Investigação de Paternidade e Técnicas de Teste de DNA

INVESTIGAÇÃO DE PATERNIDADE Profa MSc Alana Nunes Mendonça Zootecnista Mestre em Nutrição Animal 2023 Professor Sir Alec John Jeffreys Inventor da Técnica de Identificação por DNA 1985 Resolver problemas de paternidade imigração e investigações criminais Análises de parentescos evolutivos de populações de mesma espécie ou espécies diferentes Diagnóstico genético de doenças hereditárias Identificação de criminosos na genética forense Genética de populações e evolução Conservação e manejo de recursos biológicos Identificação de espécies silvestres Cativeiro ou vida livre TESTE DE DNA Teste utilizado para determinar o parentesco de dois indivíduos ou a similaridade entre duas amostras Alto grau de confiabilidade 999 Diferença entre bases de DNA de 2 indivíduos 01 Diferença ainda menor entre parentes TESTE DE IDENTIFICAÇÃO DE PATERNIDADE Etapas Coletar amostras Pai mãe progênie Extrair e purificar o DNA Submeter DNA à Enzima de Restrição Submeter DNA à Eletroforese Realizar leitura das bandas de DNA no gel Comparar as bandas dos indivíduos TESTE DE PATERNIDADE DNA presente no núcleo de todas as células Material coletado Raspagem da mucosa bucal ou nasal Células epiteliais se descamam facilmente Saliva Sangue Pele Pelos com raiz Urina Esperma Armazenamento Qualidade e rendimento Temperatura ambiente 4 ºC ou 80 ºC Dias meses anos COLETA DE AMOSTRAS COLETA Sangue em tubo com EDTA anticoag Inverter manualmente para homogeneizar Armazenar e levar para laboratório Separar plasma PREPARO DO SANGUE Separar plasma Centrifugação 10 min 3000 rpm Descartar sobrenadante com pipeta Passar tubo de EDTA no vórtex Transferir hemácias para tubo identificado Armazenar em freezer 80 ºC PREPARAÇÃO DO SANGUE Vortex Centrífuga PREPARAÇÃO DO SANGUE Abertura da célula Remover membrana Utilização de proteases quebram proteína da membrana Quebram ligação peptídica dos aa das proteínas No eppendorf com hemáceas Adicionar tampão e centrifugar 3500 g 15 min 4 ºC Remover sobrenadante e suspender pellet em tampão no vórtex Incubar em banhomaria 37 ºC 1 hr Adicionar proteinase K e incubar 50 ºC por 3 hrs Adicionar fenol e centrifugar Transferir sobrenadante Adicionar etanol Retirar DNA precipitado e transferir para tubo ou centrifugar e descartar sobrenadante Adicionar tampão pH 8 no tubo com DNA Armazenar EXTRAÇÃO DE DNA SANGUE Análise de densidade óptica em espectrofotômetro Concentração DNA absorve luz no comprimento de onda de 260 nm Nano ou picogramasµL 1 DO 260 50 µg de DNA dupla hélice Detecta contaminação Absorbância Qualidade relação DO260DO280 Deve ser 18 DNA não contaminado com proteína PUREZA E CONCENTRAÇÃO NANODROP Eletroforese do DNA em gel de agarose Qualidade INTEGRIDADE Bandas claras fortes e espessas Não pode ser vista no Nanodrop INTEGRIDADE DO DNA Duas técnicas mais utilizadas PCR Polymerase Chain Reaction Reação em Cadeia da Polimerase Estuda o STR Short Tandem Repeat Repetições curtas em Tandem Permite que amostras com quantidades diminutas de DNA ou apresentando alto grau de degradação possam ser tipadas RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism Polimorfismo dos Comprimentos de Fragmentos de Restrição Estuda o VNTR Variable Number of Tandem Repeats Número Variável de Repetições em Sequência Necessita de alta quantidade de DNA com boa qualidade ANALISAR O DNA PARA TESTE DE PATERNIDADE STR ou microssatélites por PCR Sequências curtas de nucleotídeos 26 que se repetem ao longo de trechos da molécula de DNA VNTR ou minissatélites por RFLP Sequência de 10 a 100 nucleotídeos repetidos várias vezes no DNA Teste de DNA Detectar sequências de DNA similares entre indivíduos Analisar a quantidade de repetições de um determinado gene e comparar a compatibilidade entre as amostras de DNA Cada pessoa tem um padrão específico dessas repetições As repetições são herdadas ANALISAR O DNA PARA TESTE DE PATERNIDADE Microssatélite Repetição mais comuns de 2 a 4 bases ANALISAR O DNA PARA TESTE DE PATERNIDADE Minissatélite Repetição de muitas bases ANALISAR O DNA PARA TESTE DE PATERNIDADE Polymerase Chain Reaction Reação em Cadeia da Polimerase Método de amplificação múltiplas cópias de DNA Extraído o DNA Mistura dNTPs Primers ou oligonucleotídeos Enzima DNA polimerase Solução tampão Termociclador Ciclos PCR Desoxirribonucleotídeos Fosfatados Nucleotídeos do DNA Base A T C G Desoxirribose 3 grupos fosfato dATP desoxiAdenosina Trifosfatada dCTP desoxiCitidina Trifosfatada dGTP desoxiGuanosina Trifosfatada dTTP desoxiTimidina Trifosfatada Utilizados para amplificar o DNA dNTPS Segmentos de ácidos nucléicos com 15 a 30 nucleotídeos Sequência complementar do DNA Sequência nucleotídica específica previamente determinada de acordo com o trecho de DNA que se deseja amplificar PRIMERS OU OLIGONUCLEOTÍDEOS Responsáveis pela síntese do DNA Adicionam nucleotídeos um por um à fita crescente de DNA Termoestável Suporta altas temperaturas Identificada pela primeira vez na bactéria Thermus aquaticus encontrada em fontes hidrotermais 40 minutos a 94 ºC ENZIMA DNA POLIMERASE Garantir pH e concentrações iônicas adequadas à reação Água Mg2 para otimizar a reação SOLUÇÃO TAMPÃO DNA extraído dNTPs Primers Enzima DNA polimerase Solução tampão Água Mg2 MIX DE PCR Ciclos 30 40 ciclos 1º 95ºC 5 min Desnaturação 2º 63ºC 45 seg 35 vezes Anelamento dos primers 3º 72 ºC 10 min Extensão DNA polimerase 4º 4ºC infinito Cessar a reação TERMOCICLADOR Desnaturação 96 C Alta temperatura para separar ou desnaturar as fitas de DNA Proporciona um molde de fita simples para a cópia Anelamento 55 65 C Resfria a reação para que os primers possam se ligar às suas sequências complementares no DNA molde de fita simples Extensão 72 C Eleva a temperatura da reação para que a Taq polimerase estenda os primers sintetizando novas fitas de DNA com os dNTPs FASES DA PCR PCR Polymerase Chain Reaction 30 40 cycles of 3 steps Step 1 denaturation 1 minut 94 C Step 2 annealing 45 seconds 54 C forward and reverse primers Step 3 extension 2 minutes 72 C only dNTPs Andy Venterstrate 1999 PCR CICLO 1 2 3 Eletroforese em Gel Método para separar identificar analisar e caracterizar fragmentos de DNA Ocorre pela migração do DNA em um gel durante a aplicação de uma diferença de potencial O tamanho e formato das moléculas de DNA migrantes influenciam a separação no gel VISUALIZAÇÃO DA PCR Gel de Agarose Tampão líquido Brometo de Etídeo ELETROFORESE Gel Cuba com tampão Pipeta Aplicação do DNA nos poços ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE Luz Ultravioleta Fluorescência das bandas de DNA FOTODOCUMENTADOR VISUALIZAÇÃO TESTE DE DNA Tecnologia Processos automatizados para análise de STR Primers e dNTPs marcados com diferentes corantes fluoróforos Sistemas de detecção a laser em separação eletroforética em tempo real TESTE DE DNA POR PCR STR repetições curtas em Tandem Teste multiplex amplifica várias regiões de STR simultaneamente e são separadas por fluorescência 13 CODIS Core STR Loci with Chromosomal Positions image courtesy of National Institute of Health Kits comerciais para a realização de PCR multiplex com alvos STR PowerPlex 16 kit Promega e o AmpFISTRIdentifilerTM kit AppliedBiosystems Amplificam 16 STR simultaneamente utilizando oligonucleotídeos marcados com fluorescências de diferentes cores Sequenciadores automáticos ABI 3130 e ABI 3500 Possibilitam detecção de fluorescência multicolor TESTE DE DNA POR PCR MULTIPLEX STR repetições curtas em Tandem MÃE CRIANÇA PAI Metodologia eleita por todos os países para identificação de indivíduos e tipagem de criminosos Rapidez Acuidade Alto poder de discriminação ANÁLISE AUTOMATIZADA DE REGIÕES STR Rastreamento de linhagens paternas Útil em casos de delitos sexuais Mistura de material genético do agressor e da vítima com quantidades ínfimas da fração masculina TIPAGEM DO CROMOSSOMO Y A comparação dos perfis deve ser acompanhada de análise estatística para estabelecer a probabilidade de vínculo biológico Reflete quantas vezes o suposto pai compartilha alelos paternos com o filho em diferentes loci analisados ÍNDICE DE PATERNDADE RFLP Polimorfismo dos Comprimentos de Fragmentos de Restrição Processo de digestão com enzima de restrição DNA extraído Solução tampão Enzima de restrição Reconhece sítio de corte Termociclador Resultado diferentes fragmentos de DNA RFLP Enzimas que cortam o DNA Cada enzima reconhece um ou mais sequências alvo sítio de restrição e corta o DNA nestas sequências ou perto delas Sítios em posições prédeterminadas no genoma Produz diferentes tamanhos de fragmentos de DNA ENZIMA DE RESTRIÇÃO Enzima de restrição CD147 W TA A não corta G corta Sequência do Gene CD147 a ser amplificada EF5642801c167AG ACCCCAGAGAGCAGGATCAGGCCGGGGCAGGAGGAGCTCGGCTCAAGACCCGGCTCA GCTGCACGCTGAACGACAGCGCCGCCGAGGTCAGTCGGCCACCGCTGGGTGAAGGCG GGCAAGGTGCTCAAGGAGGACGCGCTGCCTGGCCAGAGCATGGAGTATGAGTGAGTGC GGCCCCGAGCGGCCCGAGTCCCCGTCCGCCACCGCTGCCCGTGTGCCGGGACTCTGCA GTCAGCGGGCTCTCAGATAG ENZIMA DE RESTRIÇÃO RFLP TESTE DE DNA POR RFLP DNA FINGERPRINT OU IMPRESSÃO DIGITAL DO DNA Validar paternidade em inseminação artificial Classificar e separar crias de coberturas com vários reprodutores Estação de monta com reprodutor múltiplo Construção de árvore genealógica Validar a identidade e pedigree animal Sêmen importado Detecção precoce de doenças Ferramenta de auxílio na seleção para produção Triagem genética para características de interesse Evitar endogamia em cruzamentos TE e IA Determinar origens de indivíduos Conservação e preservação de animais IMPOSTÂNCIA DOS TESTES DE DNA ANIMAL QUEM É O PAI QUEM É O PAI QUEM É O PAI