Avaliação da Permeação Cutânea In Vitro do Minoxidil a Partir de Diferentes Formulações Farmacêuticas

Universidade de Brasília Faculdade de Ciências da Saúde Bruna Caroline Cardoso Pinheiro AVALIAÇÃO DA PERMEAÇÃO CUTÂNEA IN VITRO DO MINOXIDIL A PARTIR DE DIFERENTES FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS Brasília 2017 Universidade de Brasília Faculdade de Ciências da Saúde AVALIAÇÃO DA PERMEAÇÃO CUTÂNEA IN VITRO DO MINOXIDIL A PARTIR DE DIFERENTES FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS Orientanda Bruna Caroline C Pinheiro Matrícula 120008297 Orientador Prof Dr Guilherme M Gelfuso Coorientadora Msc Thaiene Avila Reis Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à Universidade de Brasília como requisito parcial para obtenção de grau Farmacêutico Brasília 2017 FOLHA DE APROVAÇÃO Bruna Caroline Cardoso Pinheiro Avaliação da permeação cutânea in vitro do minoxidil a partir de diferentes formulações farmacêuticas Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à Universidade de Brasília como requisito parcial para obtenção de grau Farmacêutico Prof Dr Guilherme Martins Gelfuso Presidente Universidade de Brasília AGRADECIMENTOS À Deus em primeiro lugar por abençoar o meu caminho me proteger e ouvir minhas orações À minha mãe Florenice pelo amor que dedicou a mim e principalmente pelo incentivo que me deu para que eu chegasse até aqui Ao meu pai Carlos por todo o apoio que me ofereceu e pelos preciosos conselhos À Universidade de Brasília por ter me recebido e me proporcionado tantas oportunidades enriquecedoras Aos meus professores sem eles nada seria possível e serei eternamente grata Ao meu orientador Prof Dr Guilherme Gelfuso pela oportunidade e por sua atenção comigo À minha coorientadora Thaiene Avila por ter me ajudado sempre com muita paciência e carinho e por todo conhecimento e crescimento que me proporcionou Aos colegas do Laboratório de Tecnologia de Medicamentos Alimentos e Cosméticos LTMAC que me receberam bem e sempre estiveram dispostos em ajudar e tirar dúvidas Ao Ismael por todo carinho incentivo e apoio que me oferece Aos meus colegas de curso e em especial às minhas amigas Fernanda e Viviane Por fim agradeço a todos que contribuíram de alguma forma para a realização deste trabalho RESUMO A alopecia androgênica AAG é uma doença que promove alterações no ciclo folicular e gera como consequência clínica a perda de cabelo em homens e mulheres A terapia tópica com formulações a base de minoxidil em solução a 2 ou 5 é amplamente utilizada para o tratamento da AAG Para medicamentos de uso tópico o perfil de permeação está diretamente associado à eficácia do tratamento Esse estudo comparou por meio de ensaios de permeação cutânea in vitro as formulações Aloxidil Regaine Kirkland e uma quarta formulação manipulada com o objetivo constatar a qualidade das formulações à base de minoxidil presentes no mercado Os estudos de permeação foram conduzidos in vitro em células de difusão vertical do tipo Franz por um período de seis horas utilizando pele de suínos O minoxidil foi recuperado das diferentes camadas da pele estrato córneo epiderme e folículo piloso e a solução receptora foi coletada para análise O fármaco foi quantificado através de cromatografia liquida de alta eficiência CLAE utilizando método sensível previamente validado Aloxidil proporcionou uma maior quantificação do minoxidil na solução receptora e também foi a formulação que menos apresentou retenção no estrato córneo 1813 373 µgcm2 A formulação manipulada proporcionou uma ampla distribuição do fármaco pelas camadas da pele de forma geral e na solução receptora Rogaine e Kirkland foram os únicos que apresentaram um perfil de permeação semelhante entre si As formulações também foram analisadas quanto ao teor de fármaco em sua composição para as três formulações industrializadas o valor 50 mgmL informado nas bulas foi confirmado Já a formulação manipulada apresentou uma concentração superior 6608 070 mgmL Os testes de permeação realizados mostraram diferentes perfis de permeação porém o direcionamento do fármaco para o folículo piloso local de ação do minoxidil na alopecia foi semelhante entre três das quatro formulações testadas Levando em consideração a ausência de mecanismos eficientes para avaliar a bioequivalência de medicamentos tópicos no Brasil e a capacidade dos estudos de permeação cutânea em elucidar o perfil de permeação de fármacos a partir de diferentes formulações esse estudo espera ser referência para validação de estudos in vitro de permeação cutânea para avaliação de biodisponibilidade e bioequivalência de produtos tópicos Palavraschave Minoxidil Permeação cutânea Alopecia Androgênica Bioequivalência ABSTRACT Androgenic Alopecia AA is a disease that promotes changes in the folicular cycle and as a result the clinical consequence is a hair loss in men and women Topical therapy with minoxidil formulations is widely used for the AA treatment and the formulations found on the market consist of 2 or 5 minoxidil solutions The permeation profile is directly associated with the efficacy of the treatment with topical medications This in vitro skin permeation study compared Aloxidil Regaine Kirkland formulations and one manipulated formulation with the purpose to evaluate the quality of minoxidil formulations on the market The permeation studies were carried out in vitro for 6 hours using Franz diffusion cells with porcine skin Minoxidil was extracted from skin layers stratum coreneum epidermis and hair folicle and receptor solution was collected for analysis The drug was quantified by High Performance Liquid Chromatography HPLC using a previously validated sensitive method Aloxidil provided a greater minoxidil quantification in the receptor solution and was the formulation that resulted least retention in the stratum corneum 1813 373 µg cm2 The manipulated formulation provided wide distribution of the drug into skin layers in general and receptor solution Rogaine and Kirkland were the only ones that presented a similar permeation profile The formulations were also analyzed for the drug level in their composition for the three industrialized formulations the value 50 mgmL reported in the package inserts was confirmed The manipulated formulation had a higher concentration 6608 070 mg mL Permeation tests performed showed different permeation profiles however the direction of the drug to the hair follicle site of Minoxidil action in alopecia was similar among the four formulations tested Taking into account the absence of efficient mechanisms to evaluate the bioequivalence of topical drugs in Brazil and the ability of skin permeation studies to elucidate the permeation profile of drugs from different formulations this study expects to be a reference for the validation of in vitro skin permeation study for evaluation of bioavailability and bioequivalence of topical products Keywords Minoxidil Skin permeation Androgenic Alopecia Bioequivalence LISTA DE FIGURAS Figura 1 Camadas da epiderme camada córnea estrato córneo camada granulosa camada espinhosa e camada basal05 Figura 2Vias de permeação de fármacos pela pele via transcelular via intercelular e via apendicial 06 Figura 3 Fotografia ilustrativa do padrão típico da AAG masculina07 Figura 4 Ciclo de crescimento do pelo representando as fases de anagênese catagênese e telogênese 08 Figura 5 Estrutura química da molécula de A minoxidil base e B minoxidil sulfato 09 Figura 6 Formulações industrializadas à base de MXB A Aloxidil B Rogaine C Kirland e D formulação manipulada à base de MXS 13 Figura 7 Célula de difusão do tipo Franz modificada 16 Figura 8 Peles de suínos retiradas da células Franz após o estudo de permeação in vitro com as formulações comerciais de minoxidil Kirkland e Rogaine17 Figura 9 A Sobreposição dos cromatogramas obtidos por CLAE referentes à curva analítica para o MXB B Sobreposição dos cromatogramas obtidos por CLAE referentes à curva analítica para o MXS18 Figura 10 Representação gráfica das curvas analíticas obtidas por CLAE para o A MXB e para o B MXS19 Figura 11 Teor de minoxidil nas formulações Kirkland Rogaine Aloxidil e manipulada 21 Figura 12 Quantidade de minoxidil permeada em 6h de permeação passiva a partir das formulações Kirkland Rogaine Aloxidil e manipulada 23 Figura 13 Quantidade de minoxidil retida no A estrato córneo B folículos pilosos e C pele remanescente a partir das formulações Kirkland Rogaine Aloxidil e manipulada25 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 1 2 OBJETIVOS 3 3 REFERENCIAL TEÓRICO4 31 Pele e vias de permeação cutânea4 32 Alopecia 6 33 Tratamento para alopecia com Minoxidil9 34 Bioequivalência e Biodisponibilidade10 4 MATERIAL E MÉTODOS 12 41 Material 12 42 Formulações 12 43 Método analítico para o minoxidil base e minoxidil sulfato13 44 Análise do teor e pH das formulações15 45 Estudos in vitro de permeação cutânea de minoxidil em pele de suínos 1 451 Quantificação do minoxidil a partir do estrato córneo da epiderme e do folículo piloso16 46 Análise estatística dos dados17 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 18 51 Método analítico para o minoxidil base e o minoxidil sulfato18 52 Características físicoquímicas das formulações análise de teor e pH20 53 Determinação da permeação cutânea in vitro do minoxidil a partir das formulações22 6 CONCLUSÕES 30 7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 31 1 1 INTRODUÇÃO A queda de cabelos eou pelos do corpo é denominada alopecia Esta doença pode ser classificada de acordo com as causas de seu aparecimento em alopecia androgênica alopecia quimioterápica e alopecia areata GELFUSO et al 2011 A alopecia androgênica popularmente conhecida como calvície é uma doença hereditária e progressiva que promove uma perturbação no ciclo folicular e gera como consequência clínica a perda de cabelo Acomete em sua maioria homens de idade avançada WOSICKA H et al 2010 mas também afeta mulheres adultas O fármaco mais utilizado no tratamento tópico da alopecia androgênica é o minoxidil O exato mecanismo que estimula o crescimento do cabelo com aplicação de medicamentos contendo esse fármaco ainda não foi claramente elucidado mas estudos mostram que ele atua ativando canais de potássio ATPase nos folículos capilares SHORTER 2008 favorece a irrigação sanguínea local BUHL et al 1990 e consequentemente aumenta o tempo da fase de crescimento capilar Além disso outros estudos sugerem que o minoxidil estende a fase de crescimento do pelo ativando beta catenina nas células da papila dérmica do folículo piloso KWACK et al 2011 No entanto o tratamento tópico com a formulação de minoxidil não proporciona resultados imediatos e além disso podem ocorrer reações dermatológicas indesejadas Por se tratar de um medicamento para uso tópico o perfil de permeação ou seja a concentração de minoxidil que efetivamente atinge o bulbo capilar após aplicação da formulação está diretamente associado à eficiência e eficácia do tratamento A legislação brasileira atual no entanto concede registro de formulações para aplicação tópica apenas com a apresentação de ensaios farmacopeicos não requerendo nenhum estudo que comprove a permeação do fármaco a partir das formulações SOARES et al 2015 Além disso para registro de medicamentos genéricos de uso tópico somente é requerido que a 2 formulação tenha o mesmo fármaco na mesma concentração e que contenha excipientes que desempenhem a mesma função dos da formulação referência não sendo necessariamente os mesmos excipientes ANVISA 2011 Apesar disso já existe um consenso global de que estudos que comprovem tanto a dermatofarmacocinética de novos produtos de aplicação tópica permeação cutânea quanto a bioequivalência para registro de medicamentos são necessários para se garantir eficácia e segurança desses produtos Nesse sentido o presente estudo teve como objetivo avaliar a qualidade de diferentes medicamentos à base de minoxidil disponíveis no mercado em termos de permeação cutânea in vitro do fármaco Com isso esperase além de relatar qualidade e intercambialidade dos produtos propor o método in vitro de permeação cutânea para servir de referência na validação de estudos de determinação de dermatofarmacocinética e bioequivalência de produtos tópicos Assim o estudo comparou a permeação cutânea in vitro do minoxidil a partir de três formulações industrializadas e uma formulação manipulada 3 2 OBJETIVOS 21 Objetivo geral Este estudo teve como objetivo avaliar a qualidade de diferentes medicamentos à base de minoxidil disponíveis no mercado em termos de permeação cutânea in vitro do fármaco 22 Objetivos específicos Verificar o teor das formulações comerciais e manipulada Analisar a linearidade do método analítico em CLAE Estudar in vitro a permeação cutânea do minoxidil a partir das formulações comerciais e manipulada Comparar dos resultados de permeação entre as formulações 4 3 REFERENCIAL TEÓRICO 31 Pele e vias de permeação cutânea A pele é a estrutura que reveste o corpo humano e que está em continuidade com as mucosas dos orifícios naturais Sendo o órgão de maior superfície pode apresentar uma área total de até 25000 cm² em um ser humano adulto Ela é dividia em três camadas principais a epiderme a derme e a hipoderme HARRIS 2009 A hipoderme é a camada mais profunda ela é composta por um tecido adiposo onde estão presentes vasos sanguíneos e nervos e sua funcionalidade é promover isolamento térmico proteção mecânica e aporte nutricional A derme também chamada de cório é a camada intermediária que abriga as estruturas vasculares e nervosas glândulas sudoríparas glândulas sebáceas músculos eretores do pelo e folículos pilosos A derme é composta por tecido conjuntivo e desempenha a função de sustentar a epiderme estruturalmente e proporcionar aporte de nutrientes As células predominantes na derme são os fibroblastos além deles também estão presentes células nervosas responsáveis por transmitir sensações de pressão e tato RIVITT 2014 A epiderme Figura 1 é a camada mais externa da pele e é constituída por subcamadas denominadas estrato basal estrato espinhoso estrato granuloso e estrato córneo O estrato basal está situado na porção mais interna da epiderme local onde os queratinócitos passam por intensa divisão celular A medida em que essas células se movimentam para as demais camadas da epiderme elas sofrem diversos processo de diferenciação e queratinização ao chegarem no estrato córneo se apresentam anucleadas e achatadas sendo chamadas então de corneócitos HARRIS 2009 ALEXANDER et al 2012 5 Figura 1 Camadas da epiderme camada córnea estrato córneo camada granulosa camada espinhosa e camada basal adaptado de httpwwwtodamateriacombr Os corneócitos são células ricas em queratina que estabelecem ligações entre si por meio de estruturas conhecidas como desmossomas todo esse sistema está envolto por uma matriz lipídica intercelular constituída por ceramidas ácidos graxos e colesterol Além disso os corneócitos também são revestidos por uma fina camada formada a partir de substancias secretadas pelas glândulas sebáceas juntamente com o suor bactérias e células mortas da pele Todas essas características contribuem para que a camada córnea seja considera a principal barreira à penetração de substancias químicas microrganismos e à perda de água transepidérmica ELIAS 2007 PROW et al 2011 Apesar da limitação imposta pelo estrato córneo a permeação cutânea de fármacos pode acontecer através de três vias diferentes a via intercelular a via transcelular e a via apendicial Figura 2 Na via transcelular o fármaco passa diretamente através dos corneócitos e da matriz celular já na via intercelular ele se difunde somente pela matriz lipídica que circunda os corneócitos Na via apendicial a permeação do fármaco ocorre 6 através dos apêndices cutâneos ou seja dos folículos pilosos glândulas sebáceas e sudoríparas MOSER et al 2001 GRATIERI et al 2008 Figura 2 Vias de permeação de fármacos pela pele via transcelular via intercelular e via apendicial adaptado de httpwwwinventivaindbr Apesar dos apêndices compreendem apenas 01 do total da superfície da pele humana os folículos pilosos favorecem a penetração por apresentarem sua parte inferior não queratinizada AKHTAR 2014 Além disso estudos sobre a penetração folicular demostram que os folículos pilosos representam uma via de penetração altamente relevante e eficiente como reservatório para substâncias administradas por via tópica BLUME PEYTAVI et al2010 32 Alopecia A alopecia também conhecida como calvície é uma doença que resulta na visível redução do cabelo Ela existe em diferentes formas uma delas é a alopecia areata que afeta quase 01 da população mundial em geral e é caracterizada como uma doença crônica e inflamatória que resulta em uma perda de cabelo imprevisível e incontrolável Mas a forma mais comum de perda de cabelo em homens e mulheres é através da alopecia androgênica 7 AAG Figura 3 Apesar de não haver consequências à saúde física a alopecia traz alterações da aparência afetando negativamente a autoestima ELLIS e SINCLAIR 2008 MULINARIBRENNER e SOARES 2009 Nos homens a AAG afeta metade da população caucasiana de meiaidade e 95 dos homens caucasianos com mais de 80 anos Ela é caracterizada clinicamente por uma rarefação simétrica de cabelos em couro cabeludo frontal e coroa Também pode ocorrer em mulheres causando uma perda difusa do cabelo e deixandoos mais ralos porém a prevalência no sexo feminino é menor A AAG resulta na perda de cabelo por intervir no ciclo capilar diminuindo os ciclos foliculares ELLIS e SINCLAIR 2008 Figura 3 Fotografia ilustrativa do padrão típico da AAG masculina adaptado de httpshassonandwongcom O ciclo capilar Figura 4 faz com que o folículo seja constantemente renovado passando por três fases distintas a anágena ou de crescimento a catágena ou de regressão e a telógena ou de repouso A fase anágena caracterizase por intensa atividade mitótica da matriz do folículo piloso e no couro cabeludo essa fase dura cerca de 3 a 8 anos A fase catágena é um período de transição entre a fase de crescimento e a de repouso Na fase 8 telógena o pelo se separa da papila dérmica e é facilmente destacado A queda de um pelo telógeno normal delimita o fim de um ciclo e o início de outro com a substituição por um novo pelo na mesma localização Entretanto em áreas do couro cabeludo afetadas por AAG a cada ciclo que se inicia o folículo vai diminuindo seu diâmetro resultando em um afinamento das hastes levando a um processo de miniaturização MULINARIBRENNER e SOARES 2009 Figura 4 Ciclo de crescimento do pelo representando as fases de anagênese catagênese e telogênese SINCLAIR 2004 A AAG se relaciona principalmente a fatores genéticos somados a ação dos andrógenos Indivíduos geneticamente predispostos possuem alteração nos genes que codificam o receptor de andrógeno e a aromatase enzima que converte testosterona em estradiol Essa alteração genética nos receptores de andrógenos possibilita que os folículos do couro cabeludo tenham maior capacidade de captar os andrógenos circulantes aumentando sua ação nesses folículos Já a alteração no gene da aromatase resulta em um aumento de testosterona circulante BERNAD et al 2014 A testosterona ao ser captada pelos receptores no couro cabeludo é convertida em diidrotestosterona DHT pela enzima 5αredutase A ação biológica da DHT nos receptores andrógenos é mais potente que a da testosterona A DHT age inibindo a 9 adenilato ciclase fazendo com que diminua o AMP cíclico dos folículos pilosos e consequentemente não haja energia suficiente para o desenvolvimento completo dos ciclos foliculares resultando em um processo de miniaturização Esses processos celulares encurtam a fase anágena do clico capilar e fazem com que os cabelos passem para a fase telógena mais precocemente BIENOVÁ et al 2005 BERNAD et al 2014 33 Tratamento para alopecia com Minoxidil Os tratamentos farmacológicos aprovados para AAG pelo FDA Food and Drug Administration e pela Anvisa Agência Nacional de Vigilância Sanitária incluem finasterida comprimido 1 mg e minoxidil solução capilar 2 e 5 O minoxidil Figura 5 é um vasodilatador periférico utilizado originalmente para tratamento de hipertensão mas apresentou como reações adversas hipertricose auricular crescimento de pelos nas orelhas e aparecimento de pelos em pessoas calvas MESSENGER RUNDEGREN 2004 Portanto foram desenvolvidas formulações tópicas de minoxidil para tratar AAG GELFUSO 2009 ROUSSO e KIM 2014 Figura 5 Estrutura química da molécula de A minoxidil base e B minoxidil sulfato 10 O exato mecanismo de ação ainda não foi completamente elucidado mas o minoxidil parece retardar a progressão da miniaturização folicular e aumentar a duração da fase anágena A princípio acreditavase que o minoxidil estimulava o crescimento capilar por promover vasodilatação e criar uma irrigação no couro cabeludo No entanto estudos sugerem que o minoxidil estende a fase anágena por ativar beta catenina nas células da papila dérmica do folículo piloso KWACK et al 2011 O minoxidil é pouco solúvel em água e por essa razão muitas das formulações comercializadas possuem álcool etílico e propilenoglicol em sua composição Devido à intolerância cutânea à formulação efeitos indesejáveis como irritação coceira vermelhidão ressecamento do couro cabeludo e dermatite alérgica de contato podem surgir Para que se evidencie um crescimento capilar adequado são necessárias duas aplicações diárias por um período de dois a quatro meses Caso a aplicação de minoxidil seja suspensa o nascimento de novos pelos é interrompido e em situação de pausa superior a 3 meses é possível regressão ao aspecto inicial do tratamento ALOXIDIL 2013 34 Bioequivalência e Biodisponibilidade Por definição bioequivalência consiste na demonstração de equivalência farmacêutica entre produtos apresentados sob a mesma forma farmacêutica contendo idêntica composição qualitativa e quantitativa de princípio ativo e que tenham comparável biodisponibilidade quando estudados sob um mesmo desenho experimental BRASIL 1999 A biodisponibilidade a partir do uso medicamentos tópicos chamada de biodisponibilidade tópica é definido como a velocidade e a extensão de absorção a partir de uma formulação que permita que o fármaco se apresente disponível no local da ação STORPIRTIS et al 2011 11 A determinação de bioequivalência e biodisponibilidade pode ser realizada através métodos in vitro que incluem os ensaios de liberação e permeação cutânea E também por métodos in vivo como ensaios clínicos os farmacodinâmicos estudos de dermatofarmacocinética DPK e a microdiálise dérmica LEAL et al 2017 Contudo no Brasil a legislação ainda não regulamentou a avaliação da bioequivalência de medicamentos tópicos cópia em relação ao medicamento referência os estudos de bioequivalência não são obrigatórios para o registro desses medicamentos ANVISA2011 Dessa forma um estudo comparativo acerca da permeação de diferentes formulações de minoxidil é de grande valia para comparar a biodisponibilidade do fármaco no folículo piloso e constatar se o fator de permeação está contribuindo ou não para a eficácia do tratamento 12 4 MATARIAL E MÉTODOS 41 Material O minoxidil base MXB 99 e o minoxidil sulfato MXS 99 utilizado na preparação das curvas de calibração foram cedidos pela Galena Química Ltda Campinas Brasil A água utilizada em todas análises foi água tipo MilliQ Millipore França O tampão foi preparado utilizando fosfato de sódio nas formas monobásica e dibásica Vetec Rio de Janeiro Brasil e cloreto de sódio Serva Rio de Janeiro Brasil Os solventes metanol e acetonitrila de grau HPLC foram obtidos da Tedia Brazil Ltda Rio de Janeiro Brasil O tape stripping diferencial foi realizado com cola de cianoacrilato obtida da Loctite São Paulo Brasil e fitas adesivas Scotch Book Tape 3M Alemanha A pele utilizada nos experimentos foi retirada de orelhas de suínos logo após o abate Este material foi gentilmente cedido pela Bonasa Alimentos São Sebastião DF Brasil Não foi necessária nenhuma autorização de conselhos de ética para uso desse material biológico por se tratar de produto liberado para consumo Para a obtenção da pele cada orelha foi lavada com água tipo MilliQ e fixada sobre uma placa de isopor recoberta por papel alumínio A pele foi então separada da cartilagem com o auxílio de um bisturi A camada adiposa adjacente à derme foi removida com o auxílio de uma tesoura A pele foi armazenada congelada a 4C por um período máximo de dois meses antes do seu uso 42 Formulações O perfil de permeação cutânea de minoxidil foi determinado comparandose três formulações industrializadas e uma manipulada Figura 6 As três formulações industrializadas escolhidas foram de MXB com concentração de 50 mgmL o Aloxidil minoxidil 5 Theraskin Farmacêutica o Rogaine minoxidil 5 Johnson Johnson Industrial o Kirkland minoxidil 5 Kirkland Signature 13 Figura 6 Formulações industrializadas à base de MXB A Aloxidil B Rogaine C Kirland e D formulação manipulada à base de MXS Aloxidil é o medicamento de referência no Brasil Rogaine e Kirland apesar de serem formulações muito utilizadas no Brasil ainda não possuem registro e são adquiridas em outros países Rogaine e Kirland foram selecionadas como amostras nesse trabalho pois no momento em que as formulações foram adquiridas não havia outras formulações industrializadas de minoxidil disponíveis no mercado brasileiro além de Aloxidil A formulação manipulada foi obtida em uma farmácia de manipulação localizada no Distrito Federal Diferentemente das formulações industrializadas a formulação manipulada foi preparada com MXS que é o derivado que se usa comumente magistralmente com a mesma concentração de 50 mgmL 43 Método analítico para o minoxidil base e minoxidil sulfato Os princípios ativos MXB e MXS foram dosados com o auxílio de um Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência CLAE modelo Shimadzu LC20AD composto 14 por duas bombas modelo LC20AT um injetor automático modelo SIL20AC e forno modelo CTO20A acoplados a um detector espectrofotométrico modelo SPDM20A e a um computador equipado com o programa de análise cromatográfica Shimadzu LC Foi utilizada uma coluna de fase reversa C18 dimensões 150 mm x 46 mm tamanho de partículas 5 µm e a fase móvel foi composta por uma mistura de Água deionizada e Metanol 7030 vv A vazão utilizada foi de 1 mLmin o volume de injeção das amostras foi de 20 µL o forno foi utilizado a 40 ºC e a detecção foi feita em 285 nm adaptado de MATOS 2014 Apesar do método analítico descrito acima já ter sido estabelecido curvas analíticas foram preparas para avaliar sua linearidade e comparar a sensibilidade dos métodos para os dois derivados analisados Inicialmente preparouse três soluções de cada princípio ativo MXB e MXS com concentração de 50 µgmL diluindose 25 mg do fármaco em 50 mL de metanol A partir de cada solução estoque foram feitas as diluições com concentração de 025 05 10 25 50 e 100 µgmL As curvas analíticas de cada fármaco foram construídas e após aplicação do método de regressão linear obtevese uma reta y ax b onde a corresponde ao coeficiente angular e b coeficiente linear O coeficiente de correlação linear r aceitável foi de no mínimo r 099 ANVISA 2003 Os limites de quantificação e detecção teóricos foram calculados de acordo com as fórmulas abaixo Equação 1 Equação 2 Onde s é o desvio padrão dos valores de interceptação do eixo das curvas e S é o coeficiente angular da curva Limite de Quantificação 10 𝑠 𝑆 Limite de Detecção 3 𝑠 𝑆 15 44 Análise do teor e pH das formulações O teor das formulações foi realizado com o objetivo de confirmar a concentração informada por seus respectivos fabricantes de 50 mgmL Como é o único parâmetro requerido para registro de produtos cópias esses dados foram usados para dar suporte à discussão de comparação dos perfis de permeação do fármaco a partir das diferentes formulações Assim foram realizadas diluições de 110000 vv de todas as formulações em metanol e o minoxidil presente nas amostras foi quantificado em CLAE O experimento foi realizado em quintuplicata para cada formulação O pH de cada formulação foi verificado em triplicata utilizando um medidor de pH de bancada Digimed modelo DM22 São Paulo Brasil 45 Estudos in vitro de permeação cutânea de minoxidil em pele de suínos Os estudos de permeação foram conduzidos in vitro em células de difusão vertical do tipo Franz Figura 7 Esta célula possui um compartimento doador no qual foi inserido 1 mL de cada formulação e um compartimento receptor que foi preenchido com uma solução tampão fosfato 001 M pH 74 A pele suína ficou disposta na célula entre os dois compartimentos com o estrato córneo voltado para cima Após aplicação das formulações sobre a pele elas permaneceram em uma placa de agitação magnética e em banho termostático a 35 2C por um período de 6 horas Amostras de 1 mL foram coletadas do compartimento receptor nos tempos de 2 h 4 h e 6 h sendo que igual volume de solução tampão fosfato 001 M pH 74 foi imediatamente reposto após cada coleta As alíquotas foram filtradas e armazenadas em frascos para análise quantitativa do fármaco permeado por CLAE Todos os experimentos foram realizados em quintuplicata 16 Figura 7 Célula de difusão do tipo Franz modificada MATOS 2014 451 Quantificação do minoxidil a partir do estrato córneo da epiderme e do folículo piloso Ao final do estudo de permeação in vitro das formulações comerciais e manipulada o fármaco foi recuperado das diferentes camadas da pele estrato córneo epiderme remanescente e folículo piloso utilizando a técnica de tape stripping diferencial previamente validado MATOS et al 2014 Os fragmentos de pele removidos de cada célula de Franz Figura 8 foram lavados superficialmente com água MilliQ para retirar o excesso de formulação e secados suavemente com lenço de papel absorvente Eles foram esticados e presos sobre um suporte de isopor e um template de fita adesiva foi colocado sobre o fragmento de pele de modo a deixar exposto somente a área que esteve em contato com a formulação O estrato córneo foi removido utilizando a técnica tape stripping com o auxílio de 15 pedaços de fita adesiva por amostra de pele Posteriormente à retirada do estrato córneo 1 gota de cola cianoacrilato foi aplicada sobre a pele para remoção dos folículos pilosos com o auxílio de mais um pedaço de fita Por fim a epiderme e derme remanescentes foram picotadas Os 15 pedaços de fitas provenientes da remoção do estrato córneo o pedaço de fita com os folículos pilosos e a epiderme picotada foram transferidos para frascos contento 5 mL de metanol para extração do fármaco Os frascos foram deixados sob agitação magnética por 17 um período de 24 h O metanol foi então filtrado em membranas de 022 µm e analisado por CLAE para quantificação do minoxidil Figura 8 Peles de suínos retiradas da células do tipo Franz após o estudo de permeação in vitro com as formulações comerciais de minoxidil Kirkland e Rogaine Os dois ensaios foram realizados em quintuplicata 46 Análise estatística dos dados Os conjuntos de dados foram verificados por análise de variância oneway ANOVA seguido do teste de Tukey com comparação múltipla dos dados O nível de significância estatística foi fixado como sendo p 005 18 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 51 Método analítico para o minoxidil base e o minoxidil sulfato As formulações industrializadas testadas neste trabalho continham o MXB e a formulação manipulada o MXS Dessa forma seguindose o método cromatográfico já estabelecido para o MXS com adaptações MATOS et al 2015 determinouse para cada um dos fármacos as respectivas curvas analíticas além de se analisar os respectivos cromatogramas para se verificar alterações no tempo de retenção e possíveis alterações na sensibilidade do método na análise de cada uma das formas do fármaco minoxidil Na Figura 9 estão apresentados os cromatogramas dos fármacos MXB A e MXS B T e m p o m in In te n sid a d e A U 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 5 0 0 0 0 5 0 0 0 1 0 0 0 0 1 5 0 0 0 2 0 0 0 0 T e m p o m in In te n sid a d e A U 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 5 0 0 0 0 5 0 0 0 1 0 0 0 0 1 5 0 0 0 Figura 9 A Sobreposição dos cromatogramas obtidos por CLAE seguindo o método descrito anteriormente referentes à curva analítica para o MXB B Sobreposição dos cromatogramas obtidos por CLAE seguindo o método descrito anteriormente referentes à curva analítica para o MXS A B 19 Notase que apesar de diferenças nas suas formas estruturais já que o MXS possui um grupo sulfato a mais ligado à estrutura do MXB o tempo de retenção dos compostos foram praticamente os mesmos durante todas as análises cromatográficas Desta forma não se é possível distinguir uma molécula da outra por meio do método cromatográfico De qualquer forma nos experimentos apresentados a seguir os fármacos foram analisados sempre de maneira separada Na Figura 10 estão apresentadas as curvas analíticas construídas para cada fármaco Figura 10 Representação gráfica das curvas analíticas obtidas por CLAE para o A MXB Equação da reta y 56057x 25273 e coeficiente de correlação linear r2 0998 e para o B MXS equação da reta y 38505x 48371 e coeficiente de correlação linear r2 0997 y 56057x 25273 R² 09976 0 100000 200000 300000 400000 500000 600000 0 2 4 6 8 10 12 Área do pico mAU Concentração MXB µgmL y 38505x 48371 R² 09965 0 100000 200000 300000 400000 500000 600000 0 2 4 6 8 10 12 Área do pico mAU Concentração MXS µgmL A B 20 Os limites de quantificação e detecção teóricos para os fármacos foram adequados para a dosagem do MXB e MXS nos experimentos de permeação in vitro O limite de detecção para o MXB foi 0185 µgmL e para o MXS foi de 0177 µgmL Enquanto o limite de quantificação calculado para o MXB foi 0559 µgmL e para o MXS foi 0535 µgmL O método também se mostrou linear para dosagem de ambos os fármacos uma vez que os coeficientes de correlação linear obtidos foram 0998 para a curva de MXB e 0997 para a curva de MXS todos dentro do limite estabelecido pela Anvisa ANVISA 2003 Foi possível portanto analisar com segurança e confiabilidade os fármacos na faixa de concentração entre 025 µgmL e 100 µgmL 52 Características físicoquímicas das formulações análise de teor e pH A formulação de minoxidil adquirida em farmácia de manipulação é composta por 5 de MXS 10 de propilenoglicol e QSP 100 de álcool cereais A solubilidade do MXS em meio aquoso é de 5614 gL MATOS 2014 As formulações industrializadas Aloxidil Rogaine Kirkland são compostas por 5 de MXB e QSP 100 de álcool etílico propilenoglicol e água purificada A solubilidade do MXB em meio aquoso é de 22 gL a 25C sendo considerado pouco solúvel THE MERCK INDEX 1987 GORECKI 1988 As formulações industrializadas de MXB Aloxidil Rogaine e Kirkland apresentaram valores de pH iguais a 795 045 784 013 e 800 042 respectivamente Enquanto isso a formulação manipulada de MXS apresentou pH igual a 398 006 estatisticamente diferente ao pH das formulações comerciais p 005 Os dados de análise de teor de fármaco nas diferentes formulações estão apresentados na Figura 11 abaixo 21 T e o r d e m in o x id il m g m L K irk la nd R o g a ine A lo x idil M a nipula da 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 Figura 11 Teor de minoxidil nas formulações Kirkland Rogaine Aloxidil e manipulada De acordo com a análise de teor as formulações industrializadas Kirkland Aloxidil e Rogaine possuem a concentração de 50 mgmL assim como informado pelos seus respectivos fabricantes A formulação manipulada apresentou concentração igual a 6608 070 mgmL sendo significativamente superior às demais p 005 numa razão de 32 O controle de qualidade existente nas indústrias farmacêuticas pode ser o diferencial que garantiu a concentração das formulações industrializadas por outro lado as farmácias de manipulação não contam com um controle tão rígido como nas indústrias Considerando os dados de teor de fármaco e pH podese concluir que as formulações industrializadas de MXB têm equivalência farmacêutica entre si Por conta da diferença estrutural existente na molécula de MXS a formulação manipulada não poderia ser considerada equivalente às formulações industrializadas a base de MXB Porém ainda que a diferença estrutural entre as moléculas fosse desconsiderada de acordo com os resultados de teor e pH a formulação manipulada ainda assim não seria farmaceuticamente equivalente à formulação referência Aloxidil 22 53 Determinação da permeação cutânea in vitro do minoxidil a partir das formulações Os estudos de permeação permitem analisar a difusão do fármaco através das camadas da pele e constatar se ocorre penetração do fármaco retenção no estrato córneo ou ainda direcionamento para os anexos cutâneos OYAFUSO 2012 O transporte do fármaco através da pele é um processo de difusão passiva que pode ser entendido como a passagem de moléculas através de uma membrana que não participa ativamente do processo Nesse caso a membrana é a pele e o fármaco é impulsionado a atravessar suas camadas devido ao gradiente de concentração existente ou seja as diferenças de concentração do fármaco no meio doador e no meio receptor da célula de Franz NETZ et al 2002 Na terapia dermatológica tópica a formulação de minoxidil é aplicada diretamente no local a ser tratado e para se obter a ação esperada é fundamental que ela seja capaz de se difundir passivamente nas camadas da pele e se acumular no folículo piloso Tendo isso em vista as permeações in vitro foram realizadas com o objetivo de comparar o perfil de permeação cutânea do minoxidil em formulações comercializadas como indicativo da efetividade dos produtos disponíveis no mercado Os estudos de permeação cutânea foram realizados por um período total de seis horas e a cada 2 horas 1 mL da solução receptora foi coletado para análise e imediatamente reposto 1 mL da mesma solução tampão fosfato 001 M pH 74 Após as seis horas do experimento o fármaco foi extraído do estrato córneo dos folículos pilosos e da epiderme O processo de extração do fármaco das camadas da pele suína e o método analítico utilizado com adaptação para quantificação do minoxidil por CLAE foram validados previamente em estudo do grupo encontrandose valores de recuperação acima de 8445 para todas as camadas da pele MATOS 2014 23 Nas primeiras duas horas de experimento não foi possível detectar o fármaco na solução receptora na quarta hora o minoxidil permeado pôde ser detectado pelo método analítico porém não houve quantificação A coleta realizada após as seis horas de experimento permitiu que houvesse quantificação do fármaco na solução receptora e os valores estão representados na Figura 12 M in o x id il r e c u p e r a d o d o p e r m e a d o a p ó s 6 h 4g K irk la nd R o g a ine A lo x idil M a nipula da 0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 1 6 Figura 12 Quantidade de minoxidil permeada em 6h de permeação passiva a partir das formulações Kirkland Rogaine Aloxidil e manipulada As barras representam a média desvio padrão da média O MXB quantificado na solução receptora foi significativamente maior em Aloxidil se comparado com Kirkland e Rogaine p005 Apesar de possuírem os mesmos componentes as proporções de propilenoglicol e álcool etílico não são informadas na literatura e uma possível diferença na proporção desses excipientes entre as três formulações pode justificar a maior permeação do fármaco a partir do Aloxidil A formulação manipulada permitiu a permeação de 749 379 µg de MXS apresentando diferença significativa apenas em relação ao Rogaine p005 O MXS é a forma sulfatada do MXB por ser mais hidrossolúvel apresenta maior facilidade na 24 manipulação farmacotécnica O responsável pelos efeitos farmacológicos na pele é o sulfoconjugado ativo do minoxidil portanto mesmo quando a formulação é manipulada a partir do MXB ao chegar no folículo piloso o fármaco é metabolizado em MXS BUHL et al 1990 KUDLACEK et al 1995 Não foi encontrado na literatura nenhuma evidência de que a presença ou a ausência de sulfatação na molécula de minoxidil possa interferir na permeação cutânea do fármaco Porém a maior concentração da formulação manipulada que foi evidenciada na análise de teor pode ter influenciado em sua alta permeação A capacidade das formulações em permitir que o minoxidil seja absorvido em maiores quantidades pelas camadas mais profundas da pele pode ser considerada uma desvantagem tendo em vista que a presença do minoxidil em altas concentrações sistêmicas pode gerar efeitos indesejados associados ao seu potencial antihipertensivo MATOS 2014 Isso no entanto não pode ser concluído com este tipo de estudo in vitro uma vez que aqui a pele não está em condição total de viabilidade ou seja a quantidade permeada do fármaco pode significar apenas a quantidade que transpassa o estrato córneo mas não o que seria absorvido pela circulação sanguínea Na Figura 13A estão apresentados os dados de retenção de MXB e MXS no estrato córneo a partir das diferentes formulações analisadas 25 M in o x id il r e c u p e r a d o d o E str a to C ó r n e o 4g c m 2 K irk la nd R o g a ine A lo x idil M a nipula da 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 M X r e c u p e r a d o d a e p id e r m e 4g c m 2 K irk la nd R o g a ine A lo x idil M a nipula da 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 Figura 13 Quantidade de minoxidil retida no A estrato córneo B folículos pilosos e C pele remanescente a partir das formulações Kirkland Rogaine Aloxidil e manipulada As barras representam a média desvio padrão da média A B C 26 O Aloxidil além de ter proporcionado uma maior quantificação do MXB na solução receptora também foi a formulação que menos apresentou retenção do MXB no estrato córneo 1813 373 µgcm2 possuindo diferenças significativas para todas as demais formulação p005 Com relação a formulação manipulada o minoxidil quantificado no estrato córneo apresentou a maior quantidade de fármaco nesta camada 4116 722 µgcm2 porém a retenção ocorreu em quantidades significativamente diferentes apenas em relação a Kirkland e Aloxidil p005 Com relação à retenção de minoxidil para folículos pilosos Figura 13B as únicas que apresentaram diferenças significativas entre si na quantidade de fármaco recuperada dos folículos foram Aloxidil e Kirkland p005 sendo que a quantidade de MXB recuperada dos folículos foi de 1070 285 µgcm2 para o Kirkland e de 1664 310 µgcm2 para o Aloxidil Tento em vista que o local de ação do minoxidil na alopecia é o folículo piloso e que essas estruturas parecem ser a principal via de penetração de micropartículas e nanopartículas alguns estudos sugerem o desenvolvimento dessas partículas como sistemas de liberação capazes de se acumular nos folículos pilosos atuando como um reservatório de fármaco MEIDAN et al 2005 GELFUSO et al 2011 GELFUSO et al 2013 Matos et al 2015 prepararam nanopartículas de quitosana contendo o MXS com o objetivo de direcionar e sustentar a liberação deste fármaco na base dos folículos pilosos Apesar da formulação nanoestruturada desenvolvida por Matos et al 2015 ter apresentado concentração de MXS no folículo cerca de 2 vezes menor do que a das formulações comerciais testadas nesse trabalho a nanoformulação continha uma concentração de MXS 28500 vezes menor do que a concentração presente nas formulações comerciais Esses resultados demonstram a efetividade de nanoformulações no tratamento de patologias relacionadas ao folículo piloso como alopecia e acne GELFUSO et al 2011 27 O perfil de retenção do minoxidil na pele remanescente a partir de todas as formulações após um período 6 horas pode ser verificado na Figura 13C A quantidade de fármaco na epiderme para a formulação manipulada foi de 4016 1543 µgcm2 sendo essa a formulação que proporcionou maior retenção do minoxidil na pele remanescente Esta diferença foi diferente estatisticamente de todas as demais p005 Como descrito anteriormente a formulação manipulada é composta por 5 de MXS 10 de propilenoglicol e QSP 100 de álcool cereais O álcool cereais é um álcool etílico obtido a partir de cerais milho arroz trigo e etc sendo muito usado na manipulação farmacêutica por possuir alto grau de pureza EMFAL 2015 Portanto a formulação manipulada é composta por 85 de álcool etílico Grice et al 2010 já avaliaram a permeação cutânea de formulações de minoxidil obtidas a partir de diferentes proporções de etanol propilenoglicol e água e evidenciaram que as formulações com etanol resultavam em uma maior quantidade de minoxidil recuperado das camadas da pele se comparado com a formulação obtida apenas com água e propilenoglicol O etanol promove a permeação cutânea por atuar como solvente aumentando a solubilidade do fármaco e além disso ao permear o estrato córneo ele altera as propriedades de solubilidade do tecido desestruturando o arranjo da camada lipídica e consequentemente melhorando a partição do fármaco WILLIAMS e BARRY 2004 O etanol no entanto é agressivo para a pele principalmente se pensarmos em seu uso contínuo De acordo com o exposto o fato da formulação manipulada ter sido absorvida em grandes quantidades no estrato córneo na epiderme e no permeado pode ser justificado por seu alto teor de etanol Contudo isso não fez com que essa formulação promovesse direcionamento do fármaco para os folículos pilosos em quantidade significativamente maior que as demais formulações além de se correr o risco de causar uma irritação cutânea com o uso contínuo do produto 28 A Anvisa ainda não dispõe de mecanismos eficientes para avaliar a bioequivalência de medicamentos tópicos cópia em relação ao medicamento referência No Brasil medicamentos tópicos similares ou genéricos são bioisentos pela RDC 372011 ou seja não há obrigatoriedade de estudos de bioequivalência que comprovem sua segurança e eficácia para fins de registro Os medicamentos tópicos cópias devem apenas conter o mesmo fármaco na mesma concentração excipientes de mesma função em relação ao medicamento de referência e apresentar estudo de equivalência farmacêutica o qual avalia apenas os parâmetros físicoquímicos e microbiológicos estabelecidos em farmacopeias ANVISA 2011 Soares et al 2015 realizaram um levantamento de todos os medicamentos tópicos registrados no Brasil até o ano de 2013 e dos respectivos estudos necessários para o seu registro nacional comparando com os estudos exigidos para o registo em outros países O estudo evidenciou uma maior flexibilização das exigências regulatórias no âmbito nacional resultando na existência de um maior número de cópias de medicamentos tópicos no mercado brasileiro A principal consequência é a ausência da garantia de bioequivalência entre as diferentes formulações Testes de permeação cutânea são considerados um dos principais métodos in vitro para determinação da biodisponibilidadebioequivalência de medicamentos tópicos LEAL et al 2017 A partir dos testes de permeação cutânea realizados no presente estudo com formulações tópicas de minoxidil disponíveis do mercado Aloxidil Rogaine Kirkland e manipulada foi possível quantificar e diferenciar a quantidade de fármaco que atingiu as diferentes camadas da pele bem como o folículo piloso local de ação do minoxidil na alopecia Desse modo esse estudo espera poder contribuir como uma possível referência para validação de estudos in vitro de permeação cutânea para avaliação de biodisponibilidade e bioequivalência de produtos tópicos 29 Tabela 1 Resumo da evidência de equivalência farmacêutica entre a formulação referência Aloxidil e as formulações Kirkland Rogaine e Manipulada Rogaine Kirkland Manipulada Teor pH Retenção no Estrato Córneo Retenção no Folículo Piloso Retenção na Epiderme houve diferença não houve diferença A Tabela 1 faz comparações entre todas as formulações de acordo com os critérios avaliados nesse trabalho O medicamento de referência para liberação tópica de minoxidil no Brasil é o Aloxidil Portanto de acordo com os dados de teor e pH obtidos as formulações Kirkland e Rogaine são farmaceuticamente equivalentes ao medicamento referência ao passo que a formulação manipulada não apresenta equivalência farmacêutica com o medicamento referência Com relação à biodisponibilidade a formulação Kirkland apresentou baixa biodisponibilidade tópica no folículo piloso ao ser comparada com o medicamento de referência Aloxidil enquanto as demais formulações se apresentaram biodisponíveis no folículo piloso não possuindo diferenças significativas com Aloxidil 30 6 CONCLUSÕES Os estudos realizados com o medicamento referência Aloxidil confirmaram sua concentração de 50 mgmL O seu comportamento nos estudos de permeação in vitro mostrou um bom direcionamento do MXB para o folículo piloso e obteve menor retenção no estrato córneo com relação as demais formulações Rogaine e Kirkland apresentaram um perfil de permeação semelhante e não apresentaram diferenças significativas entre si em nenhuma analise Em comparação com o medicamento referência eles possuem o mesmo teor e valores de pH próximos e sendo assim podem ser considerados equivalentes farmacêuticos Rogaine apresentou um direcionamento para os folículos pilosos semelhante ao do Aloxidil Já o direcionamento de fármaco para o folículo piloso a partir Kirkland foi significativamente inferior do que em Aloxidil o que implica em uma biodisponibilidade tópica diferente entre eles A formulação manipulada apresentou grandes diferenças O teor foi superior às demais numa razão de 32 e o valor do pH foi aproximadamente 2 vezes menor que os valores de pH das formulações industrializadas não sendo portanto equivalente ao medicamento referência Nos estudos de permeação in vitro a formulação manipulada apresentou uma ampla distribuição do MXS pelas camadas da pele e não apresentou diferenças significativas no direcionamento do fármaco para o folículo piloso Os estudos in vitro de permeação cutânea podem contribuir para a avaliação da biodisponibilidade tópica e bioequivalência de produtos tópicos Esses estudos sendo devidamente delineados para cada medicamento proporcionariam maior confiabilidade na equivalência de medicamentos tópicos genéricos e similares com os seus respectivos medicamentos de referência 31 7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANVISA Guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos Agência Nacional de Vigilância Sanitária ANVISA RE N 899 2003 ANVISA Guia para isenção e substituição de estudos de biodisponibilidade relativabioequivalência Agência Nacional de Vigilância Sanitária ANVISA RDC Nº 37 2011 AKHTAR N Vesicles a recently developed novel carrier for enhanced topical drug delivery Current drug delivery v 11 n 1 p 8797 2014 ALEXANDER A DWIVEDIB S AJAZUDDINA GIRIB T K SARAF S TRIPATHIP D K Approaches for breaking the barriers of drug permeation through transdermal drug delivery J Control Release v 164 p 2640 2012 ALOXIDIL minoxidil São Paulo Theraskin Farmacêutica Farm Resp Dra Rosa Maria Scavarelli CRFSP nº 6015 Bula de remédio 2013 Disponível em httpwww4anvisagovbrBularioEletronico BERNAD ALONSO I LERA IMBULUZQUETA J M IRARRAZAVAL ARMENDÁRIZ I ESPAÑA ALONSO A Alopecias Medicine Programa Formación Médica Continuada Acreditado v 11 n 48 p 284051 2014 BIENOVÁ M KUCEROVÁ R FIURASKOVÁ M HAJDÚCH M KOLÁR Z Androgenic alopecia and current methods of treatment Acta Dermatovenerologica Alpina v 14 n 1 p 58 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