Anormalidades Cromossômicas em Pacientes com Cardiopatia Congênita

Artigo Original Anormalidades Cromossômicas entre Pacientes com Cardiopatia Congênita Chromosomal Abnormalities in Patients with Congenital Heart Disease Patrícia Trevisan1 Tatiana Diehl Zen1 Rafael Fabiano Machado Rosa123 Juliane Nascimento da Silva 1 Dayane Bohn Koshiyama1 Giorgio Adriano Paskulin13 Paulo Ricardo Gazzola Zen13 Programa de PósGraduação em Patologia da Universidade Federal e Ciências da Saúde de Porto Alegre UFCSPA1 Porto Alegre RS Genética Clínica Hospital MaternoInfantil Presidente Vargas HMIPV2 Porto Alegre RS Genética Clínica Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre UFCSPA e Complexo Hospitalar Santa Casa de Porto Alegre CHSCPA3 Porto Alegre RS Brasil Correspondência Paulo Ricardo Gazzola Zen Rua Sarmento Leite 245403 Centro CEP 90050 170 Porto Alegre RS Brasil Email paulozenufcspaedubr Artigo recebido em 30113 revisado em 19613 aceito em 24613 DOI 105935abc20130204 Resumo Fundamento As anormalidades cromossômicas ACs representam importante causa de cardiopatia congênita CC Objetivo Determinar a frequência os tipos e as características clínicas de ACs identificadas em uma amostra prospectiva e consecutiva de pacientes com CC Método Nossa amostra foi composta por pacientes com CC avaliados em sua primeira hospitalização em uma unidade cardíaca de tratamento intensivo de um hospital pediátrico de referência do sul do Brasil Todos os pacientes foram submetidos à avaliação clínica e citogenética através do cariótipo de alta resolução Os defeitos cardíacos foram classificados segundo Botto e cols Na análise estatística utilizouse o quiquadrado o teste exato de Fisher e odds ratio p 005 Resultados Nossa amostra foi composta de 298 pacientes 534 do sexo masculino com idades variando de um dia a 14 anos Anormalidades cromossômicas foram observadas em 50 pacientes 168 sendo que 49 deles eram sindrômicos Quanto às ACs 44 delas 88 eram numéricas 40 pacientes com 21 dois com 18 um com triplo X e um com 45X e seis 12 estruturais dois pacientes com der1421 21 um com i21q um com dup17p um com del6p e um com add18p O grupo de CCs mais associado a ACs foi o do defeito de septo atrioventricular Conclusões ACs detectadas pelo cariótipo são frequentes entre pacientes com CC Assim os profissionais especialmente aqueles que trabalham em serviços de cardiologia pediátrica devem estar cientes das implicações que a realização do cariótipo pode trazer tanto para o diagnóstico tratamento e prognóstico desses pacientes como para o seu aconselhamento genético Arq Bras Cardiol 2013 1016495501 PalavrasChave Cardiopatias Congênitas Aberrações Cromossônicas Sindrome de Down Cariótipo Metáfase Abstract Background Chromosomal abnormalities CAs are an important cause of congenital heart disease CHD Objective Determine the frequency types and clinical characteristics of CAs identified in a sample of prospective and consecutive patients with CHD Method Our sample consisted of patients with CHD evaluated during their first hospitalization in a cardiac intensive care unit of a pediatric referral hospital in Southern Brazil All patients underwent clinical and cytogenetic assessment through highresolution karyotype CHDs were classified according to Botto et al Chisquare Fisher exact test and odds ratio were used in the statistical analysis p 005 Results Our sample consisted of 298 patients 534 males with age ranging from 1 day to 14 years CAs were observed in 50 patients 168 and 49 of them were syndromic As for the CAs 44 88 were numeric 40 patients with 21 2 with 18 1 with triple X and one with 45X and 6 12 structural 2 patients with der1421 21 1 with i21q 1 with dup17p 1 with del6p and 1 with add18p The group of CHDs more often associated with CAs was atrioventricular septal defect Conclusions CAs detected through karyotyping are frequent in patients with CHD Thus professionals especially those working in Pediatric Cardiology Services must be aware of the implications that performing the karyotype can bring to the diagnosis treatment and prognosis and for genetic counseling of patients and families Arq Bras Cardiol 2013 1016495501 Keywords Heart Defects Congenital Chromosome Aberrations Down Syndrome Karyotype Metaphase Full texts in English httpwwwarquivosonlinecombr 495 Artigo Original Trevisan e cols Anomalias cromossômicas e cardiopatias congênitas Arq Bras Cardiol 2013 1016495501 Introdução As malformações cardíacas são defeitos encontrados com incidência que varia de 450 por 1000 nascimentos12 Elas são definidas como um conjunto de alterações que acometem o coração e os grandes vasos2 Dependendo do tipo e da severidade da alteração os pacientes poderão necessitar de diferentes intervenções3 sendo que a necessidade de hospitalização em unidades de tratamento intensivo é frequente entre os mesmos4 Além disso estudos demonstram o grande impacto que os defeitos cardíacos congênitos apresentam com relação à mortalidade em crianças5 A etiologia das malformações cardíacas ainda é pouco compreendida6 sendo que sua determinação é um fator bastante importante para o adequado manejo e tratamento dos pacientes Entre as causas conhecidas de cardiopatia congênita destacamse as anormalidades cromossômicas7 Foi a partir da segunda metade do século XX com o desenvolvimento de novas técnicas de cultivo celular associadas à utilização da colchicina e de soluções hipotônicas no tratamento das metáfases que a citogenética que é o estudo dos cromossomos difundiuse Em 1970 Caspersson e cols8 desenvolveram uma técnica de coloração que proporcionou a identificação mais precisa de cada cromossomo através do seu padrão único de regiões de coloração mais ou menos intensa bandas Além disso com o surgimento de técnicas de alta resolução cromossômica por Yunis9 em 1981 os cromossomos puderam ser estudados em uma etapa mais precoce da mitose prómetáfase fazendo com que as bandas cromossômicas pudessem ser mais detalhadas10 Vários estudos foram desenvolvidos nas últimas décadas com o objetivo de avaliar a frequência e os tipos de alterações cromossômicas identificadas através do cariótipo entre pacientes com cardiopatia congênita Os índices observados usualmente variam entre 318 Contudo esses trabalhos são retrospectivos na sua maioria e baseados em bancos de dados361122 Além disso chama a atenção a quase inexistência de estudos relacionados desenvolvidos na América Latina20 Assim o nosso estudo teve como objetivo determinar a frequência os tipos e as características clínicas de anormalidades cromossômicas identificadas através do cariótipo de alta resolução em uma amostra prospectiva e consecutiva de pacientes com cardiopatia congênita Métodos Pacientes Nossa amostra foi composta pelos pacientes pertencentes aos estudos de Rosa e cols23 e Zen e cols24 Eles consistiram em uma coorte prospectiva e consecutiva de pacientes com cardiopatia congênita hospitalizados em uma unidade cardíaca de tratamento intensivo de um hospital pediátrico de referência do sul do país Foram incluídos apenas aqueles pacientes em sua primeira hospitalização O período total de avaliação foi de 15 ano Este estudo foi aprovado pelos Comitês de Ética em Pesquisa do hospital e da universidade Somente foram incluídos pacientes cujos familiares consentiram em participar do estudo Protocolo clínico Para cada paciente foi preenchida uma ficha de avaliação por geneticistas clínicos participantes do estudo Isso foi realizado através de entrevista direta com os familiares revisão do prontuário hospitalar e avaliação clínica dos pacientes Em nosso estudo foram utilizados dados gerais como sexo idade dos pacientes motivo da internação procedência e aspecto sindrômico Quanto à procedência os pacientes foram divididos em procedentes de Porto Alegre cidade onde foi desenvolvido o estudo Grande Porto Alegre restante do Rio Grande do Sul e outros estados O diagnóstico sindrômico foi realizado antes do resultado da análise citogenética e definido com base exclusivamente no exame físico levandose em consideração tanto dados quantitativos número de dismorfias menores e maiores quanto qualitativos tipos e padrão das dismorfias presença de alterações neurológicas25 O diagnóstico cardiológico foi obtido a partir dos resultados dos exames ecocardiográficos cirurgia eou cateterismo cardíaco As cardiopatias congênitas foram então definidas e classificadas de acordo com Botto e cols26 Além disso as cardiopatias congênitas foram classificadas em complexas e cianóticas Estudo citogenético através do cariótipo de alta resolução Uma amostra de sangue foi coletada de cada paciente sendo realizado o cariótipo de alta resolução 550 bandas conforme a técnica modificada de Yunis9 Essa técnica diferentemente do cariótipo convencional permite que os cromossomos possam ser analisados em uma etapa mais precoce da mitose na prómetáfase quando os cromossomos estão menos condensados Assim ela permite a melhor identificação de anormalidades cromossômicas estruturais menores como pequenas deleções Em resumo essa técnica se baseia no procedimento de cultivo celular de linfócitos estimulados com fitohemaglutinina por 72 horas sincronização com o uso de metotrexatotimidina e coloração por bandamento GTG A análise das lâminas para cada caso foi realizada em microscópio Axioskop Zeiss utilizando uma contagem de 25 placas metafásicas a qual exclui um grau de mosaicismo de até 12 para limite de confiança de 9527 Análise estatística O processamento e a análise dos dados foram realizados através dos programas SPSS para Windows versão 180 Microsoft Excel 2002 e PEPI versão 40 Os testes estatísticos utilizados foram o quiquadrado e o teste exato de Fisher bicaudado para comparação de frequências e o odds ratio para avaliar a associação entre defeitos cardíacos e anormalidades cromossômicas Foram considerados como significantes valores de p 005 Resultados Dados gerais da amostra Em um período de um ano e seis meses 333 pacientes portadores de cardiopatia congênita preencheram o critério de inclusão no estudo Porém 31 deles não participaram do mesmo por terem ido a óbito n 12 ou por terem tido alta hospitalar antes da aplicação do termo de consentimento 496 Artigo Original Trevisan e cols Anomalias cromossômicas e cardiopatias congênitas Arq Bras Cardiol 2013 1016495501 informado n 4 ou porque os pais não consentiram em participar n 15 Dos 302 pacientes com consentimento o cariótipo foi realizado com sucesso em 298 sendo que estes compuseram a nossa amostra final Desses 298 pacientes 159 534 eram do sexo masculino com idade variando de um dia de vida até 14 anos sendo que pouco mais da metade 587 encontravase no primeiro ano de vida O principal motivo de internação foi a cirurgia cardíaca 762 entre os demais pacientes cerca de metade ali estava para avaliação cardiológica e metade para realização de cateterismo cardíaco Quanto à procedência 138 eram de Porto Alegre 211 da Grande Porto Alegre 55 do restante do Rio Grande do Sul e 101 de outros estados Quanto ao exame físico 295 dos pacientes foram classificados como sindrômicos Destes 705 possuíam fenótipo de uma síndrome clássica Os tipos anatômicos de malformação cardíaca observados encontramse expostos na Tabela 1 Comunicação interventricular CIV e interatrial CIA foram as alterações mais frequentes observadas cada uma em 148 dos casos Segundo a classificação de Botto e cols26 o principal grupo de defeitos cardíacos observado foi o septal 295 Tabela 1 Cardiopatia complexa foi observada em 346 dos casos e cianótica em 352 Alterações cromossômicas Anormalidades cromossômicas foram observadas em 50 indivíduos 168 sendo a trissomia livre do cromossomo 21 a mais frequente delas n 40 Dos demais casos quatro apresentavam alterações numéricas e seis alterações estruturais Figura 1 Tabelas 1 e 2 Apesar de a maioria dos pacientes com alterações cromossômicas ser originária do interior do estado não verificamos diferença estatisticamente significante p 0998 quando avaliamos a presença ou não dessas alterações em relação à procedência A maioria dos pacientes com anormalidades cromossômicas foi hospitalizada na UTI para realização de cirurgia cardíaca 762 e avaliação cardiológica 117 As principais características clínicas dos 50 pacientes com alterações cromossômicas encontramse expostas nas Tabelas 1 e 2 Segundo a classificação de Botto e cols26 o grupo de defeitos cardíacos de nossa amostra mais associado a alterações cromossômicas foi o do defeito de septo atrioventricular 667 OR 16929 IC95 7434 3855 p 0001 As malformações septais foram frequentes 193 contudo não chegaram a apresentar associação estatisticamente significante OR 1284 IC95 06732452 p 0448 Os grupos dos defeitos cardíacos obstrutivos direitos e esquerdos por outro lado apresentaram associação inversa Tabela 1 Defeitos cardíacos congênitos classificados segundo Botto e cols26 e achados cariotípicos observados nos pacientes da amostra Cariótipo normal Alteração cromossômica Total Numérica Estrutural Defeitos cardíacos 21 18 XXX 45X dup17p add18p i21q del6p der142121 Defeitos de via de saída 56 6 1 1 64 215 Tetralogia de Fallot 26 6 1 1 34 Defeito de septo atrioventricular 11 21 1 33 111 Anomalia de Ebstein 3 1 4 13 Defeitos obstrutivos esquerdos 45 1 1 47 158 Coarctação de aorta 28 1 29 Estenose de válvula aórtica 4 1 5 Defeitos septais 71 11 1 1 1 1 1 1 88 295 Defeitos de septo ventricular 30 9 1 1 1 1 1 44 Defeitos de septo atrial 41 2 1 44 Outros defeitos cardíacos 62 62 208 Total 248 40 2 1 1 1 1 1 1 2 298 100 18 trissomia livre do cromossomo 18 21 trissomia livre do cromossomo 21 45X monossomia do cromossomo X add18p material adicional junto à extremidade do braço curto do cromossomo 18 del6p deleção do braço curto do cromossomo 6 der142121 trissomia do cromossomo 21 secundária à translocação entre os cromossomos 14 e 21 dup17p duplicação do braço curto do cromossomo 17 i21q síndrome de Down secundária a isocromossomo do braço longo do cromossomo 21 XXX trissomia do cromossomo X 497 Artigo Original Trevisan e cols Anomalias cromossômicas e cardiopatias congênitas Arq Bras Cardiol 2013 1016495501 Figura 1 Cariótipos parciais por banda GTG e ideogramas das anormalidades cromossômicas observadas na amostra Tabela 2 Classificação quanto ao aspecto sindrômico baseandose somente no exame físico Alteração cromossômica Síndrome clássica Síndrome não definida Cardiopatia dismorfias Cardiopatia isolada Total 21 40 0 0 0 40 18 1 1 0 0 2 XXX 0 0 1 0 1 45X 1 0 0 0 1 der142121 2 0 0 0 2 i21q 1 0 0 0 1 dup17p 0 1 0 0 1 del6p 0 1 0 0 1 add18p 0 1 0 0 1 Total 44 5 1 0 50 18 trissomia livre do cromossomo 18 21 trissomia livre do cromossomo 21 add18p material adicional junto à extremidade do braço curto do cromossomo 18 45X monossomia do cromossomo X del6p deleção do braço curto do cromossomo 6 der142121 trissomia do cromossomo 21 secundária à translocação entre os cromossomos 14 e 21 dup17p duplicação do braço curto do cromossomo 17 i21q síndrome de Down secundária a isocromossomo do braço longo do cromossomo 21 XXX trissomia do cromossomo X 498 Artigo Original Trevisan e cols Anomalias cromossômicas e cardiopatias congênitas Arq Bras Cardiol 2013 1016495501 ou seja foram estatisticamente não associados a alterações cromossômicas Quando se avaliaram os tipos anatômicos pertencentes aos grupos classificados conforme Botto e cols26 de forma separada verificouse que os defeitos de septo atrioventricular 667 OR 16929 IC95 74343855 p 0001 e os defeitos de septo ventricular 318 OR 2826 IC95 13685839 p 0005 foram os mais associados com as anormalidades cromossômicas Figura 2 Todos os casos de alteração cromossômica associados ao defeito de septo atrioventricular foram compostos de pacientes com síndrome de Down Por outro lado a Dtransposição das grandes artérias foi estatisticamente não associada a alterações cromossômicas nenhum dos casos desse defeito era portador da mesma p 00310 Tabela 1 Ao exame físico 49 dos 50 pacientes com anormalidades cromossômicas foram considerados sindrômicos somente a paciente com triplo X era não sindrômica Tabela 2 Discussão Em nossa revisão da literatura utilizando os bancos de dados PubMed e SciELO identificamos 14 estudos similares ao nosso que avaliaram a frequência e os tipos de anormalidades cromossômicas identificadas através do cariótipo entre pacientes com cardiopatia congênita361122 Estudos como o de Schellberg e cols28 que excluíram pacientes com alterações cromossômicas frequentes como a trissomia do cromossomo 21 da amostra não foram incluídos na nossa análise A grande maioria dos estudos similares foi desenvolvida nos Estados Unidos e na Europa Apenas um deles Amorim e cols20 foi realizado na América Latina e no Brasil Contudo chama a atenção que diferentemente de nós a maior parte dos estudos incluindo o de Amorim e cols20 foi realizada de forma retrospectiva a partir principalmente de bancos de dados Devido a isso em muitos estudos o cariótipo não foi realizado de forma padronizada a sua testagem muitas vezes pareceu se limitar principalmente àqueles casos com suspeita de anormalidade cromossômica1218 Além disso o nosso estudo foi o único no qual um geneticista examinou e realizou a classificação sindrômica dos pacientes com base nos dados do exame físico e dismorfológico Tabela 2 A frequência das cromossomopatias identificadas através do cariótipo em nosso estudo 168 foi similar à dos trabalhos de Ferencz e cols11 Pradat13 Harris e cols19 e Amorim e cols20 que encontraram índices de 129231 Diferenças significativas foram verificadas em relação aos trabalhos de Stoll e cols12 Hanna e cols14 Goodship e cols15 Grech e Gatt3 Meberg e cols16 Roodpeyma e cols6 Bosi e cols17 Calzolari e cols18 Dadvand e cols21 e Hartman e cols22 que apresentaram índices de 3121 p 005 Estes se caracterizaram por possuir amostras distintas tanto pelo número como pelas características clínicas de seus pacientes Em nossa amostra a frequência de anormalidades cromossômicas não diferiu quanto à procedência dos pacientes sugerindo que talvez não tenha havido uma seleção associada às cromossomopatias Isto é não houve diferença entre a frequência de pacientes com alteração grave advinda da capital em relação ao interior do estado A síndrome de Down especialmente através da trissomia livre do cromossomo 21 foi a anormalidade cromossômica mais observada em nossa série de pacientes 144 o que é concordante com a literatura A trissomia livre Figura 2 Gráfico mostrando os valores de odds ratio com seus intervalos de confiança 95 dos principais grupos e tipos anatômicos de defeitos cardíacos observados na amostra em relação à presença de anormalidades cromossômicas Grupos segundo Botto e cols26 Tipos anatômicos Defeitos de via de saída Defeito de septo atrioventricular Defeito septais Tetralogia de Fallot Defeito de septo atrioventricular Defeito de septo ventricular odds Ratio 1 10 OR0653 95 IC0291472 OR16929 95 IC74343855 OR1284 95 IC06732452 OR1626 95 IC06893837 OR16929 95 IC74343855 OR2826 95 IC13685839 499 Artigo Original Trevisan e cols Anomalias cromossômicas e cardiopatias congênitas Arq Bras Cardiol 2013 1016495501 do cromossomo 18 constituiu a segunda alteração mais frequente e recorrente entre os pacientes com cardiopatia congênita Outra condição frequentemente descrita nos estudos mas ausente em nossa amostra foi a trissomia do cromossomo 1311131622 Quanto às alterações estruturais somente a deleção do braço curto do cromossomo 6 foi observada também em outro estudo22 O paciente com duplicação do braço curto do cromossomo 17 foi descrito em detalhes por Paskulin e cols29 A frequência de alterações estruturais observada em nossa amostra 12 foi similar à da maioria dos demais estudos 42167 diferindo apenas em relação a Ferencz e cols11 que encontrou frequência inferior 44 Chama a atenção que esse estudo foi o mais antigo desenvolvido no início da década de 1980 em uma época em que a técnica de alta resolução estava sendo descrita10 Em nossa série apesar da contagem de 25 placas metafásicas a qual exclui grau de mosaicismo de até 12 para um limite de confiança de 9527 não observamos casos de mosaicismo Estes foram descritos em baixa frequência apenas nos estudos de Goodship e cols15 e Hartman e cols22 Apesar disso a frequência total de alterações cromossômicas foi inferior à de nosso estudo Quanto à relação das cromossomopatias com os tipos de defeitos cardíacos observamos de acordo com Botto e cols26 uma associação bastante significativa com o defeito do septo atrioventricular à custa principalmente dos pacientes com síndrome de Down nossa frequência foi de 667 Esse achado é concordante com a literatura que descreve índices de 405030 Assim quando estamos diante de um paciente com defeito de septo atrioventricular existe grande probabilidade que chega a ser de cerca de um em dois de que ele tenha síndrome de Down Chamounos a atenção a ausência de associação de cromossomopatias com alguns grupos de defeitos no caso obstrutivos direitos e esquerdos que incluem defeitos como a estenose pulmonar e a coarctação de aorta Isoladamente observamos isso apenas em relação a um defeito de via de saída a Dtransposição das grandes artérias Apesar de não termos observado associação entre cromossomopatias e defeitos septais separadamente encontramos uma relação com defeitos do septo ventricular Na literatura anormalidades cromossômicas foram descritas em cerca de 46182 dos pacientes com defeitos do septo ventricular111819 e em nossa amostra essa frequência foi de 318 Apesar de o nosso estudo ser o único a ter descrição de classificação sindrômica por um geneticista clínico com base apenas nos achados do exame físico dismorfológico dos pacientes nossa frequência de pacientes síndrômicos 295 foi similar à descrita por Calzolari e cols18 e Amorim e cols20 Diferentemente do nosso nesses estudos os pacientes foram retrospectivamente divididos em sindrômicos ou não após o conhecimento do resultado da avaliação cariotípica e da presença de outras anormalidades em órgãos internos Alterações cromossômicas são frequentes entre indivíduos sindrômicos Em nossa amostra somente um dos 50 pacientes com anormalidades cromossômicas foi considerado não sindrômico sendo um indivíduo com triplo X Esse achado é condizente com a literatura uma vez que indivíduos com triplo X muitas vezes passam despercebidos em meio à população em geral pois usualmente não apresentam achados maiores associados Em nosso caso não podemos descartar a possibilidade de que a associação com cardiopatia congênita possa ter sido mera coincidência uma vez que ambas as condições são relativamente frequentes o triplo X ocorre em um em 1000 nascidos vivos do sexo feminino31 Apesar dos avanços ocorridos na citogenética nas últimas décadas com o desenvolvimento de técnicas moleculares como a hibridização in situ fluorescente FISH e a hibridização genômica comparativa CGH o cariótipo continua sendo uma ferramenta fundamental e básica dentro da avaliação genética10 Em nosso meio ele constitui um dos poucos exames disponíveis para a avaliação de pacientes atendidos pelo Sistema Único de Saúde o sistema de saúde público do Brasil Apesar de suas limitações na detecção de pequenos rearranjos cromossômicos como microdeleções ou microduplicações é marcante a frequência de anormalidades cromossômicas detectadas através do cariótipo entre pacientes portadores de cardiopatia congênita Assim os profissionais especialmente aqueles que trabalham em serviços de cardiologia pediátrica devem estar cientes das implicações que a realização do cariótipo pode trazer tanto para o diagnóstico tratamento e prognóstico desses pacientes como para o aconselhamento genético de suas famílias Agradecimentos Agradecemos à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Capes e ao Programa de Iniciação Científica da Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre PICUFCSPA pelas bolsas de estudo recebidas Contribuição dos autores Concepção e desenho da pesquisa Obtenção de dados Análise e interpretação dos dados Análise estatística Obtenção de financiamento e Redação do manuscrito Trevisan P Zen TD Rosa RFM da Silva JN Koshiyama DB Paskulin GA Zen PRG Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual Trevisan P Rosa RFM Paskulin GA Zen PRG Potencial Conflito de Interesses Declaro não haver conflito de interesses pertinentes Fontes de Financiamento O presente estudo foi financiado pela CAPES e PIC UFCSPA Vinculação Acadêmica Este artigo é parte de dissertação de Mestrado de Patrícia Trevisan Rafael Fabiano Machado Rosa e Paulo Ricardo Gazzola Zen pela Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre 500 Artigo Original Trevisan e cols Anomalias cromossômicas e cardiopatias congênitas Arq Bras Cardiol 2013 1016495501 1 Hoffman JI Incidence of congenital heart disease I Postnatal incidence Pediatr Cardiol 199516310313 2 Hoffman JI Kaplan S The incidence of congenital heart disease J Am Coll Cardiol 200239121890900 3 Grech V 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