Determinação de Benzoilecgonina em Urina por Imunoensaio e Cromatografia em Camada Delgada

CENTRO UNIVERSITÁRIO UNA Área Ciências Biológicas e da Saúde 1 Determinação de Benzoilecgonina em Urina por Imunoensaio e Cromatografia em Camada Delgada MATERIAIS 01 tubo falcon de 50 mL com tampa 01 Pipeta automática de 1000 microlitros 01 funil de separação com suporte e garra 01 funil de filtração de vidro com garra 03 béqueres de 50 mL 03 papéis de filtro 01 tubo falcon contendo 20 mL de urina 01 tira do teste de imunoensaio para cocaína da marca Abon 01 Cuba contendo o eluente de CCD descrito abaixo 01 cromatofolha com marcador de fluorescência para CCD 01 agitador de tubos Eter etílico PA Hidróxido de amônio PA Cloreto de sódio Espátula Diclorometano Balança Padrão de benzoilecgonina Fitas para medir pH 01 bacia solução aquosa de hipoclorito de sódio 5 para desinfecção das vidrarias contaminadas Cuba de UV Lápis régua e tesoura OBJETIVO Identificar a presença do metabólito da cocaína benzoilecgonina na urina de usuários para verificar o consumo da cocaína nas últimas 72 horas METODOLOGIA 1 Imunoensaio Imunocromatografia 1 Com as setas impressas na tira apontando para a amostra inserir a tira de teste verticalmente na amostra durante 15 segundos Não ultrapassar a linha indicada no teste ao inserila na amostra 2 Retirar a tira teste da amostra e colocála em uma superfície horizontal limpa e iniciar a contagem no cronômetro 3 Anotar o resultado após 5 minutos sendo considerado positivo o aparecimento de uma linha e negativo a presença de duas linhas na fita de imunocromatografia CENTRO UNIVERSITÁRIO UNA Área Ciências Biológicas e da Saúde 2 Figura 1 Imagem mostrando os resultados possíveis ao empregar as fitas de imunoensaio 2 Cromatografia em Camada Delgada 1 No tubo falcon contendo 15 mL de urina basificar a amostra adicionando 12 gotas de hidróxido de amônio PA na capela 2 Anotar o pH da amostra 3 Adicionar 1 grama de cloreto de sódio na amostra efeito salting out 4 Adicionar na capela 20 mL do cloreto de metileno sobre a amostra tampar o frasco e agitar por inversão vagarosamente para evitar emulsão 5 Verter a amostra para um funil de separação dentro da capela tampar e aguardar a separação das fases 6 Recolher a fase orgânica em um béquer 7 Aplicar o padrão de benzoilecgonina 2 vezes a amostra 5 vezes e o branco 1 vez na cromatofolha de sílica gel 8 Eluir a cromatofolha utilizando como eluente clorofórmioacetonahidróxido de amônio 9010050 9 Revelar a cromatofolha na cuba de UV ou com o revelador Dragendorff 10 Calcular o Rf do padrão e da amostra para a identificação da benzoilecgonina na amostra REFERÊNCIAS DORTA Daniel Junqueira YONAMINE Maurício DA COSTA José Luiz DE MARTINIS Bruno Spinosa Toxicologia Forense São Paulo Blucher 2018 capítulo 7