Aula sobre Genética Molecular e Replicação do DNA

UNIVERSIDADE FEDERAL DA GRANDE DOURADOS FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS Disciplina Genética na Agropecuária AULA 03 a 06 GENÉTICA MOLECULAR FUNÇÕES DO MATERIAL GENÉTICO Uma característica absolutamente essencial à continuidade da vida em nosso planeta é a capacidade que os sistemas vivos têm de fazer cópias de si mesmos Essa capacidade está tão intimamente associada ao material hereditário que em 1953 ao proporem um modelo para o DNA Watson e Crick já sugeriram um mecanismo para a replicação dessa molécula Desde então nossa compreensão do processo de replicação do DNA aumentou enormemente e hoje temos uma ideia detalhada de como a replicação acontece na intimidade das células e dos cromossomos Descobrimos que durante esse processo acontecem erros que quando não são corrigidos pelas polimerases se perpetuam na forma de mutações Biologia Molecular Texto 2 USP DÓGMA CENTRAL DA BIOLOGIA proteína substrato A enzima atua na conversão do substrato em pigmentos coloridos O gene está presente em todas as células da planta mas se manifesta apenas nas pétalas Transcrição Replicação Tradução REPLICAÇÃO DO DNA É o processo pelo qual uma molécula de DNA duplica dando origem a duas moléculas idênticas a molécula inicial REPLICAÇÃO DO DNA Quando ocorre Sempre que a célula for entrar em divisão celular Por que o DNA precisa ser replicado Para permitir que a informação que está contida no DNA seja passada de uma célula para outra Ao final da divisão celular cada célula filha deverá receber uma cópia da informação contida na célula mãe Onde ocorre No núcleo celular em uma fase que antecede a divisão celular fase S da interfase Como inicia Em procarionte inicia em um ponto do cromossomo circular denominado de origem de replicação ori Em eucariontes inicia em vários pontos do cromossomo ao mesmo tempo gerando várias pontos de origem de replicação replicons Nesses locais há uma sequência de bases que é reconhecida por enzimas proteínas e cofatores É demorada A replicação é extremamente rápida Em E coli são adicionados cerca de 850 nucleotídeossegundo 100 minutos para replicar todo o cromossoma Em eucariontes a duplicação é um pouco mais demorada 6 horas Qual o resultado final A formação de duas novas moléculas de DNA cada uma composta por uma fita nova e uma fita original replicação semiconservativa As fitas originais servem de molde e não sofrem alterações durante a replicação REPLICAÇÃO DO DNA Replicação de DNA de bacteria Autorradiografia de replicação procariótica em Ecoli A replicação em procariotes se inicia em um único ponto ori 245 pb e sequência rica em AT A replicação em eucariontes ocorre em vários pontos do cromossomo replicons Molécula original Fita original ou molde verde e fita filha vermelho 4 moléculas de DNA no segunda geração de replicação Replicação semiconservativa A síntese da nova fita de DNA ocorre sempre no sentido 5 3 Como as fitas moldes não são paralelas a replicação pode prosseguir continuamente em apenas uma das fitas de DNA fita de replicação continua leading strand Na fita de replicação descontínua laggind strand o DNA é formado em pequenos segmentos de 1000 a 2000 bases em procariontes e 100 a 200 bases em eucariontes Fragmentos de Okasaki Para começar a replicação é necessário um pequeno segmento de RNA denominado primer O primer é sintetizado pela PRIMASE Primer Fragmentos de Okasaki Replicação As proteínas SSB ligamse a fita molde e evitam que as fitas que foram separadas se liguem novamente A DNA girase ou topoisomerase se liga à frente da região da forquilha de replicação Realiza o corte de uma das fitas do DNA relaxandoa e enovelandoa negativamente evita o superenovelamento A helicase abre a molécula de DNA rompendo as pontes de hidrogênio e expondo as bases nitrogenadas Várias enzimas participam do processo de replicação do DNA A primase sintetiza uma molécula pequena de RNA denominada primer ou iniciador que é complementar à fita de DNA Este gera um estímulo químico para o reconhecimento da DNA polimerase DNA polimerase I a atividade da exonuclease remove o primer de RNA e substitui pelo DNA recém sintetizado DNA polimerase II tem a função de revisãoreparo Ela elimina os nucleotídeos adicionadas erroneamente DNA polimerase III é uma enzima que atua na síntese de DNA É responsável pela adição de novos nucleotídeos no sentido 5 3 Essa adição inicia na posição 3OH do primer tanto na fita contínua como na fita descontínua DNA ligase liga fita antiga com a fita nova de DNA e também une os fragmentos de Okasaki por meio de ligações fosfodiéster REPLICAÇÃO DO DNA Forquilha de replicação Proteínas SSB DNA polimerase III DNA polimerase III primer Primase síntese de primer DNA girase ou topoisomerase Forquilha de replicação Complemente em wwwdnareplicationnet REPLICAÇÃO DO DNA Qual a taxa de erro A atividade autocorretora das DNA polimerases é essencial para garantir a alta fidelidade de replicação do DNA e portanto a estabilidade genética no decorrer das gerações Um erro de incorporação de nucleotídeo que não seja corrigido pode produzir uma mutação Se não fosse o sistema auto corretor das polimerases a taxa de mutação seria muito maior pois a frequência com que são incorporados nucleotídeos errados é relativamente alta A transcrição é o processo de formação de uma fita de RNA complementar a uma região do DNA TRANSCRIÇÃO DO DNA Por que ocorre a transcrição Para levar a informação que está no núcleo para o citoplasma onde ocorre a síntese de proteínas Onde ocorre a transcrição Nos núcleos celulares em regiões chamadas genes Pode ocorre em 1 gene ou um grupo de genes ao mesmo tempo Como inicia a transcrição A RNA polimerase reconhece uma região que antecede o gene sítio promotor A enzima RNA polimerase também é responsável pela adição de nucleotídeos na fita de RNA que será formada E depois Os nucleotídeos continuam sendo adicionados sempre no sentido 5 para 3 e sempre de forma complementar a fita molde do DNA A cadeia transcrita é também chamada de cadeia molde ou antissenso A nova fita é chamado de senso Quando acaba Acaba quando o RNA polimerase encontra o ponto de terminação Qual o resultado da transcrição Uma molécula de RNA mensageiro mRNA TRANSCRIÇÃO DO DNA EM PROCARIONTES a molécula de DNA é transcrita em mRNA RNA mensageiro Ela será utilizada na síntese de proteína e depois será degradada Molécula de DNA Transcrição mRNA Fita molde ou antissenso Fita senso 3 3 5 5 Sitio promotor e RNA polimerase TRANSCRIÇÃO DO DNA EM EUCARIONTES a molécula de DNA transcrita passa por modificações e somente depois será considerada um mRNA Molécula de DNA Transcrição hnRNA Sitio promotor e RNA polimerase Fita molde ou antissenso Fita senso éxon éxon éxon íntron íntron O DNA de eucariontes possui segmentos que codificam aminoácidos éxons separados por regiões que não codificam íntrons 5 3 3 5 5 TRANSCRIÇÃO DO DNA EM EUCARIONTES a molécula de DNA é transcrita em hnRNA passa por processamento retirada dos íntrons adição de capacete 5GCH3 e cauda poli A3 Transcrição hnRNA éxon éxon éxon íntron íntron DNA Processamento do hnRNA retirada dos íntrons ligação dos éxons adição de 5GCH3 e 3poli A 3 5 3 5 3 5 mRNA AAA GCH3 3 5 TRANSCRIÇÃO DO DNA NÚCLEO 5 GCH3 AAAAAAAA 3 CITOPLASMA Facilita a ligação do mRNA aos ribossomos durante a síntese protéica mRNA associase a proteínas informossomo citoplasma Proteção contra enzimas com ação destrutiva mRNA Transcrição tem o objetivo formar um RNA mensageiro mRNA a partir de um gene situado no DNA O inicio da transcrição ocorre na região promotora Esta região antecede o gene e contém sequências de bases nitrogenadas conservadas A esta região se liga a helicase que rompe as pontes de H entre as bases nitrogenadas e a RNA polimerase e inicia transcrição RNA polimerase RNApol tem a função de realizar o pareamento complementar das bases nitrogenadas no sentido 5 3 REVISÃO TRANSCRIÇÃO Região promotora TATA box Início da gene e da transcrição das bases nitrogenadas Sequência 35 Sequência 10 RNA polimerase ligada às sequências de bases nitrogenadas 35 e 10 Em procariotos gene mRNA Em eucariotos o gene possui éxons codificam proteína e íntron não codificam proteína Como consequência é gerado o RNA heterogêneo nuclear hnRNA também chamado de pré RNA mensageiro que será processado e formará o mRNA Em eucariotos gene hnRNA pré mRNA processado mRNA O spliceossomo é o complexo enzimático formado por snRNPs snRNA proteínas que tem a função de realizar o processamento do hnRNA por meio da retirada dos íntrons splicing e união dos éxons A adição de uma guanina metilada na posição 5 5CH3 e de uma sequência de adeninas na posição 3 3 poli A também fazem parte do processamento do hnRNA REVISÃO TRANSCRIÇÃO mRNA AAA GCH3 3 5 REVISÃO TRANSCRIÇÃO Sugestão httpsyoutubeC6RviWBIKbY Fonte httpschgcomputationalbiowordpresscomkeytermsrnasplicing O conhecimento do código genético nos permite entender como o mRNA será traduzido PROPRIEDADES DO CÓDIGO GENÉTICO Hipótese DNA mRNA aminoácidos proteína A descoberta de que as proteínas são arranjos lineares de aminoácidos levou a hipótese de que a sequência dos aminoácidos na proteína seja especificada pela sucessão de nucleotídeos nos genes Estabelecida a relação entre os nucleotídeos e os aminoácidos propôsse um CÓDIGO GENÉTICO que possui as regras de leitura para formação das proteínas Síntese de polipeptídio cuja sequência de aminoácidos aa é determinada pela sequência de códon no mRNA Tradução do DNA síntese de proteína Onde ocorre No citoplasma O que precisa mRNA códons tRNAs anticódons e aminoácidos e ribossomo tRNA uma das extremidades do L corresponde ao local aonde se liga o aminoácido 5CCA 3 e a outra extremidade é o anticódon A enzima aminoaciltRNA sintetase cria um ambiente favorável para ativar o aminoácido e ligalo o tRNA correspondente Existe pelo menos 1 aminoaciltRNA sintetase para cada aminoácido tRNA carregado pelo seu aminoácido específico forma um aminoaciltRNA Tradução do DNA síntese de proteína aminoaciltRNA sintetase reconhecer o aminoácido e une ao tRNA Anticódon Local de ligação do aminoácido Os tRNAs são denominados em função do aminoácido que representam Por exemplo o tRNA contendo o anticódon da metionina é chamado tRNAMet Tradução do DNA síntese de proteína 5CAU3 Metionina Um tRNA quando está ligado a seu aminoácido é denominado aminoacil tRNA MettRNA Tradução do DNA síntese de proteína Ativação do aminoácido e carregamento dos tRNAs Aminoacil Aminoácido ATP Aminoacil tRNA aminoaciltRNA aminoaciltRNA sintetase H2O aminoaciltRNA sintetase aminoaciltRNA sintetase ATP tRNA aminoácido Pelo menos 1 aminoaciltRNA sintetase para cada aa Tradução do DNA síntese de proteína No mRNA o códon 5AUG3 indica o local onde iniciará a tradução O códon 5AUG3 é reconhecido pelo anticódon complementar 5CAU3 que está no tRNA e traz o aminoácido metionina Existem 2 tRNAs específicos para o aminoácido metionina Um é utilizado para INICIAR a tradução formilmetionina tRNA tRNAf em procariotos e a aminoaciltRNA de metionina iniciador tRNAini em eucariotos O outro é utilizado para inserir metionina em QUALQUER PONTO da cadeia metionina tRNA tRNAmet Todos os nucleotídeos anteriores ao códon 5AUG3 constituem a sequência líder e não são traduzidos Tradução do DNA síntese de proteína IMPORTANTE Ribossomo é formado de 2 subunidades uma menor 30S e outra maior 50S A subunidade menor é a primeira a se ligar ao mRNA Ribossomo possui sítios ativos Sítio P peptídeo entra somente o primeiro tRNAf ou tRNAi Sítio A aminoácido onde entram os outros tRNAs carregados com aminoácido Sítio E exit saída retirada dos tRNAs sem os aminoácidos 30S 50S Tradução do DNA síntese de proteína 1 Fase de iniciação Em procariontes a 5mRNA 30S formil metioninatRNAf b 5mRNA 30S formil metioninatRNAf 50S c Alguns fatores de iniciação participam do processo Sítio P Ribossomo Sítio A CUA tRNA UAC AUG 5 3 mRNA Anticódon Códon Complexo de iniciação 30S 50S UCU UAA Tradução do DNA síntese de proteína 2 Fase de elongação Em procariontes GAU CUA UAC AUG 5 3 UCU Ligação peptídica Peptidil tranferase O segundo tRNA entra no sítio A Sítios A e P ocupados os aminoácidos são unidos pela ligação peptídica Forma um dipeptídeo no sítio A O tRNAf descarregado do sítio P é transferido para o sitio E do ribossomo sendo em seguida liberado Sítio P Sítio A Ribossomo se movimento no sentido da tradução 53 do mRNA UAA Tradução do DNA síntese de proteína 2 Fase de elongação Em procariontes O ribossomo desloca 3 nucleotídeos para frente no sentido 53 O dipeptídeo sai do sítio A e vai para o P Entra o terceiro códon no sítio A e recebe o terceiro aminoacil tRNA Repetese o processo até o final da cadeia AGA GAU CUA 5 3 AUG UCU Sítio P Sítio A UAA Tradução do DNA síntese de proteína 3 Término 5 UAA3 5 UAG 3 5 UGA 3 Sítio A AGA 5 3 Não existem tRNAs com anticódons complementares a essa trincas AUG CUA UCU UAA O término da tradução ocorre quando no sítio A se encontra um dos códons de terminação Sítio P Fator de liberação é inserido pelo códons de terminação e desmonta o ribossomo finalizando a síntese proteica Tradução do DNA síntese de proteína A cadeia polipetídica se dissocia do tRNA o mRNA liberase do ribossomo o ribossomo dissocia as subunidades 3 Fase de terminação Sítio P Sítio A AGA GAU UAC 5 3 AUG CUA UCU UAA Polissomos vários ribossomos traduzindo 1 mRNA Regras do Código Genético 1 A unidade do código genético é constituída por 3 letras códon 2 O código tem ponto inicial 5AUG3 3 O código não é sobreposto lido a cada códon sem retornar 4 O código não tem vírgulas lido a cada códon sem pausar 5 O código é degenerado mesmo aminoácido é gerado por vários códons 6 O código não é ambíguo 1 aminoácido corresponde a 1 códon 7 O código tem ponto final 5UAA3 5UGA3 5UAG3 8 O código é universal Segunda base do códon Primeira base do códon Terceira base do códon 1 A unidade do código é constituída por 3 letras códons 41 42 16 aminoácidos diferentes 43 64 aminoácidos diferentes Como a informação escrita com 4 bases nitrogenadas A T C e G formaria 20 aminoácidos da proteína A informação trazida no mRNA é lida de três em três nucleotídeos O conjunto de 3 nucleotídeos no mRNA é chamado códon Um códon codifica um aminoácido com 1 nucleotídeo poderia ter apenas 4 aminoácidos diferentes cisteína valina 5 UGU GUG UGU GUG 3 metionina 5 ACU GCA 3 GCA alanina treonina ACU 2 O código tem ponto inicial 3 O código não é sobreposto cada 3 bases nitrogenadas especificam apenas 1 aminoácido 5 AUG 3 4 O código não tem virgulas não existem nucleotídeos separando os códons 5 O código é degenerado vários códons geram o mesmo aminoácido 5 UCU 3 5 UCG 3 5 AGC 3 serina 5 UCC 3 5 UCA 3 5 AGU 3 5 AUG 3 metionina 5 UGG 3 triptofano A degenerescência só não ocorre para dois aminoácidos 6 O código não é ambíguo 1 códon gera apenas 1 tipo de aminoácido 7 O código tem ponto final 5 UAA 5 UAG 5 UGA 3 3 3 Códons de terminação 8 O código é universal Os códons especificam os mesmo aminoácidos para todos os organismos permitindo a obtenção de organismos transgênicos As mutações geram variabilidade genética São alterações herdáveis que ocorrem durante a replicação do DNA A frequência de mutação é de aproximadamente 105 a 106 por loco por geração Importância é gerar matéria prima novos alelos variabilidade genética para que ocorra o processo evolutivo e o melhoramento genético Causas 1 Substituição de bases 2 Adição e deleção de bases Mutações do material genético Pq ocorre Devido a formas alternativas de bases nitrogenadas tautômeros que apresentam pareamento irregular durante a replicação do DNA Os tautômetros podem ser causadas por agentes mutagênicos naturais ou artificiais Ex adenina se liga à timina entretanto na forma tautomérica a adenina se liga a citosina Mutações do material genético Purina A G Purina A G Pirimidina CT Pirimidina C T TRANSIÇÃO Purina A G Pirimidina C T TRANSVERSÃO 1 Substituição de bases 1 Substituição de bases altera um único códon no DNA O códon mutante pode ou não provocar mudança de um aminoácido ao longo da cadeia polipeptídica possibilitando 3 situações Mutação silenciosa a substituição de bases não altera o aminoácido e consequentemente a proteína sintetizada Mutação de sentido errado modifica um aminoácido da cadeia polipeptídica e a proteína Mutação sem sentido acarreta no surgimento de um códon de terminação 3AGC5 serina 3AGG5 serina 3AGC5 serina 3AAC5 leucina 3AGC5 3ATC5 5UAG3 transcrição Códon de terminação 2 Adição ou deleção de bases Mutações do material genético Todos os códons a frente da mutação serão alterados Muda o quadro de leitura 5ATGCCTATCGCA3 fita senso 3TACGGATAGCGT5 fita antissenso ou molde 5ATGCCUAUCGCA3 mRNA Cadeia polipeptídica Met Pro Ile Ala 2 Adição ou deleção de bases Mutações do material genético 5ATGCCTATCGCA3 3TACGGATAGCGT5 5AUGCCUAUCGCA3 Met Pro Ile Ala 5ATGCACTATCGCA3 3TACGTGATAGCGT5 5AUGCACUAUCGCA3 Met His Tyr Arg Proteínas diferentes 2 Adição ou deleção de bases cont Mutações do material genético EXERCÍCIOS CAP 3 GENÉTICA NA AGROPECUÁRIA 4 O gene da ovoalbumina de galinha possui 8 éxons e 7 íntrons a Considerando que os éxons e íntrons estão numerados em ordem crescente da posição 5 para 3 esquematize a estrutura do hnRNA transcrito desse gene b Suponha que a cadeia polipeptídica codificado por esse gene possua 200 aa Sabendose que o primeiro aa é a lisina e que o gene possui 2016 nucleotídeos quantas bases constituem os íntrons bGene DNA fita dupla 201621008 fita simples no hnRNA Cadeia polipeptídica 600 aminoácidos x 3 nucleotídeos 3 nucleotídeos do ponto inicial 3 nucleotídeos do ponto final 606 Íntrons número de nucleotídeos no hnRNA número de nucleotídeos nos éxons 1008 606 402 a 5E1 I1 E2 I2 E3 I3 E4 I4 E5 I5 E6 I6 E7 I7 E8 3 5Uma cadeia da molécula de DNA contém a seguinte proporção de bases nitrogenadas 20 A 30 C 40 G e 10 T Quais são as proporções dessas mesmas bases esperadas na hélice dupla desse DNA DNA de hélice dupla AT CG Assim A 20 10 302 15 C 30 40 702 35 G 40 30 702 35 T 10 20 302 15 7Considere as 60 proteínas diferentes de uma espécie vegetal cada uma com tamanho médio de 120 aminoácidos Qual o número de nucleotídeos dos éxons relacionados com a síntese dessas proteínas Admita que o primeiro aminoácido de todas as proteínas não seja a metionina 1 proteína 120 aminoácidos consequentemente 120 x 3 nucleotídeos 360 3 nucleotídeos do ponto inicial 3 nucleotídeos do ponto final UAA ou UAG ou UGA 366 nucleotídeos éxons 60 proteínas 60 x 366 21960 nucleotídeos a Qual o número de aminoácidos dessa proteína b Qual o número de bases nitrogenadas do mRNA c Qual o número de tRNAs envolvidos na síntese de uma molécula d Para sintetizar cada cadeia polipeptídica quantos ribossomos são necessários a 1212 bases nitrogenadas 2 DNA fita dupla 606 bases no mRNA 606 bases nitrogenadas no mRNA3 nucleotídeos por códon 202 códons 202 1 códon terminal 201 aminoácidos b 202códons x 3 bases nitrogenadas por códon 606 bases nitrogenadas c 201 tRNA 1 tRNA por aminoácido d 1 Ribossomo 9Em um dos genes da soja que codifica para a antocianina existem 1212 bases nitrogenadas nos seus éxons Considerando que na cadeia polipeptídica codificada por esse gene o primeiro aminoácido é a metionina perguntase 10No sorgo um determinado alelo apresenta a seguinte sequência de bases A cadeia antissenso dessa molécula tem a timina como primeira base na posição 3 A partir desse alelo perguntase a Qual é a sequência de bases no mRNA b Qual o número de aminoácidos que farão parte da proteína codificada por esse alelo c Se forem sintetizadas 10 moléculas de proteína qual o número total de tRNA e de ribossomos que irão participar d Se forem sintetizadas 10 moléculas de proteína qual o número total de tRNA e de ribossomos que irão participar e Considerando a cadeia antissenso a partir da extremidade 5 se ocorrer a deleção da quinta base timina e a adição de uma citosina após a 18ª base qual será a sequência de aminoácidos na cadeia polipeptídica mutante a Qual é a sequência de bases no mRNA 5 AUGCACCGAAGAAUUCCACCACCACCACAAUAGA3 b Qual o número de aminoácidos que farão parte da proteína codificada por esse alelo 9 aminoácidos pois o ultimo códon UAG é o códon de terminação c Se forem sintetizadas 10 moléculas de proteína qual o número total de tRNA e de ribossomos que irão participar 10 x 10 100 tRNAs e 10 ribossomos dQual é a sequência de aminoácidos na proteína Meti His Arg Arg Ile Pro Pro Pro Pro Gln e Qual será a sequência de aminoácidosna cadeia polipeptídica mutante mRNA 3AUG CAC CGA AGA AUU CGC ACC ACC ACC ACA AUG A5 Meti His Arg Arg Ile Arg Tre Tre Tre Tre