 30 a 60 minutos Após a obtenção do cDNA uma alíquota desta amostra de cDNA é utilizada para a reação de amplificação por PCR Figura 1 Esquema comparativo das reações de amplificação por PCR convencional e em tempo real Os ciclos da PCR convencional também denominada PCR semiquantitativa são diferentes quando comparados aos ciclos da PCR em tempo real ou quantitativa qPCR como podemos observar nos esquemas acima No eixo Y está representado a temperatura 0C e no eixo X o tempo minutos Síntese de cDNA O DNA complementar cDNA isto é a fita de DNA sintetizada pela transcriptase reversa a partir do molde de RNA corresponde à forma mais conveniente de se manipular a sequência de codificação do RNA mensageiro RNAm isto porque o RNA é uma molécula facilmente degradada por enzimas denominadas RNases Para a síntese do cDNA é necessário o molde de RNAm os desoxirribonucleotídeos trifosfatados dNTPs dGTP dCTP dATP e dTTP a enzima transcriptase reversa e oligonucleotídeos iniciadores também denominados primers Três tipos diferentes de primers são usados para a síntese de cDNA 1 No caso de RNAm de eucariotos que possuem uma cauda de poliadenosinas na extremidade 3da molécula cauda poliA é utilizado um primer denominado oligodT que contém 18 nucleotídeos de timidina e consequentemente hibridizará com todos os RNAs mensageiros de células eucarióticas simultaneamente 2 Opcionalmente pode ser utilizado um coquetel de primers chamado comumente de Random primers que aleatoriamente se ligam às moléculas de RNAm não exclusivamente e servem de molde para a reação da transcrição reversa eobtenção do cDNA 3 A terceira opção pode ser uma sequência de oligonucleotídeo específica ao RNAm que é o alvo de amplificação da transcriptase reversa Tal opção é menos frequentemente utilizada tendo em vista que as moléculas de RNA mensageiro representam apenas aproximadamente 1 do RNA total presente nas células e consequentemente a probabilidade de um primer desenhado para uma molécula específica de RNA hibridizar com seu RNAalvo é muito pequena antes de uma reação de amplificação Uma vantagem da utilização de primers de oligo dT é que sua sequênciaalvo é linear contendo dezoito nucleotídeos que facilmente sofrem hibridização Os random primers que possuem sequências aleatórias são oligômeros curtos com sequências variáveis normalmente apresentam seis ou nove nucleotídeos constituídos por todas as combinações possíveis das quatro bases nitrogenadas Como existem todas as combinações possíves na mistura destes primers os mesmos podem ligar em qualquer parte do RNA Portanto tais primers poderão também hibridizar com moléculas de RNA transportadores e RNA ribossômicos podendo deste modo interferir na conversão exclusiva dos RNAs mensageiros em cDNA Deste modo os random primers apresentam a vantagem de apresentar teoricamente altos rendimentos em contraposição aos primers de oligo dT sendo essencial sua utilização quando a expressão de um determinado gene é muito limitada A utilização de primers que apresentam sequências específicas desenhadas para hibridizarem com o RNA mensageiro RNAm alvo é a estratégia preferida quando um número limitado de RNAs mensageiros serão analisados A eficiência da hibridização de primers específicos para a sequência de RNAm é dependente da conformação do RNAmalvo definida por suas estruturas secundárias e terciárias3 Existem diversas vantagens na utilização de reações de PCR em tempo real como mostra a Figura 2 O método qualitativo que era aplicado como semiquantitativo antes da criação do PCR em tempo real é baseado na amplificação das sequênciasalvo seguidas por eletroforese em gel de agarose para detecção do DNA amplificado com um corante capaz de intercalar no DNA e fluorescer sob exposição à luz ultravioleta tal como o brometo de etídio Esta metodologia possui inúmeras desvantagens dentre elas podemos destacar o fato de permitir a detecção dos produtos de reação apenas no final de todos os ciclos de termociclagem entre 25 e 30 ciclos momento no qual o DNAalvo se encontra amplificado em condições de saturação como observado na Figura 2 Mesmo após 11262015 Moreira Jr Editora RBM Revista Brasileira de Medicina httpwwwmoreirajrcombrrevistasaspidmateria4499faseimprime 39 correção pela intensidade de expressão de genes endógenos utilizados como controle da reação housekeeping muitas vezes não é possível detectar diferenças na expressão de determinados genes não sendo possível observar diferenças reais de expressão gênica Portanto em estudos de análises de PCR semiquantitativa deve ser realizada uma padronização do número de ciclos de termociclagem para detecção da reação no início da fase exponencial de amplificação de cada amostra o que é bastante variável e pode resultar em falsonegativos Figura 2 Comparação entre o PCR quantitativo e semiquantitativo A curva indica na fase exponencial a capacidade de detecção de reações pela técnica de PCR em tempo real utilizando fluoróforos Entretanto nas reações de PCR semiquantitativo a detecção das reações de amplificação é realizada por eletroforese e a visualização do DNA é feita utilizandose brometo de etídio Na PCR semiquantitativa a reação só pode ser visualizada em altos ciclos de amplificação isto é em condição de saturação consequentemente pequenas diferenças de expressão gênica dificilmente podem ser detectadas em tal ensaio A técnica de PCR em tempo real por sua vez permite a detecção ciclo a ciclo com elevada sensibilidade e especificidade da intensidade de fluorescência emitida em decorrência da amplificação da sequência de DNAalvo possibilitando a análise comparativa da expressão de tal gene entre as amostras logo no ínício da fase exponencial de amplificação em que não há saturação da amplificação eliminando um viés da técnica semiquantitativa Figura 2 Em alguns casos as reações de RT e PCR podem ser combinadas em uma única reação Tal processo é conveniente quando se analisa apenas um ou poucos genes No entanto as condições ideais para a reação de RT e PCR em tempo real geralmente são processadas separadamente visto que as reações que ocorrem em uma única etapa tendem a apresentar menor sensibilidade quando comparadas normalmente com os resultados obtidos de reações que ocorrem em duas etapas4 Durante a realização qRTPCR falsos sinais positivos podem surgir a partir da amplificação do gene ou pseudogene no caso de contaminação das amostras por DNA genômico Este problema pode ser evitado se os primers utilizados na PCR subsequente à transcrição reversa hibridizarem em dois éxons diferentes de forma que tenha pelo menos um íntron entre as regiões de hibridização Outro cuidado a ser tomado é a não contaminação com DNA portanto o tratamento das amostras com DNase e testes para verificar se houve contaminação por DNA genômico deve ser constante para toda a reação5 Cumpre ser observado que a eficiência das reações de amplificação por RTPCR depende de diversos fatores tais como o cuidado nas pipetagens a qualidade e integridade das amostras molde de RNA e cDNA desenho dos primers condições de termociclagem temperatura de desnaturação anelamento dos primers qualidade e quantidade dos reagentes e também o tamanho do produto a ser amplificado Condições específicas para cada experimento devem ser padronizadas O desenho dos primers é um dos principais fatores limitantes para a eficiência da técnica da PCR em tempo real e deve seguir uma série de regras Os primers devem apresentar temperatura de anelamento ideal entre 58 e 60C para eficiência do ciclo padrão de termociclagem que consiste em uma primeira etapa de desnaturação realizada geralmente em 95ºC por 10 minutos e 35 ciclos de 95ºC por 15 segundos para abertura das fitas seguida de 60ºC por 60 segundos para anelamento dos primers e extensão dos fragmentos pela DNA polimerase Se as sequênciasalvo forem de cDNA os primers devem ser desenhados para uma região localizada entre dois éxons evitandose a amplificação de DNA genômico por eventual contaminação Deve ser verificada também a possibilidade de formação de homodímeros heterodímeros e de hairpin entre os primers Figura 3 Para evitar a formação de tais estruturas indesejáveis principalmente quando são aplicados sistemas de fluorescência que reconhecem inespecificamente fita dupla de DNA devemos verificar o valor de variação de energia livre de Gibbs DG para a ocorrência destas interações O valor de DG deve ser positivo indicando menor probabilidade de formação espontânea destes dímeros indesejáveis entre os primers Pela mesma razão os produtos de amplificação devem apresentar entre 80 e 150 pares de bases pb e a quantidade de guanina e citosina não deve ultrapassar 50 do total de bases nitrogenadas presentes nos primers uma vez que tais bases fazem três ligações de hidrogênio em suas interações enquanto adenina e timina fazem apenas duas podendo formar estruturas diméricas indesejáveis entre os primers com maior força de interação reduzindo a eficiência da interação dos mesmos com o DNAalvo Transcriptase reversa seguida da reação da polimerase em cadeia em tempo real RTPCR em tempo real Por ser uma técnica de elevada sensibilidade e acurácia a PCR em tempo real tem sido uma ferramenta aplicada em diversas áreas biomédicas destacandose na pesquisa básica e no diagnóstico clínicolaboratorial Figura 3 Esquema da formação de harpin A formação da estrutura de harpin representa o pareamento intracadeia por pontes de hidrogênio entre bases nitrogenadas de um segmento do primer que serve de iniciador em reações de PCR ou RTPCR Tal estrutura impede a utilização de tal primer nas reações de amplificações Na pesquisa biomédica básica a aplicação mais frequente da RTPCR PCR após transcrição reversa em tempo real é na determinação da expressão absoluta ou relativa de um gene de interesse Neste caso a extração do RNA da amostra é realizada seguida por conversão deste RNA em cDNA pela técnica de transcrição reversa e finalmente amplificação do cDNA por PCR ação da DNA 11262015 Moreira Jr Editora RBM Revista Brasileira de Medicina httpwwwmoreirajrcombrrevistasaspidmateria4499faseimprime 49 polimerase Este cDNA é utilizado nas reações da PCR em tempo real aplicandose oligonucleotídeos iniciadores primers específicos para a sequência gênicaalvo que se deseja estudaravaliar Nas reações de amplificação estão associados compostos que emitem fluorescência e apresentam correlação direta com o número de cópias amplificadas do genealvo DNA amplificado Durante a amplificação um programa de computador específico software constrói em tempo real um gráfico relacionando os ciclos de termociclagem com a intensidade de fluorescência emitida durante a amplificação do DNA nas amostras ciclo a ciclo A partir deste gráfico se deve traçar uma linha de maneira paralela ao eixo referente ao número de ciclos abscissas na altura em que se inicia a fase exponencial da amplificação gênica início da elevação exponencial na emissão da fluorescência Este parâmetro representa o limiar de detecção ou seja o número mínimo de ciclos para amplificação e é denominado threshold pelo sistema de análise software utilizado O ponto em que o threshold cruza com a linha de amplificação da amostra permite determinar o número de ciclos necessários para o início da amplificação da sequência gênicaalvo presente no DNA de cada amostra Este valor é denominado Ct Cycle Threshold e permite a quantificação relativa do DNA de cada uma das amostras após ser corrigido pelos Ct dos genes controle endógenos e das amostrascontrole O Ct é proporcional ao logaritmo da quantidade inicial de expressão do genealvo em uma determinada amostra quanto menor for o número inicial do Ct obtido do genealvo existente na amostra comparativamente com outro gene é porque houve maior amplificação do genealvo e consequentemente o mesmo apresenta maior expressão Figura 4 A expressão gênica relativa é determinada a partir da comparação da expressão do genealvo com um ou mais genes denominados housekeeping ou genes endógenoscontrole Tais genes são utilizados como controles internos da expressão gênica uma vez que apresentam expressão teoricamente constante ou seja sofrem pequena oscilação na expressão mediada por fatores reguladores externos tais como hormônios fatores de crescimento entre outros Devido a esta propriedade tais genes são utilizados para correção da expressão gênica do genealvo Como exemplos de genes housekeeping podem ser citados ciclofilina gliceraldeído 3 fosfato desidrogenase proteína ribossomal 36B4 bactina RNA ribossômico 18S receptor de transferrina entre outros2 A seguir serão apresentados alguns detalhes técnicos específicos que devem ser seguidos para o entendimento de quem deseja realizar ensaios de RTPCR ou PCR em tempo real bem como serão apresentados exemplos da aplicação de tais metodologias e suas variações nas diversas áreas clínicas e básicas da medicina Figura 4 Determinação dos ciclos de amplificação de amostras por reação em tempo real A amplificação de um determinado segmento gênico que identifica um determinado marcador tumoral em células neoplásicas B amplificação do mesmo segmento gênico em células não neoplásicas O Ct pode ser determinado pela intersecção da linha do limiar de detecção da reação threshold com a linha da amplificação gênica de cada amostra Observase menor Ct 17 para o início da fase exponencial de amplificação do marcador tumoral em células neoplásicas A indicando que tal marcador apresenta maior expressão em células tumorais comparativamente às células não neoplásicas B que apresentam Ct26 isto é menor expressão 11262015 Moreira Jr Editora RBM Revista Brasileira de Medicina httpwwwmoreirajrcombrrevistasaspidmateria4499faseimprime 59 Figura 5 Técnicas de RTPCR por tempo real A Reação de tempo real com sistema TaqMan 1A sonda fluorescente hibridiza na regiãoalvo que deve ser amplificada pelo primer sense A sonda possui fluoróforo ligado na extremidade 5reporter R responsável pela emissão da fluorescência e um composto que bloqueia a emissão desta fluorescência quencher Q 2A durante a extensão a partir do primer sense a DNA polimerase cliva o reporter e a fluorescência é emitida 3A a cada ciclo de amplificação ocorre liberação de fluorescência portanto a reação de amplificação é diretamente proporcional à fluorescência emitida B Reação de tempo real com sistema SYBR Green 1B os fluoróforos presentes no SYBR Green ligamse em toda a dupla fita de DNA formada emitindo fluorescência 2B Durante a desnaturação da dupla fita a fluorescência é drasticamente reduzida 3B durante a extensão das novas fitas no processo de polimerização da DNA polimerase os fluoróforos se ligam às duplas fitas em formação resultando na emissão de fluorescência TaqMan versus Sybr Green Comercialmente existem várias especificações para os instrumentos disponíveis para realização da técnica de PCR em tempo real incluindo diferentes formatos de sondas de ácidos nucleicos aplicáveis comprimentos de onda de excitação e detecção de fluoróforos específicos o número máximo de amostras por corrida volumes de reação e tempos de termociclagem No entanto em relação aos reagentes de amplificação há dois sistemas precursores SybrGreen e TaqMan que deram origem a diferentes produtos similares disponíveis atualmente no mercado Cada um destes sistemas apresenta vantagens e desvantagens que podem ser observadas analisandose a Tabela 1 O mecanismo de funcionamento de ambos os métodos está ilustrado na Figura 5 itens A e B Os itens 1 2 e 3A da Figura 5 esquematizam o funcionamento do sistema TaqMan de amplificação de DNA por tempo real No item 1A pode ser observada a hidridização de sonda fluorescente na região complementaralvo que deve ser amplificada na fita 53 A sonda possui um fluoróforo ligado na extremidade 5 também conhecido por reporter R o qual é responsável pela emissão da fluorescência e um composto denominado quencher Q localizado no terminal 3 que impede a emissão da fluorescência do repórter Em 2A durante a extensão a partir do primer sense realizada pela DNA polimerase ocorre clivagem do repórter com consequente emissão da fluorescência sendo que a cada ciclo de amplificação ocorre liberação de fluorescência Figura 5 item 3A portanto a reação de amplificação é diretamente proporcional à fluorescência emitida A Figura 5 item B mostra o funcionamento do sistema SYBR Green de amplificação de DNA por tempo real Os fluoróforos presentes no SYBR Green se ligam em toda a dupla fita de DNA formada emitindo fluorescência Figura 5 item 1B Durante a desnaturação da dupla fita a fluorescência é drasticamente reduzida Figura 5 item 2B Porém como podemos verificar no item 3B Figura 5 durante a extensão das novas fitas por ação da DNA polimerase os fluoróforos se ligam às duplas fitas em formação resultando na emissão de fluorescência que também é diretamente proporcional à amplificação do DNAalvo6 Figura 6 Determinação da curva de dissociação na reação de RTPCR tempo real A curva de dissociação ideal formação de um único produto B formação de dois picos sendo um com temperatura entre 80 e 87ºC relativo ao produto de amplificação e um único pico de baixa intensidade com temperatura de dissociação inferior sugerindo a formação de produto inespecífico na reação de amplificação C dímeros de primers formação de uma ondulação na base da curva sugerindo a presença de dímeros de primers ou outros produtos inespecíficos Curva de dissociação dos primers Para a realização da curva de dissociação dos primers também denominada curva de melting devese ajustar o aparelho para iniciar a temperatura por volta dos 70ºC e variar de grau em grau até no máximo 95ºC Este procedimento é realizado pelo aparelho após o ciclo de amplificação da PCR em tempo real Neste processo pode ser determinado o ponto correspondente à temperatura de dissociação dos primers de suas sequênciasalvo A inclusão da curva de dissociação é essencial para verificar se houve formação de um único produto ou se produtos inespecíficos também foram formados O aparecimento de um único pico na curva de melting sugere a existência de um único produto Figura 6A porém se for observado o aparecimento de vários picos na curva podese considerar a hipótese de formação de produtos inespecíficos na reação Figura 6B ou a eventual formação de dímeros de primers denominados primerdimers Figura 6C Durante a padronização da reação se sugere a realização de eletroforese em gel de agarose para confirmação da presença destes produtos indesejáveis6 Padronização da PCR em tempo real A padronização da concentração dos primers de cada amostra é realizada com um cDNAcontrole isto é uma amostra de cDNA obtido de células ou tecido que apresenta expressão conhecida da sequência a ser amplificada pelo conjunto de primers É necessária a realização de uma diluição seriada dos primers para a padronização da melhor concentração para a realização da amplificação Sugere se primeiramente a utilização do cDNAcontrole concentrado para a padronização e os primers variando nas diluições de 05 µM a 30 µM Após a determinação da menor concentração dos primers capaz de amplificar o cDNA adequadamente partimos para a elaboração da curva de eficiência Para obtenção da melhor eficiência da reação devem ser realizadas diluições seriadas em base duas das amostras de cDNA utilizando as mesmas concentrações de primers determinadas previamente Como a amplificação é exponencial deve haver uma diferença de um Ct na amplificação de cada uma das diluições seriadas realizadas sendo que a mais concentrada por exemplo 12 deve apresentar um Ct menor que a mesma amostra diluída 14 como podemos observar na Figura 7 Quando traçamos uma reta relacionando a potência da diluição abscissas e o Ct ordenadas será obtida a chamada curva de eficiência do primer a qual deve apresentar o valor de R2 mais próximo possível de 1 100 Se a eficiência do primer for um pouco menor que 100 a 11262015 Moreira Jr Editora RBM Revista Brasileira de Medicina httpwwwmoreirajrcombrrevistasaspidmateria4499faseimprime 69 mesma deve ser usada na correção dos cálculos de expressão relativa uma vez que a reação não irá mais apresentar 21 cópias por ciclo e sim 2x sendo x igual à eficiência dos primers A Figura 8 mostra uma curva de eficiência ideal obtida de uma reação de RTPCR padronizada para reação de tempo real evidenciando os valores obtidos de Ct em relação às diferentes concentrações de amostras de cDNA Uma série de fatores pode influenciar esta análise e a otimização da reação consiste em compensar esses fatores para obter a razão de 16 Após a padronização das condições adequadas para a reação e a realização das amplificações de DNA devem ser realizados os cálculos para determinação da expressão relativa ou absoluta de DNA nas amostras Na determinação da expressão relativa deve ser calculada primeiramente a relação entre o gene referência controle endógeno ou housekeeping e o genealvo gene em estudo em todas as amostras Este índice é denominado DCt Deve ser calculado o DDCt que é a correção do DCt das amostras pelo DCt do grupo controle o qual pode ser calculado subtraindose o DCt da amostra pela média dos DCts da triplicata de seus controles Este valor deve ser multiplicado por 1 Em seguida devese calcular 2DDCt se a eficiência do primer for 100 ou seja se a amplificação estiver sendo feita de maneira exponencial em base 2 Caso contrário o número 2 deve ser corrigido pela eficiência dos primers determinada previamente O 2DDCt deve ser considerado 1 para a amostracontrole pois valor de DCt da amostra menos o valor obtido da própria amostra é igual a zero e 20 1 6 Figura 7 Padronização da reação de RTPCR tempo real Diluição em série das amostras de cDNAcontrole obtido de células ou tecidos para a mesma concentração de primers A reação de amplificação é realizada de forma exponencial portanto observase que a cada diluição do cDNA em base 2 o número de ciclos Ct aumenta uma vez Tanto a expressão gênica relativa quanto a absoluta determinada pela PCR em tempo real utilizam o valor de Ct como referência para a quantificação da expressão de determinada sequência gênicaalvo Entretanto na quantificação absoluta o valor Ct é comparado com uma curva padrão de amplificação do genealvo utilizandose um padrão com concentração inicial conhecida número de cópias de DNAuL em diferentes diluições Desta maneira o Ct determinado na amostra desconhecida pode ser relacionado com o Ct determinado na curva padrão o qual se relaciona diretamente a uma concentração específica de DNA Aplicações da PCR em tempo real Perfilamento genético ou microarray No campo da pesquisa básica a PCR em tempo real tem sido utilizada também para a validação de resultados de microarray O microarray é uma técnica de hibridização que permite a investigação da análise da expressão de milhares de genes ao mesmo tempo Para tal utiliza matrizes contendo sondas complementares a diversos genes e permite por técnicas de hibridização com o cDNAalvo marcado com fluoróforo avaliar a expressão gênica Alguns arrays possuem todo o genoma de um organismo e podem ser utilizados para avaliar alterações da expressão gênica transcriptoma O problema é que o método é basicamente qualitativo e não permite uma análise estatisticamente confiável e de fácil correlação Por tal motivo a PCR em tempo real é utilizada como uma técnica de apoio para validar e quantificar os genes escolhidos nas análises de microarray8 Polimorfismos A identificação de mutações pontuais ou polimorfismos de nucleotídeos muito utilizadas nas áreas clínica e de pesquisa básica pode ser feita por análise da curva de dissociação obtida após a amplificação por PCR em tempo real Esta técnica é adequada para avaliar mutações incluindo polimorfismos contendo um único nucleotídeo modificado substituindo muitas vezes outras técnicas muito mais trabalhosas e de maior custo como sequenciamento ensaios de polimorfismo de conformação de fita única ou análises de polimorfismo de fragmentos de restrição RFLP9 Para detecção de mutações na sequênciaalvo é necessária a análise do produto amplificado amplicon na curva de dissociação que é realizada automaticamente após a termociclagem por PCR em tempo real Figura 8 Curva de eficiência ideal para um determinado par de primers Esta curva é desenhada colocandose a concentração predeterminada por espectrofotometria dos cDNAs diluídos no eixo das abscissas e o Ct para amplificação de cada cDNA no eixo das ordenadas utilizandose para tal reação um determinado par de primers A reta média traçada a partir da média de Cts de cada diluição de cDNA deve apresentar seu R2 o mais próximo possível de 100 indicando 100 de eficiência de um determinado par de primers em amplificar o cDNAalvo exponencialmente a cada ciclo Portanto para a detecção destas mutações é necessária a utilização da técnica de PCR em tempo real baseada no uso de sondas de hibridização denominada FRET fluorescence resonance energy transfer energia de ressonância transferida por fluorescência Nesta técnica são utilizadas duas sondas de DNA desenhadas que sofrem hibridização próximas no produto da PCR sendo que a extremidade 3 da primeira sonda fique próxima à extremidade 5 da sonda adjacente A primeira sonda apresenta um fluoróforo ligado a sua extremidade 3 e a segunda sonda apresenta um fluoróforo aceptor da fluorescência emitida pela primeira sonda em sua extremidade 5 Se ambas as sondas sofrem hibridização o produtoalvo da PCR a fluorescência da extremidade 3 é absorvida pelo aceptor localizado na extremidade 5 da segunda sonda e assim o segundo fluoróforo é excitado e emite luz em outro comprimento de onda o qual é detectado pelo aparelho Se as duas sondas não hibridizam devido a não existência de uma sequência de DNA complementar não ocorre o FRET entre os dois fluoróforos e consequentemente não há emissão da última fluorescência10 Como a temperatura aumenta durante a curva de melting a sonda doadora de fluorescência irá dissociarse do amplicon resultando 11262015 Moreira Jr Editora RBM Revista Brasileira de Medicina httpwwwmoreirajrcombrrevistasaspidmateria4499faseimprime 79 em uma diminuição da fluorescência Se houver qualquer mutação na região de hibridização do amplicon a sonda doadora ligará de maneira mais fraca e se dissociará do amplicon em temperaturas mais baixas11 Genotipagem e discriminação alélica Além da análise da curva de melting a técnica de PCR multiplex também pode ser aplicada Neste caso vários produtos gênicos diferentes são amplificados no mesmo tubo Em tal ensaio são utilizados primers sintéticos marcados com fluoróforos com emissão em diferentes comprimentos de onda permitindo a múltipla detecção dos polimorfismos Entretanto este tipo de ensaio apresenta maior dificuldade de realização pois conforme os diferentes produtos se acumulam durante o processo as diferentes reações competem pelos reagentes Para minimizar este problema devem ser utilizadas quantidades limitantes de primers devendo ser muito bem desenhados para evitar complementaridade entre si Além disso a utilização de sondas é preferencial ao uso de primers marcados com fluorescência3 Este tipo de análise pode ser aplicada na genotipagem de indivíduos ou organismos experimentais permitindo por exemplo a discriminação alélica ou a detecção de mutações pontuais que predisponham os indivíduos a doenças genéticas particulares Detecção de translocações cromossômicas Em relação às aplicações em oncologia a PCR em tempo real permite a detecção e em certos casos a quantificação de translocações cromossômicas ou de seus transcritos de fusão gênica em uma amostra do paciente para uso na determinação de doença residual mínima ou para avaliar a possibilidade de progressão da doença Pode ser citada como exemplo a detecção de alguns dos possíveis produtos de rearranjos encontrados na leucemia linfoblástica aguda a avaliação do produto de fusão do gene AML1MTG8 utilizado como marcador de doença residual mínima na leucemia mieloblástica aguda a resposta de pacientes ao tratamento com interferon por medida do produto de fusão dos genes BCRABL frequentemente encontrado na leucemia mieloide crônica entre outros12 Farmacogenética O uso da PCR em tempo real no campo da farmacogenética tem sido ampliado atualmente no intuito de analisar a expressão gênica em resposta a determinados tratamentos medicamentosos Tal análise permite uma melhor seleção do medicamento para um paciente e permite a determinação da cinética de ação de um medicamento através da avaliação da expressão do genealvo em resposta ao tratamento ou a resposta de transportadores ou enzimas do metabolismo que facilitem a distribuição ou a eliminação do fármaco Pode ainda auxiliar no teste de novos medicamentos e na verificação de seu potencial mutagênico por exemplo13 A resposta aos medicamentos varia muito entre os indivíduos o que faz com que a escolha de um determinado fármaco seja muitas vezes difícil Diversos fatores genéticos afetam o metabolismo e o transporte de medicamentos no organismo sendo as principais causas da variação individual ao tratamento medicamentoso A existência de polimorfismos nos genes que codificam para as enzimas que metabolizam medicamentos separa a população em geral em diferentes classes de indivíduos em função de suas capacidades metabólicas relacionadas a uma determinada enzima Dessa maneira os métodos de genotipagem permitem determinar ou predizer o status metabólico do indivíduo e saber se ele apresentará o risco de ineficácia ou de toxicidade a um determinado medicamento que depende de uma determinada enzima para exercer sua atividade A validação clínica de testes farmacogenéticos irá contribuir de maneira significativa para o rápido desenvolvimento da farmacogenética dentro da prática médica corrente com a perspectiva de uma individualização do tratamento medicamentoso e melhora na resposta terapêutica Diversos estudos farmacogenéticos têm sido realizados na área oncológica permitindo um tratamento cada vez mais individualizado e eficiente1415 O uso do tempo real em microbiologia e doenças infectocontagiosas A PCR em tempo real também permite a distinção de sequências específicas dentro de uma mistura complexa de DNA o que faz com que na área de apoio ao diagnóstico tal técnica seja utilizada na determinação específica da presença e quantidade de determinados vírus bactérias ou fungos Devido à relação entre a carga viral e a gravidade da doença a PCR em tempo real por ser um método quantitativo é capaz de mensurar indiretamente a progressão da doença e a eficácia das terapias antivirais O uso da PCR em tempo real na detecção e identificação de bactérias também é um campo em expansão Atualmente quando uma amostra chega ao laboratório clínico é necessário primeiro que a bactéria presente na amostra cresça em meio de cultura somente assim a mesma pode ser identificada de maneira presuntiva Ainda para determinar o espectro de sensibilidade aos antibióticos de cada cepa a mesma deve crescer em uma placa contendo meio de cultura na presença de pequenos discos de papel impregnados de antibióticos ou seja a identificação associada ao antibiograma demora no mínimo três dias para ser concluída A substituição deste processo pelo uso da PCR em tempo real principalmente no sentido de viabilizar o rápido acesso ao espectro de sensibilidade da bactéria facilitaria infinitamente a prescrição adequada de antibióticos Um dos principais impactos sentidos seria a minimização da utilização em massa de antibióticos de amplo espectro de alta potência em casos desnecessários reduzindo os custos associados Além disso permitiria a detecção precoce de cepas multirresistentes a antibióticos evitando sua disseminação16 A PCR em tempo real tem sido utilizada na detecção de Mycobacterium tuberculosis Legionella pneumophila Listeria monocytogenes e Neisseria gonorrhoeae A análise de mutações tem permitido monitorar a resistência aos antibióticos de cepas de Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Helicobacter pylori Enterococcus faecalis e Enterococcus faecium12 Um crescente volume de artigos publicados demonstra a utilidade da PCR em tempo real relacionada à área microbiológica A elevada sensibilidade e especificidade associada a um curto tempo para a liberação dos resultados e facilidade de realização da técnica tem feito da PCR em tempo real uma metodologia atrativa na substituição da cultura convencional e dos ensaios baseados em antígenos 10 Entretanto existem limitações no uso da PCR em tempo real aplicada à microbiologia Em contraposição aos métodos de cultura bacteriana tradicionais esta técnica é baseada na amplificação do DNA bacteriano e portanto não diferencia entre patógenos vivos e mortos12 A associação de ambas as técnicas crescimento tradicional da bactéria em meios de cultura com posterior identificação e determinação do espectro de sensibilidade a antibióticos por PCR em tempo real poderia ser uma estratégia adotada para controlar este problema As bactérias tradicionalmente identificadas por imunoensaios diretos tais como estreptococos do grupo A comuns em infecções de garganta e Clostridium difficile e Escherichia coli O157H7 presente nas fezes possuem disponíveis reagentes e kits específicos para sua detecção por tempo real como por exemplo o LightCycler StrepA para uso no LightCycler da Roche Diagnostics Corporation para detecção de estreptococos do grupo A e os kits IDIStrepB assay para uso com o SmartCycler da Infectio Diagnostics Inc SainteFoy Quebec Canada LightCycler StrepB pts1 Roche Diagnostics Corporation para detecção de estreptococos do grupo B10 As bactérias de crescimento lento eou difícil em cultura também se beneficiaram das técnicas de tempo real para sua identificação como exemplos podem ser citadas Anaplasma phagocytophila Bartonella henselae Bordetella pertussis Borrelia burgdorferi Ehrlichia spp Legionella spp Mycoplasma pneumonia Chlamydophila pneumonia assim como bactérias para as quais ainda não existem métodos de identificação tais como a Tropheryma whipplei A PCR em tempo real tem sido utilizada também na identificação de agentes causadores de pneumonia comunitária tais como Chlamydophila pneumoniae Mycoplasma pneumoniae Legionella spp e Streptococcus pneumoniae de agentes causadores da meningite Neisseria meningitidis Streptococcus pneumoniae e Haemophilus influenzae10 Por ser uma técnica que permite a obtenção de resultados rápidos a PCR em tempo real tem sido utilizada atualmente na identificação de potenciais agentes de bioterrorismo tais como Bacillus anthracis e Yersinia pestis Outro campo de aplicação da PCR em tempo real dentro da microbiologia é a identificação de genes bacterianos envolvidos na resistência à terapêutica com antibióticos em contraposição às técnicas de antibiograma em placa Tal abordagem é essencial para a identificação de cepas de Staphylococcus aureus meticilina oxacilinaresistentes MRSA ou Enterococcus spp resistentes a vancomicina VRE as quais representam uma ameaça à saúde e altos custos associados Dois fabricantes apresentam kits comercialmente disponíveis na detecção de VRE ou MRSA utilizando plataformas de tempo real a Infectio Diagnostic Inc que recebeu 11262015 Moreira Jr Editora RBM Revista Brasileira de Medicina httpwwwmoreirajrcombrrevistasaspidmateria4499faseimprime 89 aprovação de um kit para detecção direta de MRSA de swabs nasais utilizando o aparelho SmartCycler A Roche Diagnostics Corporation possui o ensaio de detecção para VRE Light Cycler vanAvanB e para MRSA LightCycler mecA detection assay ambos padronizados para uso no LightCycler10 Também foram desenvolvidos pares de primers que permitem a distinção pela PCR em tempo real de polimorfismos referentes aos loci narG oxyR and RD1 do complexo de Mycobacterium tuberculosis permitindo a diferenciação entre Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium bovis e Mycobacterium bovis BCG respectivamente10 A PCR em tempo real tem sido padronizada para a detecção e quantificação de patógenos virais em humanos Dentre eles podemos destacar vírus do herpes simples vírus do varicella Zoster citomegalovírus EpsteinBarr vírus enterovírus poliomavírus parvovírus vírus do sarcoma de Rous parinfluenza influenza entre outros1017 Na rotina assistencial de alguns laboratórios de referência seu emprego é limitado para determinação da carga viral com poucas exceções de um grupo reduzido de vírus com grande interesse econômico para os quais estão disponíveis kits comerciais bem padronizados Dentre eles podemos citar o HIV1 e 2 e os vírus das hepatites Os primeiros testes aplicados na detecção do HPV vírus do papiloma humano que possui diversos subtipos associados ao desenvolvimento do câncer de colo uterino foram desenvolvidos baseados nas técnicas de biologia molecular com o uso de sondas de oligonucleotídeos marcadas com fósforo radioativo complementares às sequências dos subtipos oncogênicos Estes testes não eram muito eficientes porque não conseguiam detectar vários subtipos de HPV ao mesmo tempo O kit atual de detecção dos HPVs por captura híbrida detecta os subtipos através de dois grupos de sondas fluorescentes diferentes misturadas as capazes de detectar os subtipos de alto risco e as capazes de detectar os de baixo risco entretanto não é capaz de discernir qual é o subtipo específico que está alterado dentro destes grupos Com o uso da PCR em tempo real se consegue determinar não somente o genótipo do vírus mas também a carga viral a partir das curvas de cinética resultantes do ensaio18 A atual pandemia causada pelo vírus da influenza A H1N1v tornou necessária a procura por metodologias que permitissem a distinção entre os diferentes tipos de vírus da influenza A maior parte dos laboratórios mundiais realizava somente a detecção do vírus influenza responsável pela gripe comum Recentemente pesquisadores desenvolveram ensaios que utilizam a técnica de PCR em tempo real para identificar facilmente os tipos e subtipos dos vírus da influenza A e B19 Algumas reações de PCR multiplex estão sendo realizadas com o intuito de permitirem a detecção simultânea de patógenos em casos de suspeita de coinfecção comuns em alguns tipos de doença como na Aids Nestes casos são detectados simultaneamente por exemplo o vírus da imunodeficiência humana1 HIV1 e o Treponema pallidum agente etiológico causador da sífilis20 Na detecção de adenovírus testes cada vez mais otimizados e rápidos têm sido desenvolvidos Um novo método conhecido como HyperPCR utiliza uma enzima Taq DNA polimerase de alta velocidade e um tubo com espessura fina que permite mudanças de temperatura decorrentes da termociclagem ainda mais rápidas em um aparelho especial O tempo total na detecção de adenovírus por esta metodologia excluindo o tempo referente a extração do material genético é de 17 minutos ou seja bem inferior à PCR em tempo real convencional a qual neste caso teve como tempo de duração 62 minutos 21 Em relação à aplicação da PCR em tempo real na detecção de fungos os principais ensaios padronizados tiveram como alvo diferentes espécies de Aspergillus A razão para tal esforço é o fato de que a rápida detecção de Aspergillus spp pode reduzir a extensa morbidade e mortalidade associadas à aspergilose invasiva Alguns ensaios foram desenvolvidos para a detecção de outros fungos tais como Candida spp e Pneumocystis jiroveci Na detecção de parasitas a PCR em tempo real tem sido aplicada principalmente na detecção do agente etiológico causador da malária o Plasmodium falciparum Alguns outros parasitas possuem ensaios padronizados tais como Babesia Trypanosoma Toxoplasma Leishmania Trichomonas Cryptosporidium Entamoeba e Giardia spp10 Na indústria alimentícia e na agricultura a PCR em tempo real tem sido utilizada na identificação de micróbios parasitas ou organismos geneticamente modificados Na área forense o uso desta técnica permite resultados de elevada sensibilidade especificidade e velocidade o que é de grande valia em maior parte das investigações criminais em que o tempo é crucial para a solução do caso e a quantidade de amostra normalmente é limitada22 Conclusão Nos últimos anos a reação em cadeia de polimerase por tempo real emergiu como uma técnica amplamente utilizada na investigação biológica devido à capacidade de amplificação e detecção simultâneas de quantidades muito pequenas de sequências específicas de ácidos nucleicos Como uma ferramenta de pesquisa é extremamente útil na determinação da expressão gênica resultante da ação de diversos fatores No diagnóstico clínicomolecular a PCR em tempo real pode ser utilizada para avaliação da carga viral ou bacteriana determinação da resistência a antibióticos e até mesmo para o prognóstico de tumores malignos Devido à realização das etapas de amplificação dos ácidos nucleicos e detecção do produto amplificado no interior de um único tubo durante a PCR em tempo real traz inúmeras vantagens na utilização desta técnica como ferramenta na pesquisa e diagnóstico Dentre elas podemos citar redução do risco de contaminação cruzada curto tempo necessário para a realização da técnica permite rápidos resultados além de apresentar execução simples associada à excelente sensibilidade e especificidade Cumpre ser observado que atualmente a utilização das tecnologias de amplificações por tempo real ainda permanecem com uso limitada devido aos elevados custos relacionados aos reagentes e principalmente aos sistemas de detecção empregados Entretanto tal viés possui a tendência de resolução em curto prazo com a ampliação e importância das aplicações multidisciplinares do uso rotineiro da PCR e RTPCR em tempo real como citado neste artigo 11262015 Moreira Jr Editora RBM Revista Brasileira de Medicina httpwwwmoreirajrcombrrevistasaspidmateria4499faseimprime 99 Bibliografia 1 Temin HM Baltimore D RNAdirected DNA synthesis and RNA tumor viruses Adv Virus Res 1972 1712986 2 Dheda K Huggett JF Bustin SA Johnson MA Rook G Zumla A Validation of housekeeping genes for normalizing RNA expression in realtime PCR Biotechniques 2004371124 3 Kubista M Andrade JM Bengtsson M Forootan A Jonak J Lind K et al The realtime polymerase chain reaction Mol Aspects Med 2006 2795125 4 Stahlberg A Hakansson J Xian X Semb H Kubista M Properties of the reverse transcription reaction in mRNA quantification Clin Chem 2004 5050915 5 Wang X Seed B A PCR primer bank for quantitative gene expression analysis Nucleic Acids Res 2003 19 796802 6 Ponchel F Toomes C Bransfield K Leong FT Douglas SH Field SL et al Realtime PCR based on SYBRGreen I fluorescence an alternative to the TaqMan assay for a relative quantification of gene rearrangements gene amplifications and micro gene deletions BMC Biotechnol 2003 13 318 7 Heid CA Stevens J Livak KJ Williams PM Real time quantitative PCR Genome Res 1996t 698694 8 Provenzano M Mocellin S Complementary techniques validation of gene expression data by quantitative real time PCR Adv Exp Med Biol 2007 5936673 9 Edwards K LJ and Saunders N Realtime PCR an Essential Guide London Horizon Bioscience 2004 10 Espy MJ Uhl JR Sloan LM Buckwalter SP Jones MF Vetter EA et al Realtime PCR in clinical microbiology applications for routine laboratory testing Clin Microbiol Rev 200619165256 11 RuizPonte C Carracedo A Barros F Duplication and deletion analysis by fluorescent realtime PCRbased genotyping Clin Chim Acta 2006 36313846 12 Valasek MA Repa JJ The power of realtime PCR Adv Physiol Educ 2005291519 13 de Chaisemartin L Loriot MA Pharmacogenetics of anticancer drugs Pathol Biol Paris 2005 5311624 14 Allorge D Loriot MA Pharmacogenetics or the promise of a personalized medicine variability in drug metabolism and transport Ann Biol Clin Paris 2004 62499511 15 Ma BB Hui EP Mok TS Populationbased differences in treatment outcome following anticancer 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