Bioengenharia e Biotecnologia Aplicadas à Biomedicina

Prof Dr Alexandre Dias UNIDADE I Bioengenharia e Biotecnologia Aplicadas à Biomedicina O que é bioengenharia Engenharia aplicada à biologia melhoramento de processos e produtos biológicos O que é biotecnologia Utilização dos seres vivos para o desenvolvimento de processos e produtos de interesse econômico eou social Contextualização Fonte João Lúcio de Azevedo et al 2002 Abrange diferentes áreas do conhecimento interdisciplinaridade Geneticistas e biologistas moleculares Bioquímicos Microbiologistas Engenheiros químicos Economistas Etc História da biotecnologia Fonte adaptado de livrotexto Onde chegaremos Difícil prever Projeto genoma humano Clonagem Transgênicos PCR Anticorpos monoclonais Estrutura do DNA Genética vacinas e antibióticos Fermentação domesticação de plantas e animais Antiga Clássica Moderna Eventos Categorias Princípios da biotecnologia molecular e engenharia genética A engenharia genética Manipulação genômica Produção de insulina humana Incorporação de características Tecnologia do DNA recombinante Biotecnologia moderna Fonte adaptado de livrotexto Bactéria Cromossomo bacteriano Plasmídeo Um vetor como um plasmídeo é isolado O gene é inserido no plasmídeo DNA recombinado plasmídeo O DNA é clivado em fragmentos por uma enzima DNA contendo o gene de interesse O plasmídeo é incorporado por uma célula como a de uma bactéria Bactéria transformada As células com o gene de interesse são clonadas O objetivo pode ser a obtenção do produto proteico do gene Plasmídeo Ou O objetivo pode ser a produção de cópias do gene Produto proteico RNA As células produzem a proteína As proteínas desejadas são purificadas As cópias do gene são purificadas Um gene para resistência a uma peste é inserido em plantas Um gene altera bactérias de modo que elas possam fazer a limpeza de resíduos tóxicos O hormônio do crescimento humano é utilizado no tratamento de casos de deficiência do crescimento Amilase celulase e outras enzimas preparam os tecidos para a fabricação de roupas Gene de interesse 1 3 2 4 5 6A 6B 7 Enzimas de restrição Clonagem Animais e plantas transgênicos Vacinas Alguns elementos importantes da biotecnologia PCR Plasmídios recombinantes Célulastronco Técnicas moleculares Tesouras Moleculares Enzimas que cortam a molécula de DNA em locais específicos identificados por uma sequência de nucleotídeos que é reconhecida pela enzima Enzimas de restrição Tabela 1 Enzimas de restrição Enzima Bactéria cuja enzima é isolada Sequência reconhecida Tipo de extremidade gerada após clivagem BamHI Bacillus amyloliquefaciens 5 GGATCC 3 3 CCTAGG 5 Extremidades coesivas extensão 5 fosfato EcoRI Escherichia coli 5 GAATTC 3 3 CTTAAG 5 Extremidades coesivas extensão 5 fosfato HaeIII Haemophilus aegyptius 5 GGCC 3 3 CCGG 5 Extremidades cegas HindIII Haemophilus influenzae 5 AAGCTT 3 3 TTCGAA 5 Extremidades coesivas extensão 5 fosfato NotI Nocardia otitidiscaviarum 5 GCGGCCGC 3 3 CGCCGGCG 5 Extremidades coesivas extensão 5 fosfato PstI Providencia stuartii 5 CTGCAG 3 3 GACGTC 5 Extremidades coesivas extensão 3 hidroxila XhoI Xanthomonas holcicola 5 CTCGAG 3 3 GAGCTC 5 Extremidades coesivas extensão 5 fosfato Fonte adaptado de livrotexto P P P P P P P P OH S S S S S S S S S S S S S S S S P P P P P P P P HO T T T T T T A A A A A A C C G G P P P P P P OH S S S S S S T T T A A C A G S S P P HO P P P P P P HO S S S S S S T T A A A C T G P P OH S S Extremidade 5 fosfato Clivagem que resulta em extremidades coesivas Extremidade 3 hidroxila História bacteriófagos partículas virais que invadem e destroem bactérias Bactérias emprega enzimas para se defender dos bacteriófagos endonucleases Ferramenta para estudar e manipular o DNA e consequentemente para o desenvolvimento da engenharia genética e da biotecnologia Como funcionam as enzimas de restrição 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Fonte adaptado de livrotexto Mais de 3000 enzimas identificadas Cortam a molécula de DNA em sequênciasalvo fragmentação do DNA extremidades ligantes com outro DNA fragmentado com a mesma enzima DNA recombinante Ex EcoRI reconhece apenas a sequência GAATTC e atua sempre entre o G e o primeiro A O local do corte é conhecido como sítio alvo Cada bactéria possui geralmente uma enzima que reconhece uma sequência de DNA com 4 a 12 pares de bases Têm em sua maioria uma característica comum a de terem a mesma sequência de bases quando lidas nas duas fitas complementares Sequências de DNA fita dupla com essas características são chamadas palíndromos Enzimas de restrição Inserção dos sítios de restrição de uma dada enzima no fragmento de cDNA capaz de sintetizar a insulina Exemplo de aplicação das enzimas de restrição Fonte adaptado de livrotexto cDNA da insulina Porção do cDNA que não se anela no iniciador Produto da PCR Segmento do vetor Sítio múltiplo de clonagem cDNA da insulina DNA do vetor DNA do vetor Digestão e purificação do gel DNA do vetor DNA do vetor Ligação cDNA da insulina cDNA da insulina DNA do vetor DNA do vetor Digestão e purificação do gel Fonte adaptado de livrotexto Identificação de variantes no DNA de pacientes com doenças Fonte Adaptado de BHATTACHARYA D VAN MEIR EG A simple genotyping method to detect small CRISPRCas9 induced indels by agarose gel electrophoresis Sci Rep 9 4437 2019 P ex Doenças recessivas Diferenças alélicas Selvagem X Mutante Etc Adgrb3 WT Mutants M 3 17 45 32 11 10 19 2 28 29 37 39 47 34 bp 500 400 300 1 h migration 4 agarose gel 371 A enzima de restrição EcoRI reconhece e digere a sequência de DNA GAATTC Um dado fragmento de DNA ao ser tratado com a EcoRI foi clivado em três fragmentos menores de tamanhos distintos A partir dessas informações podemos dizer que a Existiam duas sequências GAATTC no fragmento original b A sequência GAATTC não é um palíndromo c Existiam três sequências GAATTC no fragmento original d A soma do tamanho dos fragmentos gerados é menor que o tamanho total do fragmento original e Existiam quatro sequências GAATTC no fragmento original Interatividade A enzima de restrição EcoRI reconhece e digere a sequência de DNA GAATTC Um dado fragmento de DNA ao ser tratado com a EcoRI foi clivado em três fragmentos menores de tamanhos distintos A partir dessas informações podemos dizer que a Existiam duas sequências GAATTC no fragmento original b A sequência GAATTC não é um palíndromo c Existiam três sequências GAATTC no fragmento original d A soma do tamanho dos fragmentos gerados é menor que o tamanho total do fragmento original e Existiam quatro sequências GAATTC no fragmento original Resposta Os transgênicos obtidos pela tecnologia de DNA recombinante em que se adiciona um gene de espécie diferente com o objetivo de transmitir uma característica específica OGM qualquer modificação no genoma do indivíduo também se incluem aqueles em que apenas se modifica o genoma do próprio organismo deleções ou transversões Clonagem produção de algo idêntico Conceitos clonagem OGM e transgênicos Vetores para clonagem plasmídeos bacteriófagos cosmídeos e cromossomos artificiais A TRANSFERÊNCIA DOS GENES A CÉLULAS VEGETAIS Agrobacterium tumefaciens Plasmídeo Ti Vetor para inserção de gene de interesse Fonte adaptado de livrotexto DNA cromossômico Célula doadora DNA cromossômico DNA cromossômico Plasmídeos Célula receptora DNA polimerase Duplicação celular Plasmídeo integrado epissomo Pilus Pilus Pilus Transferência do DNA Plasmídeo F Plasmídeo F Célula doadora antiga Nova célula doadora Integração do plasmídeo Duplicação celular 1 2 3 4 Plasmídeos Plasmídeos Cromossomo bacteriano Viral Protege o transgene da degradação por nucleases Conduz o transgene do citoplasma ao núcleo Não viral Fácil manipulação Baixa resposta imune Baixa toxicidade Muitas aplicações Baixa taxa de transfecção Métodos de transfecção vetores Inserindo o material genético exógeno na célula exemplos Microinjeção Biobalística Eletroporação Fonte adaptado de livrotexto Bactéria eletrocompetente Incubação Choque elétrico Recuperação Pulso de hélio Cano da arma Dissipação do hélio Protoplasto da célula vegetal Microprojéteis moléculas do DNA recombinante revestidas por ouro ou tungstênio Partículas de ouro ou tungstênio DNA Cano da arma Protoplastos Transfecção Desenvolvimento do novo vegetal contendo o DNA de interesse Regeneração da parede celular Três formas básicas de se produzir animais transgênicos 1 Microinjeção 2 Célulastronco embrionárias 3 Transferência nuclear Criando um produtoanimal transgênico Etapas para a construção de um transgênico Transformação por engenharia genética Regeneração mediante técnicas de cultura de tecidos Caracterização molecular e bioquímica Avaliação do valor agronômico Melhoramento mediante cruzamentos com linhagens de elite Obtenção de uma variedade transformada geneticamente Experimentos e testes de campo em pequena e grande escala Autorização da legislação local Liberação do cultivo para sua exploração comercial A tecnologia do DNA recombinante e o cotidiano Medicamentos obtidos pelo uso da biotecnologia Medicamento Metodologia de produção Aplicação Material biológico Antibióticos Fermentação Tratamento de infecções Penicillium notatum penicilina Streptomyces venezuelae cloranfenicol Streptomyces griseus estreptomicina entre outros Fatores de coagulação sanguínea Técnica do DNA recombinante Tratamento de hemofilia Células CHO Células do Ovário do Hamster Chinês Antitrombina Atryn foi o primeiro medicamento produzido utilizando animais geneticamente engenheirados aprovado pelo FDA Purificada do leite de animais transgênicos Utilizado em pacientes com alteração hereditária da produção de antitrombina Cabra transgênica Insulina Humulin foi o primeiro fármaco biotecnologicamente aprovado pelo FDA Técnica do DNA recombinante Tratamento do diabetes mellitus Escherichia coli Eritropoietina Procrit Epogen Eprex e NeoRecormon Técnica do DNA recombinante Tratamento de anemia decorrente de doenças renais crônicas infecções por HIV e câncer Células CHO Células do Ovário do Hamster Chinês IL2 Técnica do DNA recombinante Tratamento de câncer de células renais Escherichia coli Interferonα IntronA RoferonA e Actimmume Técnica do DNA recombinante Tratamento de sarcoma de Kaposi hepatites B e C câncer de células renais Escherichia coli e Pichia pastoris Interferonβ Avonex Rebif e Betaseron Técnica do DNA recombinante Tratamento de esclerose múltipla secundária progressiva Escherichia coli Alfadornase Pulmozyme Técnica do DNA recombinante Tratamento de fibrose cística Células CHO Células do Ovário do Hamster Chinês Ativador de plasminogênio Activase Técnica do DNA recombinante Dissolve coágulos sanguíneos que podem causar ataque cardíaco embolia pulmonar e derrame OKT3 primeiro anticorpo monoclonal a se tornar disponível para terapia em humanos Técnica do hibridoma Tratamento contra rejeição de órgãos transplantados Linfócito B e mieloma Fonte adaptado de livrotexto IFSP 2014 A raposa o lobo e o cão doméstico pertencem a espécies biológicas distintas entre si Suponha que o seguinte experimento tenha sido realizado com sucesso o núcleo de uma célula do corpo de um cão tenha sido transplantado para um óvulo anucleado de uma raposa e o embrião tenha sido implantado no útero de uma loba ocorrendo a gestação O animal será um clone que apresentará características genéticas a Da loba apenas b Da raposa apenas c Do cão apenas d Da mistura da raposa e da loba e Da mistura do cão e da raposa Interatividade IFSP 2014 A raposa o lobo e o cão doméstico pertencem a espécies biológicas distintas entre si Suponha que o seguinte experimento tenha sido realizado com sucesso o núcleo de uma célula do corpo de um cão tenha sido transplantado para um óvulo anucleado de uma raposa e o embrião tenha sido implantado no útero de uma loba ocorrendo a gestação O animal será um clone que apresentará características genéticas a Da loba apenas b Da raposa apenas c Do cão apenas d Da mistura da raposa e da loba e Da mistura do cão e da raposa Resposta O Sistema CRISPR Fonte 17 August 2012 Vol 337 Science wwwsciencemagorg CRISPR Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats Cas9 CRISPR associated Protein 9 CRISPRCas9 CRISPRs são classes de sequências de DNA repetitivos que agem em conjunto com os genes associados ao CRISPR para conferir imunidade bacteriana contra nucleotídeos invasores estrangeiros 2050 bp Descoberto em 1987 na Escherichia coli 2007 evidenciada a ação da CRISPRCas9 em Streptococcus thermophiles CRISPR Cas9crRNAtracrRNA Fonte Adaptado de Arq Bras Cardiol 2017 10818183 Exógeno Endógeno Reparo Cas9 Cas9 RNAguia crRNA TracrRNA Aplicações na cardiologia O Sistema CRISPRCas9 e a Possibilidade de Edição Genômica para a Cardiologia The CRISPRCas9 System and the Possibility of Genomic Edition for Cardiology Marcela Corso Arend 1 2 Jessica Olivaes Pereira 1 3 Melissa Medeiros Markoski1 Laboratório de Cardiologia Molecular e Celular Programa de PósGraduação em Ciências da Saúde Cardiologia Instituto de CardiologiaFundação Universitária de Cardiologia ICFUC1 Porto Alegre RS Universidade do Vale do Rio dos Sinos UNISINOS2 São Leopoldo RS Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre UFCPA3 Porto Alegre RS Brasil Método terapêutico tratamento de doenças In vivo e ex vivo Escolha do vetor Tamanho do gene Capacidade de transfecção Toxicidade do vetor Tempo da expressão do gene Célulaalvo Terapia gênica Métodos de recuperação do produto biotecnológico Fonte adaptado de livrotexto A B C A B A B Proteína alvo Precipitado Sobrenadante Cromatografia em camada delgada frente do solvente B A C origem aplicação da amostra Cromatografia em coluna solvente B A C Soro Fonte Eletrodos A α1 α2 β γ A edição genética é um assunto que causa muitas discussões no mundo atual em que se pode ouvir que é possível modificar uma parte específica do Ácido Desoxirribonucleico DNA ou até mesmo uma sequência com a edição baseada na técnica CRISPRCAS9 é possível remover aquilo que é indesejado ou até mesmo acrescentar e modificar aquilo que é desejado Sobre a técnica CRISPRCAS9 assinale a alternativa correta a A enzima CAS atua como uma tesoura molecular b O CRISPR é uma sequência repetitiva c O mecanismo atua na defesa da célula bacteriana d Essa ferramenta tem prospecção para ser utilizada para a terapia gênica no tratamento de doenças humanas e Todas as alternativas estão corretas Interatividade A edição genética é um assunto que causa muitas discussões no mundo atual em que se pode ouvir que é possível modificar uma parte específica do Ácido Desoxirribonucleico DNA ou até mesmo uma sequência com a edição baseada na técnica CRISPRCAS9 é possível remover aquilo que é indesejado ou até mesmo acrescentar e modificar aquilo que é desejado Sobre a técnica CRISPRCAS9 assinale a alternativa correta a A enzima CAS atua como uma tesoura molecular b O CRISPR é uma sequência repetitiva c O mecanismo atua na defesa da célula bacteriana d Essa ferramenta tem prospecção para ser utilizada para a terapia gênica no tratamento de doenças humanas e Todas as alternativas estão corretas Resposta Cultivo celular célulastronco Células aderentes e células não aderentes Uma cultura primária é estabelecida a partir do crescimento de células oriundas de um fragmento de tecido obtido por desagregação mecânica ou enzimática Fonte adaptado de livrotexto Células primárias Biópsia a partir do rim Seleção Células renais cultura primária A B Cultivo celular Cultura secundária p2 Tripsinização passagem das células de uma placa confluente para uma nova placa Cultura primária confluente Crescimento até atingir confluência Tripsinização Durante a tripsinização interações das células em cultura com a MEC com a placa e com outras células são desestabilizadas Assim partes delas podem ser transferidas para outra placa Cultura secundária confluente Cultura terciária p3 Ciclos de tripsinização finitos Crescimento até atingir confluência Cultura terciária confluente Depois de múltiplas passagens sequenciais a cultura entra em senescência Fonte adaptado de livrotexto Monocamada Invasão e metástase Fonte adaptado de livrotexto O crescimento das células normais é inibido pelo contato o que leva à formação da monocamada Várias camadas são formadas após proliferação de células tumorais em cultura A proliferação não é inibida pelo contato Normal Câncer Vaso linfático Tumor primário Êmbolo Vaso sanguíneo Células tumorais metastáticas Célula tumoral metastática Linfonodo Autorrenováveis possuem a capacidade de se dividirem indefinidamente originando novas célulastronco Clonogênicas capacidade de gerar uma réplica exata Potentes capacidade de se diferenciarem em um ou mais tipos celulares Célulastronco Trofoectoderma forma os anexos embrionários Blastocisto 4 dias pósfertilização Óvulo Espermatozoide Zigoto Totipotente Pluripotentes Massa celular interna forma todas as células do corpo Multipotentes Oligopotentes Unipotentes Endoderma forma os tratos digestivo e respiratório pâncreas e fígado Mesoderma forma músculos sangue vasos sanguíneos Ectoderma forma pele sistema nervoso e partes da face e pescoço 2ª semana pós fertilização Fonte adaptado de livrotexto Clonagem 1 Isolamento de células da ovelha 1 2 Remoção do núcleo do óvulo de ovelha 2 3 Transferência do núcleo da célula somática ovelha 1 para o óvulo anucleado ovelha 2 4 Os fatores citoplasmáticos do óvulo reprogramam o DNA 5 Implantação da célula originada da reprogramação em uma ovelha 3 6 Nascimento da Dolly 1 Isolamento de células somáticas do paciente 2 Remoção do núcleo do óvulo de uma doadora 3 Transferência do núcleo da célula somática para o óvulo anucleado 4 Os fatores citoplasmáticos do óvulo reprogramam o DNA 5 A estrutura começa a sofrer divisões celulares até chegar ao estágio de blastocisto 6 Isolamento das células da massa celular interna do blastocisto Fonte adaptado de livrotexto IPSCs Fonte adaptado de livrotexto 1 Isolamento de células do paciente fibroblastos 2 Tratamentos das células com fatores de reprogramação 3 Após algumas semanas são geradas iPSCs 4 Tratamentos das culturas com fatores que estimulam a diferenciação de uma variedade de tipos celulares Células sanguíneas Células intestinais Cardiomiócitos A construção do conceito de biossegurança teve seu início na década de 1970 quando a comunidade científica iniciou a discussão sobre os impactos da engenharia genética na sociedade Biossegurança Lei de Biossegurança 11105 24 de março de 2005 Art 1 Esta Lei estabelece normas de segurança e mecanismos de fiscalização sobre a construção o cultivo a produção a manipulação o transporte a transferência a importação a exportação o armazenamento a pesquisa a comercialização o consumo a liberação no meio ambiente e o descarte de organismos geneticamente modificados OGM e seus derivados Na entrada dos laboratórios deve ser anexada uma planta mostrando a localização e a natureza de produtos químicos e inflamáveis e produtos biológicos a qual poderá ser consultada pelo pessoal de emergência Essa planta deve ser confeccionada de comum acordo com o pessoal do laboratório e um profissional do serviço de emergência quando for aplicável CIENFUEGOS 2001 Biossegurança Na unidade I você aprendeu as técnicas do DNA recombinante e como manipular o DNA de qualquer organismo por meio das enzimas de restrição Além disso discutimos sobre os vetores de clonagem as variadas formas de introduzilos no hospedeiro bem como os diferentes mecanismos envolvidos na seleção da célula de interesse Também falamos sobre o CRISPR um sistema que ocorre naturalmente em bactérias e que se tornou uma ferramenta revolucionária de edição gênica Vimos ainda que tão importante quanto a produção de proteínas recombinantes é a sua purificação a qual pode ser realizada por diferentes métodos Em resumo A biologia das célulastronco foi outro assunto importante abordado nesta unidade Vimos que as célulastronco podem ser classificadas de acordo com o seu potencial de diferenciação Além das célulastronco naturalmente encontradas em adultos e tecidos embrionários já existem tecnologias que permitem gerar célulastronco de pluripotência induzida e as vantagens de seu uso também foram abordadas As ferramentas e as tecnologias citadas acima possibilitaram a clonagem nuclear e a geração de organismos geneticamente modificados que abrem diversas discussões e pontos relevantes que precisam ser considerados em termos éticos e de biossegurança Em resumo A pesquisa para o tratamento de doenças com a utilização de célulastronco apresenta resultados promissores e encorajadores para a medicina moderna Com grande capacidade proliferativa e de regeneração as célulastronco são classificadas como totipotentes pluripotenes multipotentes unipotentes e reprogramadas Marque a alternativa incorreta sobre as célulastronco a As células da massa celular interna do embrião blastocisto possuem característica de pluripotência b Para a manutenção celular os housekeeping genes são expressos em todas as células do organismo c As célulastronco possuem capacidade de responder a estímulos externos d O transplante autólogo de célulastronco é indicado para o tratamento de doenças genéticas e A medula óssea é uma das principais fontes de célulastronco adultas Interatividade A pesquisa para o tratamento de doenças com a utilização de célulastronco apresenta resultados promissores e encorajadores para a medicina moderna Com grande capacidade proliferativa e de regeneração as célulastronco são classificadas como totipotentes pluripotenes multipotentes unipotentes e reprogramadas Marque a alternativa incorreta sobre as célulastronco a As células da massa celular interna do embrião blastocisto possuem característica de pluripotência b Para a manutenção celular os housekeeping genes são expressos em todas as células do organismo c As célulastronco possuem capacidade de responder a estímulos externos d O transplante autólogo de célulastronco é indicado para o tratamento de doenças genéticas e A medula óssea é uma das principais fontes de célulastronco adultas Resposta ATÉ A PRÓXIMA