Reação de Cadeia de Polimerase: Aplicações e Componentes

PCR A PCR Reação de Cadeia de Polimerase apresenta ampla gama de aplicações em vários ramos da pesquisa científica Essa reação possibilita que determinada região do genoma de qualquer organismo seja multiplicada em milhões de cópias o que facilita a análise genética e permite o desenvolvimento de técnicas de diagnóstico muito mais sensíveis e mais específicas do que as tradicionalmente utilizadas PCR A alta sensibilidade a especificidade a facilidade de execução e a análise de grande número de amostras simultaneamente fazem dessa técnica uma opção atrativa para estudos epidemiológicos e para caracterização de microrganismos causadores de doenças Para que se possa amplificar dado segmento de DNA é necessário que as partes finais da sequência sejam conhecidas PCR Os elementos envolvidos nessa reação são basicamente os mesmos componentes do processo de replicação que ocorre nas células vivas A solução em que ocorre a reação master mix é preparada em banho de gelo e colocada em microtubos de plástico esterilizados PCR Portanto a Reação em Cadeia da Polimerase amplifica uma sequência específica de DNA como objetivo de tornála abundante e disponível para diversas técnicas de biologia molecular Alvos do PCR Regiões que flanqueiam a sequência específica de DNA a ser amplificada pode ser um gene inteiro ou somente uma região pequena PCR São componentes da PCR a Amostra de DNA que contém o segmento a ser amplificado DNA extraído de amostras de sangue de culturas de microrganismos de espécimes clínicos de plantas etc b Mistura que contenha os nucleotídeos dNTPs dATPs dTTPs dCTPs e dGTPs necessários para a síntese das novas fitas de DNA c Enzima DNApolimerase que é responsável pela síntese das novas fitas de DNA TaqDNApolimerase em soluçãotampão d Cloreto de magnésio cofator da reação PCR e Dois iniciadores ou primers que são pequenas sequências conhecidas de DNA oligonucleotídeos que delimitam e são complementares à regiãoalvo de amplificação Os primers são sintetizados em laboratórios especializados sob encomenda e após a sua diluição são mantidos a 20C PCR Targets O número de bases nos alvos pode variar TTAAGGCTCGA AATTGGTTAA O Representa o meio da sequência de DNA e não há problemas em não conhecêla para poder amplificála PCR Primers sequências de 15 a 30 nucleotídeos fita única usadas para flanquear as extremidades da região a ser amplificada Marcam o início e o fim da sequênciaalvo PCR Primers Um primer para cada extremidade da sua sequência alvo deve ser desenhado para que as fitas sejam copiadas simultaneamente em ambas as direções PCR Primers TTAACGGCCTTAA TTTAAACCGGTT AATTGCCGGAATT e AAATTTGGCCAA TTAACGGCCTTAA TTTAAACCGGTT PCR Primers colocados em excesso na reação de PCR para que eles se liguem ao DNA alvo ao invés das duas fitas se ligarem de novo uma a outra PCR Para que ocorra a amplificação com a síntese de novas fitas de DNA as amostras devem ser submetidas à combinação adequada de temperatura e de tempo Cada ciclo da PCR apresenta três fases fundamentais que são desnaturação anelamento e extensão ou elongação Essas fases ocorrem em temperatura diferente e são programadas no aparelho chamado termociclador onde as amostras são incubadas Na hora de preparar o programa para a amplificação devem estar estabelecidos a temperatura e o tempo exato de cada uma dessas fases e também o número de repetições dos ciclos Taq DNA Polimerase Bactéria termófila Thermus aquaticus e produzida em Escherichia coli Essa bacteria é encontrada sobrevivendo a altas temperaturas em Geisers no Yellow Stone National Park Taq DNA Polimerase Produz enzima DNA polymerase que amplifica o DNA a partir do anelamento com os primers na presença de Mg a altas temperaturas 100C Desnaturação É o Primeiro passo do PCR Fitas de DNA são separadas através de aquecimento a 95C A desnaturação permite que os primers se liguem à região complementar à sua sequência na amostra de DNA Desnaturação mais longa hot start no primeiro ciclo pode ser utilizada com a finalidade de otimizar essa fase permitindo o melhor anelamento dos primers Anelamento Duas sequências de nucleotídeos são ligadas através da formação de pontes de hidrogênio Ligação dos primers com o DNA Alvo 55C Nessa etapa uma vez desnaturado o DNA a temperatura da reação é reduzida Dessa forma cada primer se encaixa nas respectivas sequências complementares à regiãoalvo da amplificação Com o molde já identificado a enzima DNApolimerase adiciona as bases complementares formando uma nova fita Temse novamente a duplicação da fita de A temperatura é elevada até cerca de 72C para que a enzima DNApolimerase TaqDNApolimerase se posicione junto aos primers que se anelaram anteriormente e com o auxílio do magnésio seja iniciada a síntese da nova fita A síntese da nova fita de DNA se inicia a partir dos primers ou iniciadores A síntese se dá por meio da utilização dos nucleotídeos dNTPs que foram adicionados ao tampão e que são sempre complementares à fitamolde Dessa maneira são formadas novas fitas de DNA de dupla hélice correspondente a região alvo de amplificação delimitada pelos primers Elongação Etapas do PCR Após o término de um ciclo desnaturação anelamento e elongação todo o processo é repetido várias vezes 40 vezes em média até que se obtenha grande quantidade do DNA a ser amplificado A cada ciclo de amplificação o número de cópias da sequênciaalvo é duplicado e com a evolução dos ciclos da reação ocorre aumento exponencial do número dessas sequências O aumento do número de ciclos não é aconselhado em decorrência da redução da especificidade da reação Taq polimerase Primers Tampão Água ETAPAS 1 Adição de reagentes DNA dATP dCTP dGTP dTTP nucleotideos Taq polimerase Primers Tampão Água 94ºC DESNATURAÇÃO 1 Adição de reagentes 2 Alternância de temperaturas Termociclador DNA dATP dCTP dGTP dTTP nucleotideos ETAPAS Taq polimerase Primers Tampão Água 94ºC DENATURAÇÃO 57ºC ANELAMENTO 1 Adição de reagentes 2 Alternância de temperaturas Termociclador DNA dATP dCTP dGTP dTTP nucleotideos ETAPAS Taq polimerase Primers Tampão Água 94ºC DENATURAÇÃO 72ºC ELONGAÇÃO 57ºC ANELAMENTO 1 Adição de reagentes 2 Alternância de temperaturas Termociclador 2540 35 CICLOS DNA dATP dCTP dGTP dTTP nucleotideos ETAPAS qPCR A tecnologia de PCR quantitativa em Tempo Real qPCR é uma evolução do método de PCR Polymerase Chain Reaction ou Reação em Cadeia da Polimerase Os ensaios de PCR em Tempo Real são muito mais sensíveis específicos e rápidos principalmente quando comparados aos testes convencionais levando de 2 a 3 horas para emitir o resultado Isto porque a metodologia permite realizar a quantificação do alvo durante o processo de amplificação do DNA Na PCR convencional a detecção da amostra ocorre por eletroforese qPCR Na qPCR o resultado é visualizado imediatamente dispensando a eletroforese Isto e possível pela adição de sondas fluorescentes às reações de PCR A amplificação do DNAalvo e monitorada durante o processo de qPCR A medida que o DNA e amplificado o nível de fluorescência cresce proporcionalmente Se uma pessoa estiver trabalhando com amostra de RNA inicialmente é necessário realizar a sua conversão para DNA complementar cDNA antes com reagentes específicos etapa conhecida como transcrição reversa RT O equipamento é capaz de detectar a fluorescência eventualmente produzida pela amostra e assim a técnica permite acompanhar a reação e a apresentação dos resultados em tempo real Além disso por meio do monitoramento da taxa de aumento da fluorescência na reação de PCR e possível determinar com precisão a quantidade de DNAalvo presente na amostra original A qPCR pode ser utilizada para se avaliar a presença de um patógeno em uma amostra podendo ser um teste qualitativo ou quantitativo