Cap 02 Aspectos Genéticos e Moleculares da Produção Vegetal

1. INTRODUÇÃO\nEmbora comumente é admitido que uma característica qualquer de um ser vivo é dependente da expressão de um gene num determinado ambiente, esta expressão pode ser afetada por outros genes (pleiotropia) bem como pelo processo ontológico do organismo. O problema central da biologia é que, ao contrário da física e química, nas quais um pequeno número de forças de grande magnitude domina os fenômenos, um organismo vivo é resultante de um grande número de caminhos fracos causais determinantes, fazendo com que seja extremamente difícil estabelecer explicações completas (Lewontin, 2000). Este autor afirma ainda que um organismo vivo é a consequência única da sua ontogênese, a qual resulta de interações de forças internas e externas.\nA identificação do número de genes e do tipo de ação gênica de uma característica determinada é de fundamental importância para o avanço no conhecimento científico e a geração de processos e produtos resultantes de sua manipulação.\nOs avanços científicos na área da biologia após a metade do século XX proporcionaram o desenvolvimento de dezenas de técnicas biotecnológicas, que estão facilitando a realização de estudos de genética e de melhoramento de plantas. Nesse contexto, podem ser empregadas ferramentas biotecnológicas associadas ao uso de marcadores moleculares para caracterização e monitoramento da diversidade genética, visando a sua utilização e conservação. O estudo da estrutura genética de populações naturais e a base genética das características de interesse farmacológico são imprescindíveis para o sucesso do melhoramento destas características. A utilização de plantas medicinais como recurso terapêutico ou para o desenvolvimento de novos medicamentos, a partir das substâncias delas isoladas, ou via plantas transgênicas, tem se mostrado uma forma não convencional de produção de matérias-primas vegetais, que começa a ser melhor explorada de forma mais frequente.\nNeste capítulo, serão discutidos os tópicos relacionados com gene, genótipo e fenótipo, diversidade genética, marcadores genéticos, conservação genética, identificação varietal, melhoramento genético e plantas transgênicas. Sem que possível, os tópicos estão acompanhados de exemplos, preferencialmente com plantas medicinais ou produtos de interesse farmacológico.\n2. CONCEITO DE GENE\nO conceito de gene evoluiu tanto quanto a biologia. Uma das primeiras observações sobre o tema foi feita por Leonardo da Vinci que, ao analisar a cor dos filhos de mulheres brancas com homens pretos, sugeriu a que a semelhança do filho ao mesmo VIVE que a do pai (Wallace, 1992). Mas foi Mendel, em 1865, quando publicou pela primeira vez a expressão fator para os componentes hereditários parentais responsáveis pelas características nas progenies. Só mais tarde, em 1908, Johannsen sugeriu o termo gene para designar os fatores hereditários. \nPor gênero entende-se a unidade de herança. Contudo, os diferentes textos de genética apresentam diferentes conceitos para gene. Segundo a maioria dos autores, o seu principal atributo é a relação com a proteína que o codifica. Nesse caso, define-se gene como sendo um segmento de DNA que, através da intermediação de uma molécula mensageira de RNA, é responsável pela especificação de uma cadeia peptídica (Wallace, 1992). Entretanto, outros geneticistas incluem, além das proteínas, os RNA como produtos gênicos. Nesse caso, a definição de gene é um segmento de DNA responsável pela produção de um produto difusível (Lewin, 1994). Como existem diversos tipos de RNA além do mensageiro, que estão associados a funções distintas, como por exemplo a regulação gênica, o segundo conceito de gene é mais realista.\nPor se tratar de uma sequência de DNA, um gene pode ocorrer sob mais de uma alternativa ou alelo. Basta uma alteração na sequência de bases que cause uma mudança no produto para que se configure uma alternativa (alelo) diferente. Para simplificar o entendimento, normalmente utiliza-se o modelo básico de um gene com dois alelos para os indivíduos diploides. Esses, portanto, carregam dois alelos para o mesmo gene, un mossomo homólogo. Mas, na realidade, um gene pode ter muitas alternativas. Evidentemente, num indivíduo diploide só ocorre uma ou duas formas no máximo. Mas diferentes indivíduos podem apresentar formas alélicas diferentes uns dos outros. Um exemplo bem conhecido desde 1925 é o tipo sanguíneo na espécie humana, sendo que numa população podem ser encontrados três diferentes alelos (A, B e O) e seis distintos genótipos (AA, AB, AO, BB, BO e OO).\n3. GENÓTIPO E FENÓTIPO\nOnde termina a conexão de gene e começa o que se denomina de caractrística? Os organismos vivos têm a habilidade de mobilizar os componentes ao seu redor e converter estes componentes em seus materiais vivos. Assim, uma semente utiliza recursos do ambiente para desenvolver uma planta. Na verdade, a informação genética está presente no gene, contudo ela necessita ser decodificada e expressada. Quando se observa um caráter, observa-se o fenótipo, pois esse é resultado do somatório dos efeitos genotípicos (constituição genética), do ambiente (tudo que está ao redor que não é o genótipo) e da interação entre ambos (Suzuki et al., 1989), e muitas vezes, de efeitos pleiotrópicos.\nQuando um indivíduo heterozigoto não produz um fenótipo intermediário entre os dois homozigotos é porque a expressão gênica está sofrendo desvios de dominância, epistasia, pleiotropia, ou do ambiente. São basicamente dos tipos de interações gênicas causadoras de desvios: a interação entre os alelos do mesmo gene (dominância) e as interações entre alelos de diferentes genes (epistasia). No primeiro caso, a inexistência de interferência de um alelo sobre outro caracteriza o que se chama de co-dominância e nesse caso o fenótipo do heterozigoto é intermediário em relação aos homozigotos. Caso contrário, dependendo da magnitude dos desvios, pode ocorrer a dominância incompleta, a dominância completa e a sobredominância (quando o heterozigoto é superior a qualquer homozigoto). Devido à dominância (A>B>O) os genótipos AA e AO apresentam os mesmos fenótipos.\nA rigor, todos os genes se enquadram numa das três categorias: dominantes, co-dominantes e recessivos. A definição dada ou inferida para formas intermediárias de dominância normalmente requer conhecimento sobre a exata função do gene (Miller, 1997). E isto é muito raro, se considerarmos que uma planta pode ter mais de 20 mil genes.\nEpistasia é o efeito de um gene mutante (epistático) que mascara o efeito de outro gene mutante (hipostático) (Miller, 1997). Numa rota metabólica cuja todos os genes são epistáticos porque diferentes alelos de um gene têm efeitos diferentes podendo alterar ou suprimir produtos de outros genes que afetam pontos da mesma rota. 32\no ambiente também tem influência variável na expressão de diferentes genes. Em alguns casos, o ambiente pouco ou nada afeta a expressão de um gene, como é o caso da cor da flor da maioria das plantas. Nessas casos, um gene ou poucos genes estão interferindo nesse fenótipo. Contudo, existem muitas características cujo fenótipo depende da expressão de muitos genes e como consequência da interação entre eles e com o ambiente. Esta é uma situação onde o ambiente exerce uma grande influência. Como exemplo pode-se citar rendimento de grãos e produção de biomassa.\n\nA pleiotropia, definida como o efeito de um gene em mais de uma característica se constitui em um empecilho ao estudo da expressão gênica. Esse efeito é mais facilmente reconhecido em certas situações. Por exemplo, uma maior quantidade de lignina na planta favorece a rachadura do lenho, em condições de seca prolongada. Ou seja, os genes responsáveis pela produção de lignina acabam afetando a rachadura do lenho.\n\n4. DIVERSIDADE GENÉTICA\n\nPara que seja possível o melhoramento, há a necessidade da existência de variabilidade genética, ou seja, de diferentes genes e alelos. Isto permite ao melhorista a seleção de plantas com características desejáveis e o descarte de outras, as indesejáveis. A diversidade é uma propriedade de grupos definidos taxonomicamente, enquanto biodiversidade é um propriedade de toda a biosfera (Pielou, 1995). Portanto, antes do início do melhoramento em si, é imprescindível a caracterização da diversidade genética das populações de plantas, relativamente à característica alvo. Nesse sentido, a diversidade em plantas pode ser pensada em termos de variação interna de cada espécie. Nei (1973) associou o conceito de diversidade genética à variação genética existente em uma dada espécie, propondo a heterozigosidade esperada como medida para quantificar diversidade. Esse conceito possibilita a associação dos mecanismos microevolutivos à ideia de variação dentro das espécies e, portanto, relaciona a quantificação da diversidade ao processo evolutivo. Capítulo 2 – Aspectos genéticos\n\n\n\n33\ndescritores para diferenciar cultivares1 ou raças2 de uma mesma espécie. Contudo, o número de descritores morfológicos é reduzido em muitos deles corredores e dominância ou epistasia. Com isto, nem sempre se consegue distinguir o heterozigoto Aa do homozigoto AA. Tais limitações ficaram minimizadas com o advento dos marcadores moleculares. Basicamente, os marcadores moleculares podem ser agrupados em duas classes quanto à herança: os de herança simples ou de fácil resolução, como as isoenzimas, os polimorfismos de comprimento de fragmentos ou RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) e microsatélites (ver Avise, 1994; Ferreira e Grattapaglia, 1995) e os de herança complexa como os RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA) (dominantes), minisatélites e os polimorfismos de comprimento amplificado dos ou AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism).\n\nOs minisatélites podem detectar uma quantidade de alelos superior aos demais marcadores, mas sua herança é bastante complexa. Além disso a identificação de heterozigotos é bem mais simples com o uso de isoenzimas ou RFLP. Embora os RAPD apresentem vantagens sobre os demais marcadores moleculares, considerando-se custos, uso rotineiro, simplicidade e número de amostras analisadas, esses marcadores não têm reprodutibilidade diante de pequenas modificações de protocolo ou de condições de reação. Entretanto, sua frequência é um acesso que quase ilimitado ao genoma (Hillis e Moritz, 1990).\n\nA caracterização genética com marcadores possibilita a estimativa de vários índices genéticos e o conhecimento da organização e distribuição da variabilidade genética entre e dentro de populações. Em termos de melhoramento genético, a variabilidade está contida no gene pool, definido aqui como um conjunto de genótipos caracterizados pela similaridade de frequência e associação alélica, sendo que tais genótipos geralmente exibem um padrão geográfico de distribuição (Gepts e Bliss, 1985).\n\nO conhecimento da diversidade genética de uma espécie facilita a escolha de progenitores para os cruzamentos, os estudos de herança, a definição de estratégias adequadas de seleção, o mapeamento genético e a seleção assistida por marcadores. Todas as ações relacionadas com a conservação ge- né tica também dependem do conhecimento da diversidade genética e a forma como está organizada.\n\n\n\n6. CONSERVAÇÃO GENÉTICA\n\nUma das definições mais bem aceitas para conservação genética é o manejo da biosfera (formas vivas) para uso do homem no sentido de proporcionar o maior benefício sustentável para a presente geração e, ao mesmo tempo, mantendo o seu potencial para atender as necessidades e aspirações das gerações futuras (IUCN-UNEP-WWF, 1980). A conservação genética se constitui então num conjunto de ações coordenadamente executadas que culminam com a manutenção de um conjunto de indivíduos que representam a variabilidade genética de uma espécie. A rigor, a conservação genética se constitui numa atividade complexa, pois envolve a coleta, caracterização, preservação, restauração, distribuição e também melhoramento de germoplasma. Além de complexa, tem um custo elevado.\n\nExistem basicamente duas formas de conservação: in situ e ex situ. A conservação in situ é aquela onde as formas e tipos são conservados no habitat natural da espécie. Nesse caso, podem surgir novos variantes genéticos como também o desaparecimento de formas e tipos existentes por competição ou por acidentes naturais como fogo, tempestades, secas, inundações, vulcões e terremotos. Em outras palavras, nas áreas de preservação, as espécies sob conservação in situ estão sob os efeitos da evolução. No Brasil existe um grande número de áreas destinadas a conservação dos recursos genéticos como as estações ecológicas, reservas legais, florestas nacionais, parques nacionais e outras unidades de conservação. Contudo, pouco se tem feito em termos de caracterização genética de espécies nativas. Além disso, as ações implementadas são tímidas e pouco eficientes para impedir a erosão genética a longo prazo em várias dessas áreas.\n\nA conservação ex situ é aquela feita fora do habitat natural onde eu origem do material genético. Geralmente, para conservação ex situ atribui-se a conservação em bancos de germoplasma. Nessas, as condições ambientais (temperatura, umidade e luminosidade) são controladas, para que a longevidade das sementes seja a maior possível. No caso de multiplicação vegetativa, os explan- Capítulo 2 – Aspectos genéticos\n\n35\n\nnitários, que foram organizados pelos próprios agricultores, servindo de repositório das sementes crioulas das espécies que eles cultivam.\n\nNa maioria desses bancos de germoplasma são preservadas as mais variadas formas e tipos cultivados e ancestrais das espécies cultivadas de importância econômica. Na verdade, está se preservando uma amostra extraordinariamente pequena comparativamente ao número de espécies existentes na natureza. Por isto, a conservação de áreas com ocorrência de vegetação nativa é de crucial importância para a preservação da diversidade genética. Será nessas áreas que os melhoristas poderão coletar germoplasma para o melhoramento da maioria das espécies ainda não cultivadas, como é o caso da grande parte das espécies medicinais nativas do Brasil ou de espécies cujo valor farmacológico ainda não foi identificado.\n\n7. IDENTIFICAÇÃO VARIETAL\n\nComumente, os marcadores morfológicos são utilizados para discriminar espécies. Contudo, quando a morfologia é altamente semelhante, corre-se o risco de equívocos na classificação. Assim, a identificação da espinheira-santa (Maytenus ilicifolia Mart. ex Reissek, Celastraceae) via marcadores morfólogicos não é tão simples, uma vez que existem várias espécies do mesmo gênero Maytenus com morfologia semelhante. Além disso, a discriminação entre a espinheira-santa e as espécies conhecidas como mata-d'óio (Soroca bonplandii (W. C. Burger, Lanj. et Wess. Boer - Moraceae) e falsa-espinheira-santa (Zollernia ilicifolia (Brongn.) Vogel - Caesalpiniaceae) praticamente só pode ser feita in vivo desde que se tenha conhecimentos de botânica. Essa última possui estípulas, enquanto que a espinheira-santa não. Quando se destaca uma folha ou quebra-se um ramo de Soroca bonplandii ocorre a liberação de seiva na forma do látex; o mesmo não ocorre com Maytenus ilicifolia. Entretanto, se os tecidos foliares estiverem secos, as dificuldades de distinção entre essas espécies aumentam drasticamente, sendo impossível na maioria dos casos. Isto facilita a comercialização de várias espécies como sendo uma única. Quando isto ocorre, existem implicações tanto para o consumidor como para a indústria. No caso do consumidor, ele está sendo enganado. No caso da indústria farmacêutica, a qualidade do produto estará certamente comprometida.\n\nNos casos, em que a análise morfológica impossibilita a identificação das espécies, pode-se utilizar marcadores moleculares com o objetivo de identificar espécies ou variedades. Esse processo de obtenção de um padrão de bandas exclusivo para uma espécie ou variedade é denominado de fingerprinting. O fingerprinting equivale a impressão digital, que é específica para cada indivíduo. Fingerprints de Panax ginseng C. A. Mey. e Panax quinquefolium L. com base em RAPD são consistentes, independentemente do tecido e ida de planta. Os padrões eletroforéticos dessas espécies diferem entre si e também de outras espécies comercializadas como tal e consideradas como adulterações ou falsificações (Shaw e But, 1995).\n\n8. MELHORAMENTO GENÉTICO\n\nO melhoramento é a ciência e a arte da manipulação genética. É mais do que a aplicação da genética. O melhorista ainda necessita ter conhecimento dos tipos de genética quantitativa, biometria, genética molecular, evolução e da biologia da espécie com a qual trabalha. A primeira fase é a definição do problema e dos objetivos. Num segundo momento, o melhorista necessita coletar e manipular o germoplasma disponível para obter os recombinantes. Finalmente, a terceira etapa é a fase de teste do material obtido.\n\nOs métodos de melhoramento são basicamente dependentes da natureza da reprodução sexual. Algumas espécies são obrigatoriamente de fecundação cruzada ou alógama, como as dicotiledôneas, ex: Baccharis trimera (Less.) DC. (carqueja), Cannabis sativa L. (maconha) e Laurus nobilis L. (louro); preferencialmente alógamas como Zea mays L. (milho), Bromelia antiacantha Bertol. (caraguata), Cuphea carthagenensis (Jacq.) J. F. Macbr. (sete-sangrias), Lippia alba (Mill.) N.E. Br. (falsa-melissa), Taxus brevoifolia Nutt. (teixo), Trillium ushinoides (L.) L. (barba-de-velho), Wilbrandia ebracteata Cogn. (tuaíra); preferencialmente autógamas ou de auto-fecundação como Triticum aestivum L. (trigo), Glycine max (L.) Merr. (soja e/ou opção variável de polinização jericó), existindo ainda algumas espécies com grau variável de fecundação cruzada, dependendo das condições ambientais, como Phaseolus vulgaris L. (feijão) e Gossypium hirsutum L. (algodão).\n\nAs estratégias de melhoramento dependem fortemente do tipo de reprodução sexual apresentada pelas plantas. A razão deve-se ao fato de que uma população preferencialmente autógama apresenta uma grande quantidade de genes em heterozigose, os indivíduos são heterogêneos e geralmente apresentam vigor híbrido. Já as autógamas são virtualmente homozigotas e as progênies de uma planta são como clones: geneticamente idênticas. Plants geneticamente idênticas que são de autofecundação formam uma linha pura. Quando surge uma mutação, todos os descendentes dessa planta mutante carregam essa mutação, constituindo-se numa nova linha pura. Pode-se dizer então que uma população autógama é constituída de muitas linhas puras (Allard, 1960; Fehr, 1987). 37\n\n8.1. Melhoramento de plantas preferencialmente autógamas - ex.: trigo e soja\n\nAs diferentes linhagens puras de um banco de germoplasma são geneticamente diferentes e essas diferenças podem ser de um, dois ou muitos genes. Assim sendo, tais linhagens exibem um grau variável de similaridade, dependendo das diferenças genéticas acumuladas ao longo da evolução.\n\nGeralmente uma linha pura não apresenta todas as características desejadas. Essa linha pode ter uma arquitetura desejável, ser resistente a insetos, mas o teor de algum metabólito secundário é baixo. Se no germoplasma disponível ao melhorista existirem linhas (ou linhagens) puras com los valores desse metabólito, os alelos responsáveis pela característica podem ser transferidos através de vários retrocruzamentos. Contudo, se o melhorista necessita combinar duas ou mais características de uma linha pura com duas ou mais características existentes em outra linha pura, há a necessidade de utilização de outro método de seleção. Nesse caso, após o cruzamento entre as duas linhas puras, obtém-se o F1 que é autofecundado. Esse procedimento produz diferentes genótipos (ou combinações genéticas diferentes) e é igual a 3n, sendo n o número de locos em heterozigose na F1. Se a população F2 é suficientemente grande para proporcionar o aparecimento de todas as combinações genéticas, o melhorista poderá escolher aquela desejável. Como nessa geração ainda existe aproximadamente 50% de homozigo para cada gene, uma planta selecionada segregará diferentes progênias F3. O processo de seleção individual de plantas se repete até que o grau de homozigo seja bastante elevado (F3 ou F4) (Allard, 1960; Fehr, 1987). Posteriormente, essas. mais que,\nsão testadas para diversas características consideradas importantes.\n\nDurante a seleção, o melhorista leva em consideração não só a característica que está sendo melhorada, como o aumento do teor de um metabólito, mas também a quantidade de biomassa, a resistência a doenças e insetos, etc. Na verdade, quando se aplica um método de seleção, existe a possibilidade de obtenção de uma planta com uma associação alélica bem diferente daqueles já existentes na natureza. Ou seja, é possível, via cruzamentos e seleções. 38\nterogêneos dependendo da origem do pólen. Os ganhos genéticos são pequenos, pois a seleção é feita com base no fenótipo de um dos dois progenitores (Allard, 1960; Fehr, 1987). No entanto, o método é bastante simples e rápido, pois cada ciclo de seleção é feito num ano. Quando se colhe as sementes de uma planta alógama, sabe-se quem é a mãe, mas dificilmente se sabe quem é o pai, pois não se conhece a origem do pólen. As sementes serão, então, pelo menos meio irmãs.\n\nO método de seleção recorrente é mais eficiente, pois permite o controle dos dois progenitores, mas é mais demorado. Existem vários tipos de seleção recorrente. O mais simples deles consiste em duas etapas. Na primeira (1º ano), as plantas são selecionadas na segunda etapa (2º ano), é feito o teste de progênie com parte das sementes de cada uma das plantas selecionadas. Aquela que produz as melhores progênies continuará sendo selecionada, as outras serão descartadas. Assim, a outra parte também permanece sendo selecionada para iniciar o segundo ciclo de seleção. Neste 3º ano, após o entrecruzamento entre as progênies das melhores plantas selecionadas no ciclo anterior, haverá uma nova seleção ou re-seleção (Allard, 1960; Fehr, 1987). Na continuidade, é feito um novo teste de progênie. E assim por diante, até que exista variabilidade genética e o nível de endogamia não cause efeitos deletérios nos plantas.\n\n8.3. Plantas transgênicas\n\nAlém do melhoramento em si, feito no sentido de aumentar o teor de um produto específico naturalmente já codificado em uma espécie vegetal, as plantas podem ser utilizadas para produzir outras substâncias de interesse na saúde humana, se os genes adequados forem transferidos a elas. Os avanços obtidos com a biologia molecular permitem o isolamento de um gene numa espécie e sua transferência para uma planta. Assim, um gene de uma bactéria, vírus ou mesmo humano pode ser incorporado ao genoma de uma planta e essa expressar esse gene e produzir corretamente o produto gênico codificado. Dessa forma, vacinas e outros produtos farmacêuticos poderiam ser produzidos por plantas.\n\nPlantas transgênicas (ou organismos geneticamente modificados - OGM) são plantas que têm inserido em seu genoma uma sequência de DNA manipulada em laboratório por técnicas moleculares ou biotecnológicas. O DNA inserido pode ser da mesma ou de outra espécie. Tais técnicas, desenvolvidas a partir dos anos 70, possibilitam o corte e a ligação de fragmentos de DNA de uma forma altamente precisa. Particularmente, sequências de DNA (genes) podem ser removidas de um organismo, ligadas a sequências regulatórias e inseridas em outros organismos. A fonte desses genes pode ser qualquer organismo vivo (microorganismo, inseto, planta, animal) e o organismo recipiente, nesse caso específico, plantas cultivadas.