Biografia dos Professores e Colaboradores em Bioquímica Clínica

Autores Prof Enny Fernandes Silva Prof Alexandre Torchio Dias Prof Flávio Buratti Gonçalves Colaboradores Prof Juliano Rodrigo Guerreiro Prof Luiz Henrique Cruz de Mello Bioquímica Clínica Professores conteudistas Enny Fernandes Silva Alexandre Torchio Dias Flávio Buratti Gonçalves Enny Fernandes Silva Graduada em Ciências Biológicas modalidade médica pela Universidade Santo Amaro Unisa 1981 possui especialização em clonagem em Bacillus subtilis pelo Public Health Department of the City of New York 1982 mestrado em Bioquímica na área de Biologia Celular e Molecular 1989 e doutorado em Bioquímica na área de Biologia Celular e Molecular 2003 ambos pela Universidade de São Paulo USP Tem pósdoutorado na Faculdade de Medicina da USP com Dr Roger Chammas na área de adesão celular e foi chefe de Departamento da Engenharia Química da Fundação Armando Alvares Penteado Faap 19942000 Foi professora do Instituto de Pesquisa e Ensino em Saúde de São Paulo Ipessp na área de Bioquímica Básica e Clínica Atualmente é docente titular da Universidade Paulista Alexandre Torchio Dias Graduado em Ciências Biológicas modalidade médica bacharel em Biomedicina pela Universidade de Mogi das Cruzes UMC 2002 é especialista em Genética Médica e Citogenética pelo Instituto de Assistência Médica ao Servidor Público Estadual de São Paulo Iamspe 2004 especialista em Administração Hospitalar pelo IpesspUnicid 2011 e doutor em Ciências na área de Citogenômica pelo Programa de Patologia pela Faculdade de Mecidina da USP FMUSP 2015 Atualmente é docente titular da Universidade Paulista Flávio Buratti Gonçalves Biomédico graduado pela UMC 1996 especialista em Diagnóstico Laboratorial de Doenças Tropicais pela FMUSP mestre em Saúde Pública pela Faculdade de Saúde Pública da USP 2000 e doutor em Patologia Ambiental e Experimental pela UNIP 2017 Possui habilitação nas áreas de Análises Clínicas Microbiologia Imunologia Parasitologia e Saúde Pública Atualmente é docente titular da Universidade Paulista além de membro do Banco de Avaliadores BASis do Inep Todos os direitos reservados Nenhuma parte desta obra pode ser reproduzida ou transmitida por qualquer forma eou quaisquer meios eletrônico incluindo fotocópia e gravação ou arquivada em qualquer sistema ou banco de dados sem permissão escrita da Universidade Paulista Dados Internacionais de Catalogação na Publicação CIP S586b Silva Enny Fernandes Bioquímica Clínica Enny Fernandes Silva Alexandre Torchio Dias Flávio Buratti Gonçalves São Paulo Editora Sol 2022 184 p il Nota este volume está publicado nos Cadernos de Estudos e Pesquisas da UNIP Série Didática ISSN 15179230 1 Coleta 2 Avaliação 3 Marcadores I Silva Enny Fernandes II Dias Alexandre Torchio III Gonçalves Flávio Buratti IV Título CDU 616074 U51545 22 Prof Dr João Carlos Di Genio Reitor Profa Sandra Miessa Reitora em Exercício Profa Dra Marilia Ancona Lopez ViceReitora de Graduação Profa Dra Marina Ancona Lopez Soligo ViceReitora de PósGraduação e Pesquisa Profa Dra Claudia Meucci Andreatini ViceReitora de Administração Prof Dr Paschoal Laercio Armonia ViceReitor de Extensão Prof Fábio Romeu de Carvalho ViceReitor de Planejamento e Finanças Profa Melânia Dalla Torre ViceReitora de Unidades do Interior Unip Interativa Profa Elisabete Brihy Prof Marcelo Vannini Prof Dr Luiz Felipe Scabar Prof Ivan Daliberto Frugoli Material Didático Comissão editorial Profa Dra Christiane Mazur Doi Profa Dra Angélica L Carlini Profa Dra Ronilda Ribeiro Apoio Profa Cláudia Regina Baptista Profa Deise Alcantara Carreiro Projeto gráfico Prof Alexandre Ponzetto Revisão Vitor Andrade Ingrid Lourenço Sumário Bioquímica Clínica APRESENTAÇÃO 9 INTRODUÇÃO 9 Unidade I 1 FUNDAMENTOS BÁSICOS EM BIOQUÍMICA CLÍNICA E A COLETA DE MATERIAL BIOLÓGICO PARA OS ENSAIOS BIOQUÍMICOS 11 11 Tipos de amostras e contextualização préanalítica no laboratório de bioquímica 11 12 Coleta de sangue venoso a vácuo 15 13 Como separar e armazenar o soro 18 14 Recomendações do CLSI Clinical Laboratory Standards Institute para a sequência de tubos na coleta de sangue venoso a vácuo 19 2 PRINCIPAIS MÉTODOS ANALÍTICOS UTILIZADOS EM BIOQUÍMICA CLÍNICA 23 21 Reações colorimétricas e cinéticas com ou sem coenzimas em equipamentos semiautomatizados automatizados e manuais23 22 Fotometria 27 23 Quimioluminescência e eletroquimioluminescência 27 24 Ensaios imunoenzimáticos marcadores tumorais drogas terapêuticas e de abuso 29 241 Marcadores tumorais 30 242 Drogas terapêuticas ou de abuso 30 3 CONTROLE DE QUALIDADE EM BIOQUÍMICA CLÍNICA 44 31 Controles internos e externos no laboratório de bioquímica e boas práticas laboratoriais 45 311 Controle interno da qualidade 47 312 Controle externo da qualidade 47 32 Métodos estatísticos de controle 47 4 PERFIL BIOQUÍMICO RENAL E DOS FLUIDOS CORPORAIS 55 41 Estrutura microscópica dos rins e filtração renal 56 42 Biomarcadores hidroeletrolíticos sódio e potássio 58 43 Biomarcadores de função e lesão renal 58 431 Creatinina 59 432 Ureia 60 433 Ácido úrico 62 434 Microalbuminúria 62 44 Avaliação da função renal em termos laboratoriais 63 441 Secreção tubular e filtração glomerular 63 442 Equação de CockcroftGault 64 443 Equação MDRD modification of diet in renal disease 65 444 A equação CKDEPI chronic kidney disease epidemiology collaboration 66 445 Equação de Schwartz específica para crianças 66 446 Clearance de inulina 67 45 Marcadores séricos para monitoramento de doenças renais 67 46 O exame de urina tipo 1 aspectos fisicoquímicos 69 461 Exame de características físicas 69 462 Exame de características químicas 71 47 Líquidos cavitários 76 471 Análise bioquímica dos principais líquidos cavitários 77 Unidade II 5 PERFIS BIOQUÍMICOS HEPÁTICO E PANCREÁTICO 87 51 Perfil hepático 87 52 Sistema hepatobiliar as bilirrubinas e as doenças correlatas 91 53 Marcadores de função hepática 93 54 Avaliação do funcionamento do pâncreas endócrino e exócrino 98 55 Importância clínicolaboratorial das determinações enzimáticas da amilase e lipase fibrose cística pancreatite hipo e hiperglicemias 99 56 Metabolismo glicídico diabetes mellitus diabetes gestacional intolerância à glicose e hipoglicemias Determinações laboratoriais de testes de tolerância e sobrecarga frutosamina hemoglobina glicosilada e glicemia 106 57 Medicamentos que influenciam no funcionamento pancreático 116 6 PERFIL BIOQUÍMICO LIPÍDICO CARDÍACO E DE TRANSTORNOS MUSCULARES 117 61 O infarto agudo do miocárdio IAM 117 62 Vantagens e desvantagens dos testes bioquímicos 124 63 Dislipidemias aterosclerose e o IAM 125 64 Gasometria 132 641 Distúrbios do equilíbrio ácidobásico 134 7 PERFIL BIOQUÍMICO DAS ENFERMIDADES ÓSSEAS 137 71 Metabolismo dos íons cálcio fósforo e magnésio 137 711 Metabolismo do cálcio 137 712 Metabolismo do fósforo 140 713 Metabolismo do magnésio 142 72 Patologias mais comuns ligadas ao metabolismo de cálcio fósforo e magnésio 144 721 Osteoporose 144 722 Osteomalácia 145 723 Raquitismo 146 73 Marcadores bioquímicos de metabolismo ósseo atualmente em uso 147 731 Marcadores de reabsorção óssea 147 74 Perfil funcional tireodiano triiodotironina total e livre tetraiodotironina TSH e calcitonina 148 741 Patologias relacionadas com o funcionamento da tireoide 149 742 Perfil funcional das paratireoides e situações patológicas hipoparatireodismo e hiperparatireodismo 153 743 Medicamentos e alimentos que afetam o funcionamento da tireoide 155 8 MARCADORES TUMORAIS E A AVALIAÇÃO BIOQUÍMICA DE TUMORES 156 81 Vias de sinalização 158 82 Diagnóstico 159 821 Marcadores tumorais MT 159 9 APRESENTAÇÃO O assunto da presente disciplina corresponde a uma das principais áreas de atuação do profissional Com o maior quantitativo e menu de testes laboratoriais essa ciência permite uma visão integrada do paciente evidenciando doenças e confirmando suspeitas clínicas do médico assistente Dado tal cenário este livrotexto aborda as bases fundamentais da área desde a coleta de um material biológico até os critérios de qualidade laboratorial Aprofunda ainda os conhecimentos do metabolismo humano aplicado à clínica médica avaliandose os perfis hepáticos pancreáticos cardíacos lipídicos tireoidiano e ósseo além do metabolismo do ferro e os marcadores tumorais no contexto das doenças humanas como diabetes dislipidemias coronariopatias doenças autoimunes e câncer Por meio deste livrotexto o aluno poderá compreender melhor o funcionamento de diferentes órgãos e a fisiopatologia das doenças realizando a adequada interpretação clínica dos resultados dos exames laboratoriais bioquímicos e contribuindo dessa forma para o diagnóstico o prognóstico e mesmo a terapêutica dos nossos pacientes INTRODUÇÃO Podese dizer que a bioquímica estuda a química da vida Em cada célula existente há várias reações químicas de síntese anabolismo de degradação catabolismo ou intermediárias entre esses dois processos metabolismo Dessa forma o estudo do metabolismo pode explicar como está a saúde de uma célula A forma mais simples de entender o funcionamento celular é analisar as reações químicas por intermédio da quantificação de biomoléculas como enzimas que catalisam as reações metabólicas dos substratos e dos produtos Entre os materiais biológicos que podem ser analisados podemos citar o sangue a urina e o liquor já entre os analitos temos a glicose o colesterol e a ureia além de enzimas como transaminases no sangue Como sabemos o valor de referência de cada enzima podemos analisar sua hiperfunção ou hipofunção também chamada de biomarcador quantidade de substrato e de produto e por conseguinte da reação Avaliandose as reações particulares de cada órgão saberemos o que está ocorrendo com sua função principal chamandoas de perfil renal perfil cardíaco perfil hepático etc Exames de imagem como a tomografia ajudam o médico a interpretar o funcionamento do corpo sem a necessidade imediata de uma cirurgia no entanto os exames de bioquímica mostramse fundamentais para se chegar a um diagnóstico Além disso sabese que algumas doenças são silenciosas e por vezes os exames periódicos ou de checkup são os únicos que podem prevenir ou diagnosticar o início de um desenvolvimento danoso a fim de que o tratamento seja mais eficaz 10 No laboratório de análises clínicas temos testes de rotina e outros mais complexos como os que usam DNA RNA e hormônios colaborando com outros exames realizados em setores como hematologia microbiologia imunologia endocrinologia parasitologia e uroanálise Antigamente todos os procedimentos eram manuais mas hoje a maioria é automatizada Entretanto caso ocorra algum problema de manutenção no aparelho será imprescindível a participação do profissional do laboratório clínico Vale acrescentar ainda que aparelhos sofisticados sensíveis e técnicas avançadas ajudam a garantir a minimização de erros analíticos e a confiança nos resultados obtidos O livro foi organizado em duas unidades de forma que a unidade I apresenta um apanhado geral acerca da coleta de material biológico para as análises bioquímicas uma introdução dos principais métodos laboratoriais utilizados em diagnóstico bioquímico noções sobre controle de qualidade nos ensaios Também foi introduzido o conceito de perfis através do estudo das patologias associadas ao perfil renal urinário compreende de forma plena os marcadores de adoecimento métodos de diagnóstico Na unidade II damos sequência ao estudo dos perfis através da compreensão das principais patologias e dos métodos de diagnóstico de fígado pâncreas sistema cardíaco lipídico alterações musculares enfermidades ósseas e de tumores 11 BIOQUÍMICA CLÍNICA Unidade I 1 FUNDAMENTOS BÁSICOS EM BIOQUÍMICA CLÍNICA E A COLETA DE MATERIAL BIOLÓGICO PARA OS ENSAIOS BIOQUÍMICOS 11 Tipos de amostras e contextualização préanalítica no laboratório de bioquímica No contexto das análises clínicas a bioquímica clínica é um dos setores com uma das maiores demandas de exames a serem realizados rotineiramente No que tange aos materiais biológicos que podem ser utilizados para tais avaliações podemos destacar sangue total plasma soro liquor líquidos especiais sinovial pleural ascítico saliva urina sêmen Vejamos agora as características das principais amostras biológicas citadas e os principais cuidados na obtençãocoleta desse tipo de material mas não se esqueça de rever o conteúdo da disciplina sobre fluidos corporais ele será de grande valia para a bioquímica clínica O soro é obtido após a centrifugação do sangue coletado em tubo seco tubo de tampa vermelha com ativador de coágulo Devido à formação do coágulo o soro não contém os fatores da coagulação ou o fibrinogênio O plasma é obtido após a centrifugação do sangue coletado em tubo com anticoagulante seja ele EDTA citrato de sódio ou heparina A presença do anticoagulante inibe a formação do coágulo No plasma estão presentes os fatores da coagulação e o fibrinogênio 12 Unidade I Logo depois da coleta os tubos precisam ser homogeneizados delicadamente por inversão para que o anticoagulante se misture corretamente na amostra Idealmente as amostras sanguíneas normais precisam ser processadas em até 4 horas após a coleta e as anormais em até 1 hora O desafio do laboratório é saber se a amostra é adequada ou não ele deve indicar um protocolo que defina o tempo em que as amostras foram processadas o qual deve ser o mais rápido possível Habitualmente o processo de coagulação se completa em um intervalo de 30 a 60 minutos dependendo de fatores como o tipo de tubo utilizado e a temperatura ambiente de 22 C a 25 C Atualmente a incorporação de ativadores ou aceleradores da coagulação nos tubos permite um processo mais rápido ou seja em menor tempo e igualmente eficiente A estabilidade da amostra e o intervalo de tempo entre a coleta e a centrifugação dos tubos coletados são os fatores que determinarão se o material deverá ser rapidamente centrifugado na própria unidade central do laboratório A definição do tempo ideal desde o momento da coleta até a separação do soro ou plasma ainda é uma questão que divide opiniões na literatura no entanto de modo geral esse intervalo está entre 1 e 2 horas Vale lembrar que se deve evitar uma centrifugação prematura por exemplo para a obtenção de soro pois há a chance de haver a formação contínua de fibrina que pode obstruir o dispositivo de pipetagem probe do equipamento O liquor também conhecido como líquido cefalorraquidiano está localizado no cérebro e na medula e preenche os ventrículos cerebrais o espaço subaracnóideo craniano e raquidiano além do canal da medula Tem ainda a função de proteger o encéfalo e a medula espinal de impactos amortecer e distribuir substâncias nutritivas do encéfalo e da medula espinal O exame e a análise do liquor fornecem informações importantes em relação ao diagnóstico etiológico meningites encefalite e hemorragias e ao acompanhamento dos processos inflamatórios infecciosos e neoplásicos dos órgãos envolvidos por ele Esse exame compreende a análise dos aspectos físicos bioquímicos e citológicos e em geral todas essas análises são realizadas em laboratórios especializados normalmente hospitalares O líquido sinovial é encontrado nas cavidades articulares ombro cotovelo e joelho e tem como função lubrificar proteger transportar nutrientes e remover impurezas do espaço articular Há uma pequena quantidade de líquido nas articulações sintetizado pelas células sinoviais que estão localizadas na membrana sinovial É formado a partir do ultrafiltrado do plasma acrescido de uma substância chamada de ácido hialurônico proteína de alto peso molecular como fibrinogênio e globulinas responsáveis pela viscosidade glicose e ácido úrico A análise do líquido sinovial possibilita avaliar o estado da membrana sinovial determinar o grau de atividade inflamatória articular investigar a etiologia da doença como a artrite séptica e sinovite induzida por cristais além de verificar a presença de hemartrose e obter orientação para o tratamento A análise compreende as etapas de exame macroscópico no qual são analisados cor aspecto e viscosidade já o exame microscópico engloba a contagem total de hemácias e leucócitos a contagem diferencial de leucócitos e a pesquisa de cristais além da análise bioquímica na qual são dosadas as concentrações de glicose proteína ácido úrico e LDH 13 BIOQUÍMICA CLÍNICA O líquido pleural está localizado entre a pleura parietal e a pleura visceral dos pulmões e tem um volume normal de aproximadamente 30 mL Assim como todos os outros líquidos a formação do derrame pleural indica que houve alterações nas forças coloidosmótica e hidrostática modificando o equilíbrio e acarretando o acúmulo do líquido entre as membranas Várias causas estão relacionadas à formação do derrame pleural entre elas infecções bacterianas hemotórax tuberculose e neoplasias Vale destacar ainda que a diferenciação entre transudato e exsudato permite identificar se o processo patológico é local ou não A análise laboratorial é dividida em características gerais volume aspecto cor coágulo e densidade a análise química inclui as dosagens de proteínas glicose LDH e pH a análise microscópica inclui a contagem de leucócitos e a contagem diferencial e de hemácias a análise citológica por fim avalia a presença de células malignas O líquido peritoneal ou líquido ascítico é o líquido acumulado dentro da cavidade peritoneal Assim como todos os líquidos cavitários a causa para a sua formação costuma estar ligada ao desequilíbrio das forças entre vasos capilares e tecidos mas também pode estar relacionada a alguns distúrbios hepáticos como cirrose peritonite perfuração do apêndice e neoplasias A urina líquido orgânico que contém substâncias metabólicas a serem eliminadas tem sua formação nos rins sendo posteriormente coletada na bexiga e por fim expelida pela uretra Dentro da rotina clínica e laboratorial o exame de urina é um dos mais pedidos hoje independentemente da especialidade médica ou da condição do paciente fazendo dele um importante exame de triagem ou para uma condição já estabelecida Podemos encontrar vários sinônimos para o exame de urina de rotina como urina tipo I exame de urina sumário da urina urina simples análise físicoquímica da urina e do sedimento elementos anormais e sedimentoscopia EAS exame químico da urina EQU e pesquisa de elementos anormais e sedimento PEAS O mais utilizado na prática clínica parece ser o exame de urina de rotina A análise do líquido seminal ou espermograma é um exame que avalia a capacidade reprodutiva dos homens o funcionamento dos testículos e a saúde da próstata e da vesícula seminal auxiliando na investigação de uma possível infertilidade A conclusão sobre as informações da avaliação da saúde reprodutiva do homem só deve ser feita após a análise de no mínimo dois espermogramas pois existem alterações biológicas como febre e fatores externos como medicamentos e drogas que podem gerar discrepância nas análises Para Motta Corrêa Motta 2001 e Lopes 2003 a influência dos fatores de erros não analíticos está relacionada às condições que alteram o resultado dos testes mas que não estão ligadas ao problema pelo qual o exame foi solicitado As variações préanalíticas não fisiológicas podem estar relacionadas à coleta ao transporte e ao armazenamento das amostras Para evitar tais erros que acabam por levar a problemas na interpretação dos resultados os laboratórios clínicos devem definir claramente quais são as variáveis a serem avaliadas a fim de melhor atender a demanda de seus pacientes 14 Unidade I A fase préanalítica necessita de realizações e cuidados na detecção na classificação e na adoção de medidas para a redução das falhas Diversos processos préanalíticos devem ser cumpridos antes da análise das amostras Esses processos podem ser aprimorados pela disponibilização de instruções escritas ou verbais em linguagem simples e orientações quanto ao preparo e à coleta da amostra com o objetivo de facilitar o entendimento de tudo pelo paciente De forma simples listamos a seguir alguns importantes aspectos a serem observados objetivando a implementação de um sistema que garanta uma adequada obtenção de amostrascoleta de material biológico para a realização de quaisquer exames laboratoriais e em especial para a realização dos exames de bioquímica clínica Preparação do paciente transmitir de forma clara e objetiva as instruções necessárias à preparação correta do paciente antes da coleta quando exigido Exemplo coleta de urina de 24 horas jejum obrigatório de x horas restrição alimentar Coleta de material especificar o material a ser colhido sangue venoso arterial capilar plasma soro sangue total urina rotina urina de 24 horas etc Horário da coleta se aplicável informar o horário da coleta Identificação efetiva do paciente Identificação correta da amostra colhida Cuidados especiais na manipulação e no armazenamento da amostra biológica Registro da identidade do colhedor ou receptor da amostra Descarte seguro do material empregado na coleta Preenchimento correto do cadastro do paciente Após a chegada das amostras ao laboratório ocorre a fase de processamento e preocupação com a sua qualidade que tem o propósito de identificar prováveis distorções nos métodos analíticos a serem empregados e minimizar o risco de obtenção de resultados ilegítimos Algumas amostras serão rejeitadas por exibir interferentes como hemólise ou lipemia exigindo o pedido de nova coleta Outras serão aceitas ainda que haja alguma condição inadequada que deverá ser registrada no laudo para avaliação do resultado pelo clínico Amostras inapropriadamente identificadas não devem ser aceitas ou processadas exceto quando forem de complexa aquisição instáveis ou críticas como biópsias líquidos de derrame líquido cefalorraquidiano material coletado por punção de sítios profundos medula óssea entre outras Nesses casos para garantir a rastreabilidade o laboratório deve ter um processo para receber as 15 BIOQUÍMICA CLÍNICA amostras com o reconhecimento do encarregado pela coleta seja ela efetuada no laboratório ou por terceiros e oferecer os resultados para quando necessário corrigir a identificação com o uso de dados que autorizem rastrear esse processo Os parâmetros de aceitação e rejeição de amostras tal como a produção de análises em amostras com limitações são estabelecidos em procedimentos documentados Deve existir o registro adequado das amostras não conformes com os critérios de aceitação predefinidos O laboratório deve garantir que os testes realizados com amostras fora dos critérios ideais ou coletadas sem o devido preparo tenham essa condição apontada no laudo de maneira a aumentar as precauções para a explicação do resultado quando isso for apropriado Deve haver portanto registros que reconheçam o responsável pela permissão dos diagnósticos realizados em amostras com restrições ANDRIOLO et al 2010 Como já citado entre as inúmeras amostras biológicas que podem ser utilizadas para dosagens bioquímicas a amostra de sangue obtida por coleta venosa e o posterior fracionamento da amostra de sangue total em plasma ou em soro são indubitavelmente as mais utilizadas motivo pelo qual decidimos apresentar a seguir uma breve revisão dos procedimentos que envolvem a coleta de sangue venoso sobretudo pelo método a vácuo o mais utilizado no momento por suas vantagens técnicas e eficiência na obtenção de amostras com menor índice de hemólise Também apresentaremos a seguir um recordatório dos principais tubos utilizados na coleta de sangue venoso com os principais anticoagulantes e os mecanismos de ação e seus constituintes 12 Coleta de sangue venoso a vácuo A punção sanguínea pode ser executada pelo sistema a vácuo e por seringa e agulha Na primeira situação mais comum atualmente antes da técnica de coleta compete ao flebotomista checar o nome completo do paciente com o nome impresso nos tubos e fazer a higienização das mãos A coleta tem início com a preparação do material Logo após garrotear o braço a 4 cm acima do local escolhido para a coleta devese pedir ao paciente que feche a mão A técnica segue com a escolha da veia que deve ser apalpada com o dedo indicador Após realizar a assepsia espere secar e rosqueie a agulha no adaptador do sistema a vácuo Em seguida insira a agulha em uma angulação oblíqua de 30 com o bisel da agulha revertido para cima Coletamse todos os tubos no mesmo instante soltase o garrote e só depois retirase a agulha A fim de prevenir hematomas devese fazer a compressão com o algodão Para concluir é importante trocar o algodão por uma bandagem séptica A coleta de sangue com seringa e agulha é a técnica mais antiga para obter sangue venoso sendo também usada para aplicar medicamentos Essa técnica oferece risco para o profissional de saúde que além de manipular o sangue deve também descartálo Por isso por motivos de segurança a punção venosa feita com seringa e agulha deve ser dispensada Essas são as normas do manual CLSI 2008 do Clinical Laboratory Standards Institute CLSI antigo National Committee for Clinical Laboratory Standards NCCLS um roteiro de padronização que teve os direitos autorais em português adquiridos 16 Unidade I pela Anvisa No entanto na prática ainda ocorrem casos de coleta de sangue com seringa e agulha basicamente em pacientes pediátricos e geriátricos Quando a punção é processada com seringa e agulha o sangue deve correr para o interior da seringa sem que seja necessário realizar qualquer esforço para puxar o êmbolo da seringa Quando isso não ocorre o turbilhamento provocado pelo esforço causa modificações celulares Terminada a punção a agulha deve ser removida da seringa e o sangue passado aos tubos cumprindo a proporção de sangue e anticoagulante A seguir veja o passo a passo para a coleta de sangue a vácuo Verifique se a cabine da coleta está limpa e abastecida para iniciar as coletas Solicite ao paciente que diga seu nome completo para a confirmação do pedido médico e das etiquetas Confira e ordene todo o material a ser usado no paciente de acordo com o pedido médico tubos gaze torniquete etc Realize a identificação dos tubos em frente ao paciente Informe ao paciente a técnica a ser utilizada Abra o lacre da agulha de coleta múltipla de sangue a vácuo em frente ao paciente Rosqueie a agulha no adaptador do sistema a vácuo Higienize as mãos Coloque as luvas Posicione o braço do paciente inclinado para baixo na altura do ombro Insira o primeiro tubo a vácuo Quando o sangue começar a fluir para dentro do tubo desgarroteie o braço do paciente e peça a ele que abra a mão Realize a troca dos tubos sucessivamente Procure homogeneizar o tubo imediatamente após a retirada de cada um invertendoo suavemente de 5 a 10 vezes conforme recomendado pelo fabricante dos tubos Após a retirada do último tubo retire a agulha e faça a compressão no local da punção com algodão ou gaze seca 17 BIOQUÍMICA CLÍNICA Exerça pressão no local em geral de 1 a 2 minutos evitando a formação de hematomas e sangramentos Se o paciente estiver em condições de fazêlo orienteo adequadamente para que faça pressão até que o orifício da punção pare de sangrar Descarte a agulha imediatamente após a remoção do braço do paciente em recipiente para materiais perfurocortantes Faça um curativo oclusivo no local da punção Oriente o paciente para que não dobre o braço não carregue peso ou bolsa a tiracolo no mesmo lado da punção por no mínimo 1 hora e não mantenha a manga da roupa dobrada o que poderia funcionar como um torniquete Verifique se há alguma pendência fornecendo orientações adicionais ao paciente se necessário Certifiquese das condições gerais do paciente perguntando se está em condições de locomoverse sozinho Entregue o comprovante de coleta com a data provável do resultado e libere o paciente Coloque as amostras em local adequado ou as encaminhe imediatamente para o processamento em casos indicados como materiais que necessitam ser mantidos em gelo de acordo com o procedimento operacional do laboratório Um dos problemas que podem prejudicar a coleta tanto de tubo a vácuo quanto de seringa é o colabamento da veia devido à inserção incorreta da agulha ou à posição incorreta do bisel na ponta da agulha há uma abertura oblíqua em aresta ou quina um chanfro ou chanfradura O bisel pode aderir à parede superior ou inferior da veia impedindo que o sangue flua e gerando o colabamento A agulha pode ser inserida além da veia ou pode ser parcialmente inserida provocando o extravasamento de sangue no tecido ou o deslizamento da veia quando a agulha escorrega para o lado e não penetra na veia No caso de colabamento da veia puncionada aconselhase virar lenta e cautelosamente a agulha para que o bisel fique desobstruído Em caso de colabamento venoso remova ou afrouxe o torniquete para liberar o restabelecimento da circulação Em seguida retroceda um pouco a agulha para que o fluxo sanguíneo seja desobstruído Não são aconselháveis os movimentos de busca aleatória da veia pois podem ser dolorosos e gerar perfurações arteriais acarretando em hematoma pressão do nervo ou lesão direta do nervo Se o tubo usado falhar por qualquer defeito por exemplo por falta de vácuo procure coletar o material com outro tubo Não é aconselhável que o mesmo flebotomista tente mais de uma vez uma venopunção Se possível outra pessoa deve ser solicitada para completar a coleta no paciente ou o médico deve ser informado ANDRIOLO et al 2010 Segundo a Organização Mundial da Saúde OMS 2008 os hematomas são o derramamento de sangue abaixo da pele e têm incidência de 2 a 3 em uma coleta de sangue sendo as causas mais comuns de ocorrência venopuntura imperfeita ou gorada punção da pele em ângulo muito grande e saindo da veia dupla punção da veia com agulha durante a doação e pressão insuficiente após a doação 18 Unidade I Observação Se você sofrer uma picada com agulha ou outro ferimento a partir de material cortante ou ainda se seus olhos nariz boca ou pele lesionados forem expostos lave imediatamente a área com água limpe a pele com sabão antisséptico e água relate o acidente imediatamente ao supervisor funcionário de controle de risco ou outra pessoa indicada e procure orientação médica Qualquer lesão cutânea deve ser imediatamente lavada Os tipos de amostras sanguíneas colhidas para análise são o soro que é a parte líquida do sangue obtido quando coletado em tubo sem aditivo após a centrifugação e o plasma que é a parte líquida do sangue adquirido quando coletado em tubo com anticoagulante e após a centrifugação Na amostra de sangue total o sangue mantém suas propriedades próximas à normalidade alcançado quando coletado em tubo com anticoagulante e não sofre o processo de centrifugação Conforme a análise o exame poderá ser feito no sangue total exemplo hemograma no plasma exemplo glicose e provas de coagulação e no soro exemplo bioquímicos e sorológicos Quando a análise for efetuada no soro este será obtido por meio da coleta em tubo sem anticoagulante seco para que aconteça o processo de coagulação Quando se planeja fazer a análise no plasma a amostra deverá ser obtida em tubo de ensaio incluindo um anticoagulante específico Dessa forma não ocorre a coagulação pois o anticoagulante atrapalha um dos fatores da coagulação geralmente o cálcio dificultando a formação do coágulo As amostras devem ser identificadas com o nome completo do paciente seu local de origem o exame a ser realizado e a data da coleta Deve ser enviada uma amostra para cada exame a ser realizado com volume adequado de forma a possibilitar o manuseio da amostra dentro do laboratório e as amostras devem estar associadas de acordo com cada setor de processamento biologia molecular sorologia microbiologia bioquímica etc 13 Como separar e armazenar o soro Após a retração do coágulo o soro pode ser separado de duas maneiras espontânea ou mecanicamente Para realizar a separação espontânea siga os seguintes passos aspire e transfira cuidadosamente o soro para um tubo limpo previamente identificado use uma pipeta Pasteur ou automática cuidado para não tocar no coágulo a fim de que as células não se misturem com o soro 19 BIOQUÍMICA CLÍNICA guarde em geladeira por no máximo 72 horas ou em congelador a 20 C até o envio ao laboratório Para realizar a separação mecânica os passos necessários são centrifugue o sangue por 10 minutos a 1500 rpm retire o tubo após a completa parada da centrífuga aspire transfira cuidadosamente e guarde o soro até o envio ao laboratório conforme descrito na separação espontânea 14 Recomendações do CLSI Clinical Laboratory Standards Institute para a sequência de tubos na coleta de sangue venoso a vácuo Por muito tempo os tubos de vidro foram o padrão para retirar amostras de sangue nos laboratórios clínicos Porém devido ao aumento do interesse pela segurança dos profissionais dos laboratórios além da necessidade de simplificar a eliminação de resíduos biológicos novos tubos de plástico foram desenvolvidos Os tubos de plástico possuem algumas vantagens em relação aos de vidro como maior resistência a altas velocidades de centrifugação menor criação de resíduos sólidos após a incineração e maior flexibilidade para uso em laboratórios automatizados e com manipulação de amostras por meio de sistemas robotizados A sugestão para a sequência dos tubos durante a coleta é respaldada no CLSI H3A6 2008 e deve ser reconhecida para que não ocorra a contaminação cruzada dos anticoagulantes quando há coleta de vários analitos no mesmo indivíduo Vale acrescentar que a mudança na sequência de tubos pode causar a contaminação por aditivos no tubo seguinte e produzir resultados alterados nos analitos significativos nesse tipo de interferência A ordem de coleta do CLSI foi a princípio alterada considerando a coleta em tubos plásticos pois os tubos plásticos para soro tampa vermelha ou amarela com gel separador incluem o ativador de coágulo podendo causar variação nos resultados dos testes de coagulação Em relação a esse elemento esses tubos devem ser colhidos após o tubo para coagulação tampa azul Observe a sequência de coleta para tubos plásticos pelo CLSI H3A6 2008 1 Frascos para hemocultura 2 Tubos com citrato de sódio tampa azul 3 Tubos para soro com ativador de coágulo com ou sem gel separador para a obtenção de soro tampa amarela eou vermelha 4 Tubos com heparina tampa verde 20 Unidade I 5 Tubos com ácido etilenodiaminotetracético EDTA tampa roxa 6 Tubos com fluoretoEDTA tampa cinza Tubos de vidro Tubo seco Tubo citrato Tubo VHS Tubo seco Tubo gel Tubo heparina sódica Tubo EDTA K2K3 Tubo fluoreto com EDTA K2K3 Tubo VHS Tubo citrato Tubos de plástico Figura 1 Ordem de coleta Os anticoagulantes apresentam como principal característica serem desproteinizantes e ao mesmo tempo estabilizantes da amostra Podemos distinguir os seguintes tipos de anticoagulantes EDTA anticoagulante que age em conjunto com o cálcio Indicado para exames ligados à área de hematologia e tipagem sanguínea Sua função é exercer a preservação de plaquetas Frasco com tampa roxa Citratos anticoagulantes que agem em conjunto com o cálcio mas de forma diferente do EDTA São utilizados nos exames de coagulação Frasco com tampa azul Fluoretos anticoagulantes que atuam em conjunto com o íon cálcio sua utilização se destina ao exame de glicemia por ser um inibidor enzimático mantendo a glicose Frasco com tampa cinza Heparina anticoagulante produzido pelo fígado que age diretamente na proteína trombina impedindo a formulação da fibrina Utilizado em exames de gasometria hematologia e imunologia Não é indicado para teste de coagulação fosfatos e esfregaços para hemograma Frasco com tampa verde 21 BIOQUÍMICA CLÍNICA Segundo o CLSI 2008 todos os tubos precisam ser homogeneizados por inversão e o número de inversões pode mudar de acordo com o fabricante Não se deve homogeneizar tubos de citrato fortemente devido ao risco de ativação plaquetária e distorção nos testes de coagulação Lembrete Os profissionais precisam saber não só o que acontece se as medidas corretas não forem seguidas mas também quais erros podem ocorrer que efeito pode haver sobre a amostra e principalmente sobre o paciente Observação A temperatura ambiente em laboratórios clínicos deve estar entre 20 C e 26 C para manter a estabilidade das reações sorológicas e a confiabilidade dos resultados Importante reforçar que além de todos os cuidados já apontados para uma coleta eficiente a qual representará a certeza de um exame bem realizado com laudo adequado devemos estar atentos também para questões que envolvem a possibilidade de lipemia e de hemólise das amostras situações que podem indubitavelmente trazer complicações para a realização dos exames e para a interpretação dos laudos No contexto da bioquímica clínica hemólise significa o rompimento da membrana da hemácia ocasionando a liberação da hemoglobina e de outros elementos internos no líquido circundante Ela pode ser criada in vivo eou in vitro Enquanto a hemólise in vivo lembra uma situação clínicopatológica a in vitro confirma erros na técnica de coleta processamento transporte ou armazenamento da amostra como o uso prolongado do torniquete o uso do sistema de coleta a vácuo e o transporte do sangue da seringa para o tubo sem remover a agulha Embora as tecnologias de automação auxiliem na resolução de problemas relacionados à amostra como sensores de coágulo e leitura de lipemia ou hemólise a existência do coágulo prejudica o equipamento causando obstrução no sistema Por sua vez a hemólise intensa também pode elevar a dosagem de hemoglobina e reduzir o número de hemácias com concentração de hemoglobina corpuscular média CHCM aumentado O termo lipemia por sua vez está ligado a uma série de ocorrências metabólicas referentes ao acúmulo de lipoproteínas LP ricas em triglicérides TG quilomícrons Qm e seus remanescentes lipoproteína de muito baixa densidade VLDL e seus resíduos verificada após a ingestão de gorduras Depois de uma refeição gordurosa o pico de quilomícrons é atingido normalmente entre 3 e 6 horas e após o período de 12 horas esses elementos não são mais detectáveis em pessoas normais A existência de lipemia no sangue interfere na dosagem de hemoglobina fornecendo resultados de CHCM falsamente aumentados por exemplo 22 Unidade I Saiba mais Para aprofundar o estudo sobre hemólise e lipemia acesse os textos indicados a seguir BRASIL Ministério da Saúde Gestão da fase préanalítica minimizando erros Laboratório de Hemostasia Brasília 2015 Disponível em httpsbitly3cOIECE Acesso em 18 jun 2021 ANDRIOLO A et al Gestão da fase préanalítica recomendações da Sociedade Brasileira de Patologia ClínicaMedicina Laboratorial para Coleta de Sangue Venoso Barueri Manole 2010 Outro aspecto importante para a realização dos exames bioquímicos é o jejum A maior parte das coletas para exames de sangue pode ser realizada com 3 horas sem consumir alimentos e em alguns casos até mesmo sem a obrigação de jejum O clássico período de 12 horas foi estabelecido com origem no tempo máximo que uma pessoa em situações normais gasta para metabolizar todo o alimento absorvido na última refeição todos os valores de referência dos exames foram determinados com base em um grupo de pessoas nessa circunstância de jejum Porém devido ao metabolismo diferente de cada pessoa nos dias de hoje a maioria dos exames pede até 3 horas de jejum Em alguns casos especiais o médico pode pedir exames com um intervalo de 2 horas desde a última refeição são os exames identificados como em estado pósprandial Nessa situação o médico faz a solicitação por escrito Para a porção de glicose para diagnóstico de diabetes o menor tempo ainda é de 8 horas e para colesterol ainda são necessárias 12 horas O jejum fixado para o perfil lipídico é de 12 a 14 horas em razão da dosagem de triglicérides Ainda assim para todos os exames mantémse a regra de não ultrapassar 14 horas de jejum A Sociedade Brasileira de Patologia ClínicaMedicina Laboratorial SBPCML entende que apesar de exames com e sem jejum apresentarem diferenças é possível interpretar e avaliar o risco de evolução de doenças ateroscleróticas como infarto e AVC a partir de resultados obtidos sem o jejum Mas isso com a condição de que os laudos de exames contenham o tempo de jejum do paciente e que os valores de referência sejam readequados ANDRIOLO et al 2010 Estudos recentes mostram que é possível fazer a avaliação do perfil lipídico sem o jejum com a vantagem de refletir as condições fisiológicas do dia a dia e de evitar o desconforto e possíveis complicações do jejum prolongado Além disso há um consenso europeu que afirma que as pequenas variações observadas entre dosagens com e sem jejum para definição de valores de risco cardíaco poderiam ser corrigidas se fossem estabelecidos novos valores referenciais A dosagem com jejum prolongado seria necessária somente quando o nível de triglicérides fora do estado de jejum estivesse acima de 440 mgdL 23 BIOQUÍMICA CLÍNICA No quadro a seguir são dadas as recomendações para a coleta do perfil lipídico com e sem jejum Quadro 1 Recomendações para realização de perfil lipídico com e sem jejum Sem jejum Na maioria dos pacientes incluindo Avaliação inicial do perfil lipídico Avaliação de risco cardíaco Paciente com internação por síndrome coronária aguda Crianças Se solicitado pelo paciente Pacientes diabéticos Idosos Pacientes em terapêutica estável Com jejum Indicada em Triglicérides sem jejum 440 mgdL Avaliação de especialista em paciente com hipertrigliceridemia conhecida Pacientes com pancreatite por hipertrigliceridemia Início de uso de medicações que cursam com hipertrigliceridemia severa Quando acompanhado de outros exames que necessitem de jejum Adaptado de Nordestgaard et al 2016 Observação A coleta de amostras de sangue para testes sorológicos deve ser realizada preferencialmente com o paciente em jejum Nos testes sorológicos para infecções sexualmente transmissíveis ISTs e Aids o fato de o paciente não estar em jejum não impede a coleta a menos que ele tenha ingerido alimentos gordurosos nas últimas 3 horas 2 PRINCIPAIS MÉTODOS ANALÍTICOS UTILIZADOS EM BIOQUÍMICA CLÍNICA No laboratório clínico o conhecimento das diferentes metodologias fazse necessário para compreender as diversas situações no dia a dia do laboratório clínico bem como a tomada de decisões em casos de eventuais problemas 21 Reações colorimétricas e cinéticas com ou sem coenzimas em equipamentos semiautomatizados automatizados e manuais Nas reações colorimétricas o produto formado tem uma cor e a intensidade dessa cor pode ser medida através de leitura de uma faixa específica do espectro Esse tipo de reação colorimétrica é 24 Unidade I amplamente utilizado com as metodologias cinéticas ou seja aquelas que envolvem a velocidade da formação de um produto em um dado intervalo de tempo Uma molécula orgânica que se liga a uma enzima para ativar a reação química é chamada de coenzima As coenzimas podem ou não ser utilizadas como substratos nas reações químicas utilizadas nas técnicas laboratoriais Elas podem ser adicionadas aos testes para favorecer o aumento da velocidade por exemplo em uma reação do tipo cinética com a consequente diminuição do tempo Os equipamentos laboratoriais vêm ao longo do tempo evoluindo e diminuindo a necessidade de uma prévia manipulação das amostras contudo além das formas automatizadas para a realização dos exames existem as formas semiautomatizadas e as manuais Sabese que a luz consiste em uma onda eletromagnética que possui um comprimento incluído em um determinado intervalo que vai da luz ultravioleta UV até a luz infravermelha IV No entanto o olho humano é capaz de visualizar um intervalo menor da luz sendo suas faixas extremas não identificáveis pelos olhos humanos Vale ressaltar que a luz branca é formada pela união de todas as cores contidas nessa faixa UVIV cores que podem ser vistas quando um feixe de luz branca incide sobre um prisma elemento poliédrico capaz de refratar a luz conforme visto a seguir Figura 2 Prisma óptico refratando a luz branca e expandindo o espectro de luz que abrange do infravermelho até o ultravioleta Disponível em httpsbitly3vQbxVL Acesso em 18 jun 2021 As análises colorimétricas consistem em uma metodologia química analítica que mensura a intensidade de luz emitida por determinado reagente indicando a concentração de determinada molécula ou partícula ou seja o reagente somado à molécula tornase colorido e essa intensidade de cor é capturada pelo equipamento o espectrofotômetro 25 BIOQUÍMICA CLÍNICA Leitor Fonte de entrada Fenda de saída Monocromador Fonte de luz Cubeta contendo amostra Leitor Prisma Figura 3 Princípio de funcionamento do espectrofotômetro O mecanismo de funcionamento desse equipamento baseiase na absorção absorbância I0 e transmissão transmitância I da luz emitida em determinada solução Dependendo da concentração de moléculas soluto na solução a luz será mais ou menos absorvida tendo seu comprimento de onda modificado em nanômetros nm 100 transmitância 0 absorbância 0 transmitância 100 absorbância Figura 4 Relação de valores entre absorbância e transmitância Para que a leitura seja possível é necessária a presença de um reagente específico para interagir com a molécula que se está avaliando Por exemplo se o objetivo da análise for avaliar a concentração de glicose no soro de uma pessoa será necessário o uso de um reagente que possa interagir somente com a glicose uma vez que a leitura se baseia na cor que a glicose terá após interagir com o reagente de forma que na presença de outros componentes do soro pode haver algum tipo de interferência na leitura Se houver aplicação da técnica de acordo com os protocolos descritos para cada leitura o resultado será altamente específico e fidedigno Existe outro método de análise que se baseia na absorção da energia radiante na faixa do ultravioleta 340 nm e 365 nm conhecido como reações de ultravioleta Tal método é usado na avaliação de enzimas hepáticas e ureia por exemplo As análises colorimétricas são consideradas metodologias estáticas porque uma vez adicionado o reagente à amostra a reação acontece imediatamente e não muda mais porém existem reações que levam determinado tempo para acontecer tempo que acaba se tornando um método de avalição para algumas substâncias nesse caso estamos diante de uma reação cinética Levando em conta que toda reação química gera um produto a análise por reação cinética avalia o tempo de formação desse produto que pode levar segundos minutos ou até mesmo horas mas mesmo aqui o produto 26 Unidade I é analisado por colorimetria Nesse tipo de análise são utilizadas enzimas e coenzimas que são catalisadores aceleradores de reações químicas orgânicas Na reação cinética contínua há análises contínuas da formação do produto 5 a b Tempo de reação min Absorbância c 0 0200 0000 0400 0600 0800 10 15 20 Figura 5 Exemplo de um resultado de análise de reação cinética Fonte Basques 2010 p 10 Na reação cinética em tempo fixo com medição em ponto final a análise requer muita atenção em relação ao tempo de incubação e à temperatura baseandose em conhecimentos prévios sobre a reação que será realizada bem como sobre seus tempos Uma vez que se conhece o padrão da reação podese comparar com a reação decorrente da amostra 5 0 Tempo de reação min Absorbância 0200 0100 T1 T2 0300 0400 0500 10 15 20 Figura 6 Exemplo de um resultado de análise de reação cinética em tempo fixo com medição em ponto final Fonte Basques 2010 p 10 27 BIOQUÍMICA CLÍNICA 22 Fotometria A fotometria é uma área da óptica que mede a luz de acordo com o brilho emitido e que é captado pelo olho humano Conceitualmente o termo cromóforo se refere à quantidade de luz que é absorvida por determinada substância ou objeto Ou seja quanto mais cromóforo for um objeto maior a quantidade de luz absorvida e mais escuro ele será No início das aplicações analíticas pelo método de fotometria faziase apenas a observação visual para definir a concentração de determinada substância afirmandose que quanto mais escura uma substância mais concentrada ela era Com o passar do tempo notouse que as mesmas substâncias vistas por indivíduos diferentes resultavam em análises diferentes já que o olho humano não obedece a um padrão na visualização de cores podendo variar entre cada um Assim com o intuito de eliminar essa variável criaramse soluções padrão por meio das quais se comparavam as substâncias submetidas à análise por fotometria porém ainda assim as análises não eram tão precisas quanto necessário Posteriormente foram criados equipamentos capazes de quantificar com precisão a emissão de fótons partícula elementar da força eletromagnética por determinada substância A luz consiste em uma onda eletromagnética sendo assim composta de dois tipos distintos de ondas a elétrica e a magnética que interagem entre si E é a interação entre as ondas que compõem a luz juntamente com a interação da luz com a matéria que é usada como princípio básico das análises por fotometria O espectro de luz varia de acordo com a substância em um determinado solvente e essa variação faz com que esse tipo de análise se baseie em comparação a qual se dá através do confronto entre o espectro de uma substância e um espectro conhecido As análises qualitativas fornecem resultados pouco específicos porém de extrema importância para avaliar a presença ou a ausência de determinada substância Já os resultados quantitativos oferecidos pela fotometria são precisos e vão além da presença ou não indicando também a quantidadeconcentração de determinada partícula em uma quantidade conhecida de solvente Em linhas gerais a diferença entre espectrofotometria e fotometria é que na espectrofotometria medese a absorção de uma faixa de cor dentro do espectro UVIV enquanto na fotometria medese a intensidade do brilho e a absorção de luz emitida pela substância Tratase portanto de metodologias distintas utilizadas para substâncias diferentes e com equipamentos diferentes 23 Quimioluminescência e eletroquimioluminescência A quimioluminescência baseiase na emissão de luz sem calor após uma reação química Isso porque quando um átomo recebe alguma forma de energia os elétrons mais próximos ao núcleo passam para as camadas mais externas e retornam para as proximidades nucleares num movimento excitação eletrônica que gera energia em forma de luz Um exemplo comum de reação de quimioluminescência é o luminol muito utilizado em medicina forense o qual consiste em uma substância formada por C8H7N3O2 H2O2 que ao interagir com moléculas orgânicas como o sangue utiliza o ferro da hemoglobina como catalisador da reação gerando uma luz azul brilhante 28 Unidade I Já a eletroquimioluminescência consiste na análise quimioluminescente com uma aplicação de corrente elétrica eletrodos com polos positivos e negativos Constituise em uma metodologia extremamente delicada e precisa que une as vantagens da quimioluminescência com o controle absoluto da voltagem aplicada para se obter a reação esperada As análises realizadas por quimioluminescência e eletroquimioluminescência utilizam anticorpos ligados a marcadores luminescentes cromógenos como compostos quimicamente semelhantes ao luminol derivados de acridina C13H9N um corante usado em marcação de ciclo celular e o sistema avidinabiotina Anticorpos são moléculas proteicas produzidas por células de defesa linfócitos B ou plasmócitos com a seguinte estrutura Fração FaB região de ligação com o antígeno Fração Fc fração de ligação com células e sistema complemento Figura 7 Esquema clássico de um anticorpo indicando suas regiões específicas Adaptada de Janeway et al 2007 p 17 A principal característica dessa molécula é sua altíssima especificidade para se ligar e neutralizar partículas exógenas antígenos e a aplicação dessas moléculas nas análises por quimio e eletroluminescência lança mão exatamente de tal especificidade Para tanto anticorpos são construídos artificialmente contendo em sua porção FaB uma molécula conhecida como fluorocromo que emite luz ao interagir com a substância em análise A B Enzima Fluorocromo Anticorpo primário Antigênio Figura 8 Esquema de reação utilizando anticorpos marcados por fluorocromo Na detecção direta o anticorpo marcado ligase diretamente à partícula pesquisada na detecção indireta um anticorpo primário ligase à partícula e só então é adicionado um anticorpo secundário marcado específico para se ligar ao anticorpo primário 29 BIOQUÍMICA CLÍNICA 24 Ensaios imunoenzimáticos marcadores tumorais drogas terapêuticas e de abuso Elisa Enzymelinked Immunosorbent Assay é o nome dado a uma metodologia amplamente usada para a confirmação de infecções virais porém também com muitas aplicações bioquímicas Vale alertar que nas análises por Elisa há a necessidade de preparar antígenos e anticorpos conhecidos para padronizar a técnica Ao contrário das metodologias vistas anteriormente entre as quais por exemplo há o uso de um fluorocromo no Elisa utilizase uma enzima que serve como marcador do anticorpo porém o produto final também é analisado por colorimetria Adicionar anticorpo AntiA conjugado à enzima Lavar o anticorpo não ligado Medir a absorção de luz produzida pelo produto corado A enzima torna corado o substrato incolor Amostra 1 antígeno A Amostra 2 antígeno B Figura 9 Protocolo padrão da metodologia Elisa Adaptada de Janeway et al 2007 p 690 As metodologias citadas fazem parte de uma grande diversidade de técnicas diagnósticas disponíveis atualmente e têm inúmeras aplicações nas análises laboratoriais Estudaremos alguns exemplos a seguir 30 Unidade I 241 Marcadores tumorais São as substâncias químicas presentes no sangue ou na urina somente em casos de tumores uma vez que são produzidas por eles O mais popularmente conhecido é o antígeno prostático específico PSA presente em altas quantidades em homens com câncer de próstata Geralmente esses marcadores são encontrados em níveis baixos em pacientes que não apresentam nenhum tipo de tumor Dessa forma devem ser sempre considerados a história clínica e os valores de referência para o diagnóstico retomaremos esse tema com mais detalhes adiante 242 Drogas terapêuticas ou de abuso O princípio da reação é o mesmo de outras análises que se utilizam desse tipo de técnica uma vez que se faz uso de anticorpos altamente específicos construídos artificialmente para se ligarem a moléculas de drogas terapêuticas Por exemplo em pessoas que fazem uso contínuo de medicamentos essa técnica se mostra útil para avaliar se há algum tipo de acúmulo do princípio ativo do fármaco que poderia levar a médio e longo prazo a algum tipo de dano reversível ou não Em relação à detecção de drogas de abuso como maconha cocaína heroína utilizase o mesmo princípio ou seja a alta especificidade do anticorpo marcado por substâncias luminescentes A coleta de sangue deve ser realizada em momentos em que a concentração é mínima geralmente imediatamente antes da dose seguinte para alguns medicamentos ou concentração máxima dependendo do medicamento prescrito podendo até ser solicitada uma coleta aleatória A interpretação correta dos resultados obtidos depende do momento em que a amostra foi colhida e juntamente com esses testes devese fazer um perfil renal e um perfil hepático entre outros exames que possam se mostrar necessários No caso do lítio por exemplo usase soro no plasma ou nas hemácias pois há correlações entre a concentração eritrocitária e efeitos adversos neurológicos Já a determinação de metotrexato MTX no plasma é realizada por cromatografia líquida de alta eficiência por arranjo de fotodiodos CLAEPDA Há também os imunoensaios que pelos métodos automatizados apresentam rapidez e simplicidade de execução embora possam apresentar falsos positivos caso haja reatividade cruzada com alguns interferentes endógenos como no caso da digoxina digoxinlike immunoreactive substances ou DLIS ou reatividade cruzada dos anticorpos ou interferentes como bilirrubina alta hemólise lipidemia alta Entretanto a cromatografia líquida de alta pressão HPLC e a cromatografia gasosa GC são referências na validação de ensaios de TDM A cromatografia líquida pode ser acoplada à espectrometria de massa LCMS LCMSMS então considerada gold standard ou seja método padrão ou método ouro da TDM pela elevada sensibilidade e especificidade Há programas de computador em farmacocinética clínica que usam regressão linear regressão não linear ou a estimativa bayesiana gold standard na análise de dados Tal metodologia estima a probabilidade de se obter um parâmetro farmacocinético a partir da concentração plasmática do fármaco e da farmacocinética populacional isto é considerase a distribuição desse parâmetro na população a que pertence o doente 31 BIOQUÍMICA CLÍNICA 2421 Técnicas analíticas das drogas de abuso Vários são os testes usados em laboratórios de pesquisa e em laboratórios clínicos mas podemos destacar os principais Espectrofotometria Um dos métodos analíticos mais utilizados é o colorimétrico associado ao espectrofotômetro Um exemplo de uso é a determinação do medicamento captopril no sangue utilizandose o reagente FolinCiocalteau o qual entra em reação com a substância farmacologicamente ativa e forma um cromógeno na cor azul dosado no espectrofotômetro a 670 nm Teste de Scott Esse teste é usado para detectar a presença de cocaína O cloridrato de cocaína é um sal solúvel em água obtido na forma de pó podendo ser usado dessa forma aspiração do pó ou via intravenosa O crack é um subproduto da pasta da cocaína apresentandose como pedra e pouco solúvel em água no entanto facilmente volatilizado quando aquecido O teste de Scott é um teste colorimétrico que utiliza o tiocianato de cobalto a 2 de glicerina em meio ácido reagindo com a cocaína e gerando uma coloração azulturquesa resultado positivo Se usarmos um espectrofotômetro a presença de cocaína será detectada com máximo de absorção na região de 320 nm a 330 nm Observação Esse teste rápido é usado em portos e aeroportos para detecção de cocaína em bagagens Caso haja um resultado positivo ocorrerá a prisão dos traficantes Teste de DuquenoisLevine Tratase de um teste colorimétrico com técnica qualitativa para detectar maconha A reação é feita com uma solução que contém acetaldeído e vanilina em etanol 95 mais o reagente de DuquenoisLevine e ácido clorídrico Em caso positivo observase a formação de um anel com coloração violeta na amostra resultado da reação de protonação da vanilina e da reação com o THC formando um complexo Teste de Mayer O teste de turbidez de Mayer corresponde a um teste de precipitação para determinar presença de alcaloides caso da cocaína por exemplo na amostra Porém não apresenta uma especificidade alta Para a identificação utilizamse ácido clorídrico e reagente de Mayer tetraiodo mercurato II 32 Unidade I potássio que ao reagirem com a amostra formam um precipitado branco leitoso com aspecto de coágulo com turvação da amostra Cromatografia em camada delgada CCD É uma técnica física que separa substâncias com base nas interações com as fases da cromatografia fase móvel e fase estacionária sendo que a fase estacionária ou seja fixa é sólida podendo até ser papel de filtro A fase móvel pode ser gasosa líquida ou se mostrar um fluido supercrítico substância que foi submetida à temperatura acima de seu ponto crítico apresentando propriedades intermediárias entre líquido e gás movendose sobre a fase estacionária e junto a ela movemse os componentes da mistura a ser estudada Saiba mais Tswett botânico em 1910 publicou em seu livro Clorofilas no mundo vegetal e animal sua invenção para a separação de substâncias coloridas presentes em vegetais a cromatografia nome que não foi dado à toa vindo do grego chroma cor e graph grafia ou seja cromatografia nada mais é do que a grafia das cores Tswett empregou inulina dentro de uma coluna como fase fixa usando vários solventes para separar os anéis de cor verde e amarelo Você pode conhecer mais detalhes dessa história por meio do artigo indicado a seguir TSWETT M S About a new category of adsorption phenomena and their application for biochemical analysist Tr Warshaw Obshch Estestvoisp Otd Biol v 14 p 2039 1903 Como feito por Tswett podese usar a fase estacionária dentro de colunas de vidro ou de outro material aço inoxidável ou aderidas em placas ou até papel de filtro a fase móvel será um solvente puro ou misturado com outros solventes Então com o auxílio de um revelador identificamse manchas de acordo com a polaridade entre as fases No caso da maconha usase como fase móvel uma solução hexanoéter etílico e como revelador uma solução etanólica de Fast Blue RE Salt e vapor de hidróxido de amônio Após a revelação observase a coloração da mancha e determinase o seu RF comparando com a amostra padrão de referência Para a cocaína optase por clorofórmioacetonahidróxido de amônio como fase móvel cabendo à solução de Dragendorff solução de iodeto de bismuto de potássio a função de revelar para assim obtermos o RF O RF também conhecido como razão de frente ou fator de retenção é calculado por meio da divisão do caminho da amostra pelo caminho do solvente 33 BIOQUÍMICA CLÍNICA 8 cm 10 cm 4 cm 5 cm Ponto de origem Fim da corrida RFA 810 08 RFB 410 04 RFC 510 05 A B C Solvente Figura 10 Esquema de uma cromatografia em papel ou em sílica gel cromatografia em camada delgada CCD Supondo que a amostra A seja cocaína podemos sugerir que a amostra C terá cocaína uma vez que possui o mesmo RF Cromatografia líquida de alta eficiência Clae ou High performance liquid chromatography HPLC Esse método identifica e quantifica componentes de uma mistura usando a fase estacionária que fica dentro de uma coluna com algum material adsorvente e um líquido fase móvel que empurra os componentes por essa coluna geralmente de aço inoxidável É o método de escolha para identificação de drogas utilizadas em suspeita de casos de doping A Clae é a técnica mais utilizada até mesmo para a quantificação dos níveis plasmáticos da droga bem como os seus metabólitos presentes no sangue Como cada componente interage de forma diferente com o material da coluna pode ser sílica por exemplo saem da coluna com velocidades diferentes e passam por outro aparelho detector que pode ser um espectrofotômetro caracterizando a absorção em determinados comprimentos de onda e registrando em cromatogramas O HPLC pode separar compostos não voláteis e termicamente instáveis já a CG corresponde a um equipamento simples e de baixo custo se comparada com o HPLC além de ser rápida e muito precisa Cromatografia gasosa acoplada ao espectrofotômetro de massa LcEm É uma das técnicas mais empregadas na área forense permitindo a detecção de várias substâncias e seus interferentes apresentando alta sensibilidade e seletividade e fornecendo resultados precisos e exatos É muito utilizada pela criminalística em todo o Brasil e indicada como referência nos guias de análise do Escritório das Nações Unidas sobre Drogas e Crime UNODC United Nations Office on Drugs and Crimes Sabemos que não há dois compostos com um mesmo espectro de massas EM Nessa técnica criamse íons dos compostos para isso a substância deve estar no estado gasoso que são separados 34 Unidade I em um campo elétrico de acordo com a sua taxa de massacarga mz sendo então detectados qualitativa e quantitativamente de acordo com sua taxa mz e abundância A amostra é injetada no cromatógrafo volatilizada no injetor do equipamento e vai para a coluna com a fase estacionária e um gás de arraste hélio ou hidrogênio que separa os íons Por fim o resultado é comparado com o banco de dados do espectro de massas de várias substâncias químicas Vale ressaltar que a técnica com EM pode ser realizada usando em vez da CG o HPLC Espectroscopia de Raman Chandrasekhar Raman um físico indiano demonstrou em meados de 1930 que quando os fótons interagem com uma molécula ela evolui para um estado de maior energia e depois quando ocorre um relaxamento o nível de energia vibracional fica diferente do seu estado inicial produzindo um fóton de energia diferente A diferença entre a energia do fóton incidente e a energia do fóton propagado é chamada de deslocamento Raman Quando a mudança na energia do fóton propagado é menor que a energia do fóton incidente a difusão é chamada de difusão Stokes Caso o relaxamento na etapa final for menor que a do estado de excitação inicial temos uma difusão antiStokes Há uma variedade de mercados que se utilizam dessa técnica como a indústria farmacêutica medicamentos e pureza da matériaprima áreas que trabalham com carbono e diamante com gemologia análise de pedras preciosas geologia e mineralogia ciência forense drogas de abuso e falsificação de objetos nanotecnologia arte e patrimônio veracidade da obra pesquisas biológicas e biomédicas Espectroscopia de absorção e emissão atômica A espectroscopia de absorção atômica baseiase na identificação de átomos e na quantificação da energia eletromagnética que é absorvida em um determinado comprimento de onda A espectroscopia de emissão atômica apresenta o mesmo conceito descrito anteriormente a diferença entre elas é que uma absorve e a outra emite energia eletromagnética no caso em particular esta emite em um determinado comprimento de onda Vale destacar ainda que nos dois casos a amostra deverá ser atomizada isto é decomposta em átomos ou íons por meio de uma chama forno ou um plasma A espectroscopia de absorção atômica apresenta amplas vantagens como alta sensibilidade capacidade de distinguir elementos mais complexos identificação de substâncias com concentrações em partes por milhão ppm ou partes por bilhão ppb Essa técnica é muito utilizada para drogas terapêuticas e drogas ilícitas contudo tratase de um método ainda muito caro Eletroforese princípios e equipamentos O princípio básico da eletroforese é o deslocamento de moléculas eletricamente ativas através de um gel após a aplicação de uma corrente elétrica Foi inventada em 1948 pelo químico Arnie Tiselius ganhador do prêmio Nobel 35 BIOQUÍMICA CLÍNICA A eletroforese consiste em separar moléculas de acordo com seu peso molecular moléculas muito grandes não conseguirão migrar ao longo do gel o que não acontece com as moléculas menores Atualmente se mostra uma técnica amplamente utilizada na detecção de ácidos nucleicos DNA e RNA eproteínas como hemoglobina lipoproteínas e albumina Os géis mais utilizados são o de agarose para ácidos nucleicos e o de poliacrilamida para proteínas a diferença entre eles é o tamanho da rede que oferecem Eletroforese em gel de agarose Agarose é um pó polissacarídeo que adicionado a uma solução tampão TBE previamente preparada polimerizase formando um gel firme no qual serão aplicadas as amostras Figura 11 Representação de gel de agarose preparado em cuba específica Disponível em httpsbitly3xvCyio Acesso em 18 jun 2021 A concentração da agarose determina o tamanho da rede que será formada e isso é baseado na amostra a ser analisada Após a corrida das amostras o gel é retirado e colocado em solução de brometo de etídio que fará com que a amostra que se deslocou no gel brilhe após a colocação em câmara de luz UV Figura 12 Resultado obtido de uma corrida em gel de agarose Disponível em httpsbitly3wCPfrt Acesso em 18 jun 2021 36 Unidade I Eletroforese em gel de poliacrilamida A poliacrilamida é uma substância formada por dois tipos de polímeros acrilamida com conformação linear e bisacrilamida com conformação em forma de T e são as diferenças entre as moléculas que levam à formação de uma rede diferenciada e mais fechada útil na detecção de proteínas que são consideradas moléculas pequenas quando comparadas aos ácidos nucleicos por exemplo Ao contrário da eletroforese em gel de agarose que acontece na posição horizontal a eletroforese em gel de poliacrilamida deve ser realizada na posição vertical e em equipamento diferenciado A técnica utilizada para detecção e separação de proteínas em gel de poliacrilamida é chamada de Western Blot e envolve uma série de etapas que devem ser seguidas com rigor para o sucesso da análise Solução de gel separador Solução de gel de empilhamento Isopropanol Aparato para gel Gel de acrilamida Pente Figura 13 Representação das etapas da técnica de Western Blot Disponível em httpsbitly3vvpI21 Acesso em 18 jun 2021 Polimerase Chain Reaction PCR reação da cadeia de polimerase Tratase de uma técnica de separação de moléculas que envolve a migração de partículas em determinado gel durante a aplicação de uma diferença de potencial As moléculas são separadas de acordo com o seu tamanho pois as de menor massa migrarão mais rapidamente que as de maior massa O produto da PCR que tem carga negativa migra para o polo oposto positivo ocorrendo a separação molecular da amostra e permitindo a visualização de bandas A agarose é um polissacarídio que forma uma espécie de rede prendendo as moléculas durante a migração O gel de agarose é corado com brometo de etídeo um intercalante de DNA que se torna visível quando exposto à luz ultravioleta Já a poliacrilamida é uma mistura de dois polímeros acrilamida molécula linear e bisacrilamida em forma de T Misturando essas duas moléculas temse a formação de uma rede Diferentes relações entre as concentrações dessas moléculas permitem a 37 BIOQUÍMICA CLÍNICA criação de distintos gradientes de separação O gel de poliacrilamida é corado com nitrato de prata e não precisa ser exposto à luz ultravioleta M 1 2 3 4 5 6 7 8 C 9 10 11 12 E multilocularis E granulosus 700 bp 500 bp 300 bp Figura 14 Demonstração das etapas e equipamentos utilizados na PCR convencional Disponível em A httpsbitly3gBKvgp B httpsbitly2Uab2Zf Acesso em 21 jun 2021 Possibilita a síntese de fragmentos de DNA a partir de sequênciasalvo de DNA definidas capazes de gerar uma quantidade essencialmente ilimitada de uma sequência de interesse e pode ser executada inteiramente in vitro sem o uso de células Para permitir a amplificação seletiva é necessário desenhar dois oligonucleotídios iniciadores primers ou amplificadores os quais são específicos para a sequênciaalvo e apresentam de 15 a 25 nucleotídeos de extensão Após os primers terem sido adicionados ao DNA molde desnaturado eles se ligam especificamente às sequências de DNA complementares ao seu localalvo Esses iniciadores são projetados de modo que um é complementar ao filamento de uma molécula de DNA em um lado da sequênciaalvo e o outro é complementar ao outro filamento da molécula de DNA no lado oposto da sequênciaalvo Na presença de uma enzima DNA polimerase termoestável apropriada e de precursores de DNA dATP dCTP dGTP dTTP é iniciada a síntese de novas fitas de DNA Os filamentos de DNA 38 Unidade I recémsintetizados mesmo complementares formam uma segunda cópia da sequênciaalvo original gerando assim uma amplificação exponencial 2 4 8 16 32 cópias da sequência do DNAalvo A PCR é uma reação em cadeia porque as fitas de DNA recentemente sintetizadas atuarão como molde para mais uma síntese de DNA nos ciclos subsequentes Após cerca de 25 ciclos de síntese de DNA os produtos da PCR incluem além do DNA que iniciou a reação cerca de 105 cópias da sequênciaalvo específica Na PCR convencional os resultados são qualitativos Real Time Polimerase Chain Reaction RTPCR A RTPCR é uma reação da transcriptase reversa seguida de PCR que nesse caso será quantitativa A técnica não utiliza o DNA de cadeia dupla como molde mas sim o RNA de cadeia simples A partir do RNA a enzima transcriptase reversa sintetiza uma cadeia de DNA complementar chamado de cDNA Ao cDNA aplicase a técnica de PCR A RTPCR é amplamente utilizada para verificar a expressão gênica uma vez que analisa o RNA responsável pela síntese de proteínas Amostra de DNA Taq polimerase Primers Tampão de amostra Nucleotídeos PCR Tubo Ciclo de PCR Termociclador Figura 15 Constituintes de uma reação em cadeia pela polimerase Fonte Lipay e Bianco 2015 p 53 A PCR envolve ciclos sequenciais compostos por três etapas Desnaturação 93 C a 96 C separação da dupla hélice do DNAalvo em duas fitas simples Anelamento 50 C a 70 C pareamento dos primers por meio de ligações de hidrogênio ao DNAalvo de fita simples a temperatura de pareamento depende da quantidade de citosina e guanina da sequência a ser amplificada cerca de 5 C abaixo da temperatura média calculada 39 BIOQUÍMICA CLÍNICA Extensão 70 C a 75 C síntese da cadeia complementar de cada cadeia molde catalisada pela DNA polimerase enzima responsável por adicionar os dNTP à nova fita 5 5 5 5 3 3 3 3 3 3 3 3 3 5 5 5 5 5 1 1 1 1 1 1 2 2 2 3 3 3 Nucleotídeo Desnaturação a 9496 ºC Anelamento a 68 ºC Extensão a 72 ºC DNA primário DNA original a ser replicado Reação da cadeia de polimerase PCR Figura 16 Etapas da RTPCR em termociclador Disponível em httpsbitly3wCPx1t Acesso em 18 jun 2021 A PCR em tempo real baseiase na detecção e na quantificação do sinal fluorescente dos vários amplicons gerados por ela ou seja do produto da amplificação do DNA Essa detecção ocorre por meio de um termociclador com sistema óptico para a captação da fluorescência e de um computador com um software para aquisição de dados e análise da reação Há vários fabricantes e esses equipamentos diferem entre si quanto à capacidade da amostra e ao método de captação da fluorescência na sensibilidade e nos softwares para a análise dos dados Durante a PCR as emissões de fluoróforos são medidas de ciclo em ciclo diretamente proporcionais aos amplicons que estão sendo gerados A principal característica da PCR em tempo real é que ela consegue monitorar o progresso da PCR enquanto ocorre a reação e os dados são coletados ao longo dos ciclos Utiliza a primeira amplificação de uma sequênciaalvo e a partir daí quanto mais alto o número de cópias iniciais da sequência de DNAalvo mais rápido será observado um aumento significativo da fluorescência 40 Unidade I 5 Limiar Fluorescência normal 1030 1025 1010 1020 1005 1015 1000 15 25 Ciclo 35 10 20 30 40 45 Figura 17 Gráfico que demonstra a amplificação em tempo real da análise de RTPCR Disponível em httpsbitly3iNz9qS Acesso em 21 jun 2021 A quantificação por PCR em tempo real envolve a determinação de um ciclo threshold Ct ou um ponto de cruzada Cp que é o momento da reação em que a fluorescência de determinada amostra é detectada pelo sistema nessa hora a reação atinge o limiar da fase exponencial Esse ponto permite a quantificação exata e reprodutível baseada na fluorescência O nível de fluorescência computado para cada amostra é aquele suficiente para atingir um limiar de detecção igual para cada conjunto de primersamostras testados A fluorescência emitida antes do nível do Ct para cada curva é considerada ruído de fundo background e deve ser desconsiderada na análise Quanto mais DNA houver no início da reação mais rapidamente terá início a fase exponencial quando o dobro de produto se acumula a cada ciclo 100 de eficiência Como consequência o número de ciclos necessários para detectar o produto da PCR será menor e a concentração inicial de DNA será maior A detecção da amplificação ciclo por ciclo e o uso do começo da fase exponencial fazem da PCR em tempo real uma técnica muito mais sensível quanto à quantificação de DNA do que os métodos semiquantitativos 41 BIOQUÍMICA CLÍNICA Aplicação à determinação de diferentes constituintes eletroforese de proteínas hemoglobina e lipoproteínas A separação de diferentes proteínas pela eletroforese passou a ser realizada no início do século XX A utilização da técnica de detecção de proteínas mostravase limitada pelo fato de as proteínas separadas em gel matriz se mostrarem com um acesso muito difícil para provas moleculares Somente após o desenvolvimento da técnica de transferência das proteínas para uma membrana adsorvente foi possível detectar as proteínas com mais precisão KURIEN SCOFIELD 2006 Western blotting WB também conhecido como protein blotting ou immunoblotting é um poderoso e importante método em biologia molecular utilizado para imunodetecção de proteínas após sua separação por eletroforese em gel e transferência para membrana adsorvente KURIEN SCOFIELD 2006 Essa técnica permite detectar caracterizar e quantificar múltiplas proteínas principalmente aquelas que estão em baixas quantidades na amostra A escolha do material da matriz depende da resistência necessária para a separação efetiva dos fragmentos proteicos O gel de agarose possui poros com diâmetro que permitem a separação de fragmentos que variam de 200 pares de bases pb a 50 kilobases kb A poliacrilamida é o material ideal para processos de sequenciamento pois permite a separação de fragmentos muito pequenos de até 1000 pb A eletroforese em gel de poliacrilamida Page é um método simples e rápido que separa pequenas proteínas de tamanhos diferentes usando enzimas de restrição Quando submetidas a um campo elétrico em pH neutro as moléculas de proteína são atraídas para o polo positivo e repelidas pelo polo negativo Quando a matriz apresenta resistência à migração das moléculas os fragmentos menores podem se mover com maior facilidade do que os maiores havendo então uma migração diferenciada dos fragmentos Mistura de fragmentos de proteínas Eletrodo negativo Eletrodo positivo Tempo permitido Fragmento maior de proteínas Fragmento menor de proteínas Fonte de corrente Gel Figura 18 Esquema da eletroforese em gel de poliacrilamida Page A amostra é colocada em uma canaleta confeccionada no gel Sob corrente elétrica as proteínas migram do lado de carga negativa para o lado positivo No gel as proteínas se posicionam de acordo com seu tamanho e peso Fonte Miguel Menezes e Araújo 2012 p 6 A fim de tornar as proteínas acessíveis à detecção por anticorpos realizase a sua transferência de um gel para uma membrana adsorvente A membrana de transferência é colocada face a face com o gel de separação aplicandose então uma corrente elétrica Durante a transferência o gel está na face do eletrodo negativo e a membrana em sua face positiva Então as proteínas contendo carga 42 Unidade I elétrica se movem do gel para a membrana mantendo a mesma disposição do gel Como resultado desse processo de transferência e ligação à membrana as proteínas são expostas a uma fina camada para detecção A ligação das proteínas à membrana é baseada tanto em interações hidrofóbicas quanto em interações de cargas entre a membrana e as proteínas Dois filtros de papel úmidos Gel de poliacrilamida Membrana Dois filtros de papel úmidos Direção da transferência Cátodo Ânodo Figura 19 Transferência de proteínas de gel para membrana com o método de transferência horizontal semisseca Fonte Miguel Menezes e Araújo 2012 p 8 Bloqueio de ligações inespecíficas Uma grande quantidade de proteínas indesejáveis ligase fortemente à nitrocelulose em diferentes condições experimentais No entanto leite seco desnatado soro albumina bovina BSA Triton X100 Nonidet P40 e Tween 20 são eficazes na remoção de ligações proteicas Leite seco desnatado e BSA são rotineiramente utilizados em procedimentos de imunodetecção de proteínas para evitar ligações inespecíficas KURIEN SCOFIELD 2006 Adição do anticorpo Normalmente os anticorpos monoclonais ou policlonais são utilizados para detectar uma proteína antígeno ou epítopo específica ligandose diretamente a ela sendo o anticorpo primário da técnica de immunoblotting Anticorpos monoclonais são melhores imunodetectores entretanto anticorpos secundários antipeptídicos específicos devem ser usados PAGANO 1999 Posteriormente essa reação entre antígeno e anticorpo primário será exposta a um anticorpo secundário direcionado a porções espécieespecíficas do anticorpo primário PAGANO 1999 Em geral o anticorpo secundário está ligado à uma enzima reveladora como a biotina que gera uma mudança de coloração ou um sinal fotométrico PAGANO 1999 43 BIOQUÍMICA CLÍNICA Papel absorvente Membrana Papel absorvente Eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida SDSPage Marcadores de peso molecular Adicionar substrato incolor Adicionar conjugado anticorpo marcado com enzima Adicionar anticorpo monoclonal Bloco de membrana Proteínas transferidas Revelador Figura 20 Técnica de Western blotting evidenciando a adição de anticorpos Fonte Miguel Menezes e Araújo 2012 p 1713 Detecção de antígenos As proteínas no immublotting têm sido detectadas diretamente por uso de corantes orgânicos marcadores fluorescentes e vários métodos com coloração de prata e partículas coloidais como ouro prata cobre ferro ou indian ink tintadaíndia O tipo de coloração a ser utilizado deve ser compatível com a membrana usada para a transferência de proteínas Após a adição do anticorpo primário e do anticorpo secundário dois métodos de detecção de antígenos são comumente usados radioativo e imunoenzimáticas O método radioativo promove a ionização e subsequente autorradiografia para visualização da interação antígenoanticorpo esse método de detecção está em franco desuso por apresentar um alto custo e riscos à saúde A quimioluminescência preconiza a incubação de um substrato fluorescente que ao ser exposto a uma enzima reveladora associada ao anticorpo secundário gera uma coloração Essa florescência é detectada por um filme fotográfico ou câmeras especiais que capturam uma imagem digitalizada do WB A imagem é analisada por densitometria que avalia a quantidade de proteína colorida e quantifica os resultados em termos de intensidade ótica Atualmente a quimioluminescência é o método imunoenzimáticos de eleição em WB Normalmente horseadish peroxidase ou fosfatase alcalina ligados a anticorpos são usados com inúmeros substratos solúveis que produzem produtos coloridos insolúveis Esses métodos são de simples execução e não requerem equipamentos sofisticados além de conferirem resultados rápidos A principal desvantagem do método está na dificuldade de obtenção de fotografias com qualidade diferentemente do método radioativo pois a coloração da reação apresenta baixo contraste e no fato de não produzir resultados quantitativos 44 Unidade I A eletroforese de hemoglobina é um exame realizado para medir e identificar os diferentes tipos de hemoglobina que podem ser encontrados no sangue Como sabemos a hemoglobina é uma proteína dos glóbulos vermelhos responsável por transportar oxigênio para todo o corpo O exame é realizado com o intuito de mensurar e detectar os diferentes tipos de hemoglobina que são encontrados no sangue Ele ajuda a diagnosticar talassemias e hemoglobinopatias além de um diferenciado diagnóstico de hemólise e anemias Geralmente a eletroforese de hemoglobina é solicitada para analisar alterações estruturais e funcionais referentes à síntese de hemoglobina Dessa forma o médico pode indicálo com o intuito de detectar a anemia falciforme a doença de hemoglobina C Inclusive pode ser requerida com a finalidade de aconselhar geneticamente casais que desejam ter filhos Isso se deve ao fato de que por meio dele é possível informar se há chance de o bebê ter algum tipo de distúrbio no sangue referente à síntese de hemoglobina A eletroforese de proteínas é um exame laboratorial utilizado para separação das proteínas encontradas no soro sangue ou na urina e serve para auxiliar no diagnóstico de doenças que afetam a absorção produção e perda de proteínas além da desnutrição A lipoproteína é uma proteína do sangue cuja função principal é transportar colesterol triglicerídeos e outras gorduras do corpo Os padrões de eletroforese de lipoproteínas são importantes na caracterização das dislipidemias secundárias e primárias alterações relacionadas ao colesterol e trigiclerídeos que aumentam as chances de entupimento das artérias A eletroforese de proteínas pode ser solicitada quando o médico suspeita de doenças que afetam as concentrações sanguíneas das proteínas eou causem perda proteica na urina como o mieloma múltiplo caracterizado pelos sintomas de dor óssea anemia fadiga fraturas inexplicáveis e infecções recorrentes Também pode ser solicitada como parte de outros exames laboratoriais que apresentam alteração como níveis anormais de proteínas totais eou de albumina níveis elevados de proteínas na urina níveis aumentados de cálcio e contagens baixas de glóbulos vermelhos ou brancos Uma vez que uma doença ou quadro clínico tenha sido diagnosticado a eletroforese pode ser pedida a intervalos regulares para monitorar o curso da doença e a efetividade do tratamento 3 CONTROLE DE QUALIDADE EM BIOQUÍMICA CLÍNICA Ao longo da última década alguns questionamentos vêm sendo levantados em relação aos cuidados com o gerenciamento de qualidade dos serviços de saúde Tais questões são originadas na comparação entre as evoluções tecnológicas e o conhecimento adquirido com a evolução na qualidade dos serviços prestados aos clientes bem como a diminuição da intervenção humana nas análises devido à automatização da maioria das técnicas Diante disso inúmeras iniciativas vêm sendo implantadas no intuito de melhorar os processos aplicando iniciativas já existentes em outras áreas como gestão de qualidade total GQT pensamento enxuto Seis Sigma redesenho de processos normas ISO e prêmios de qualidade além é claro das certificações e acreditações Entretanto para que as inovações e melhorias deem certo tornase imprescindível o controle desses processos que deve ser capaz de identificar possíveis falhas que possam vir a acontecer ou 45 BIOQUÍMICA CLÍNICA que já aconteceram Além disso o laboratório deverá estar preparado para agir prontamente a fim de evitar ou minimizar as consequências e a recorrência dessas falhas Isso tudo acaba por se traduzir em um processo chamado garantia da qualidade O laboratório clínico deve assegurar que os resultados produzidos reflitam de forma fidedigna e consistente a situação clínica apresentada pelos pacientes assegurando que não representem o resultado de alguma interferência no processo A informação produzida deve satisfazer as necessidades de seus clientes e possibilitar a determinação e a realização correta de diagnóstico tratamento e prognóstico das doenças No entanto para que todas as inovações e melhorias sejam assertivas é indispensável que haja um controle rígido de todos os processos o qual ainda deve ser capaz de pontuar possíveis falhas as instaladas as que podem vir a acontecer e as que já ocorreram além de nesse último caso tratar da forma como foram sanadas A essa série de regras utilizadas em diferentes escalas dáse o nome de garantia de qualidade Nesse conceito em um laboratório de análises clínicas os processos de garantia de qualidade são absolutos e devem compreender todas as etapas desde as préanalíticas até as pósanalíticas A equipe de gestão de qualidade no entanto cuida das ações utilizadas para produzir dirigir e controlar tal qualidade utilizando indicadores e metas específicas Para criar um padrão e poder aplicálo em todos os setores e processos laboratoriais foram criados programas de acreditação brasileiros como o Programa de Acreditação de Laboratórios Clínicos Palc da SBPCML e o Departamento de Inspeção e Credenciamento de Qualidade DICQ da Sociedade Brasileira de Análises Clínicas SBAC Independentemente de qual seja a iniciativa de melhoria da qualidade a ser implantada em uma organização de saúde ou em qual metodologia esta tenha base o essencial é que o objetivo primordial não seja esquecido ou colocado em segundo plano O objetivo principal de qualquer melhoria de processos na área da saúde é ampliar a segurança dos serviços prestados ao paciente Oferecer níveis elevados de segurança aos pacientes significa melhorar continuamente os processos que impactam esses clientes garantindo estabilidade e previsibilidade aos processos e antecipandose a eventuais falhas sempre que possível Isso exige extremo conhecimento e controle de todos os processos críticos de uma organização de saúde exige conhecer principalmente a complexidade dos processos e os fatores de riscos envolvidos 31 Controles internos e externos no laboratório de bioquímica e boas práticas laboratoriais Para a implantação das normas vigentes de controle de qualidade devese além de integrar toda a equipe contar com a boa vontade e os cuidados da alta administração do local Outros pontos também devem ser considerados indicação de um responsável técnico que conheça todos os processos de controle de qualidade será o gestor de qualidade 46 Unidade I procedimentos internos checados diariamente programas de treinamento e educação continuada avaliação de desempenho registro de relatórios As boas práticas laboratoriais BPLs são normas fundamentais para se estabelecerem padrões de qualidade e confiabilidade em todo o processo técnico científico Tais normas condicionam o funcionamento a organização e as condições em que as análises laboratoriais deverão ser planejadas armazenadas e liberadas Também consideram a preservação e o descarte das amostras e de que forma os dados serão arquivados Todos estes quesitos fazem parte das fases préanalíticas analíticas e pósanalíticas A etapa préanalítica é considerada uma das mais complexas para se padronizar e controlar pois envolve uma série de fatores inclusive os que não são inerentes ao próprio laboratório Muitos desses fatores podem eventualmente causar variações nos resultados difíceis de rastrear como a identificação e o preparo do paciente antes da coleta da amostra As BPLs devem incluir também os cuidados com manutenção e calibração dos equipamentos e insumos utilizados limpeza inspeção e padronização Também são necessários protocolos abordando a estabilidade e a pureza das substâncias de teste ou referência sempre se observando os registros de compra informações sobre rotulagem e armazenamento de todas as substâncias e reagentes utilizados Quadro 2 Sumário descritivo das etapas préanalíticas analíticas e pósanalíticas na realização de exames laboratoriais Fase préanalítica O paciente os exames e as amostras devem ser devidamente identificados apresentando informações que incluem o nome do paciente data e hora da coleta e o tipo de material coletado urina sangue total plasma soro Transmitir ao paciente ou responsável todas as orientações necessárias à preparação correta do paciente como necessidade de jejum uso de álcool e fumo estresse estado nutricional exercícios físicos postura e interferência in vitro e in vivo dos medicamentos Fase analítica Compreende todas as operações empregadas na realização de um exame As diversas variáveis analíticas devem ser bem controladas a fim de garantir que os resultados sejam precisos e exatos Os parâmetros a ser analisados são confiabilidade exatidão precisão sensibilidade especificidade e linearidade praticidade tipo de amostra volume complexidade metodológica duração do ensaio estabilidade de reagentes analítica robustez interação com amostras equipamentos custo e segurança pessoal calibração dos dispositivos de medição e ensaio equipamentos vidrarias e pipetas limpeza da vidraria qualidade da água Fase pósanalítica Envolve as etapas executadas após a realização do exame e incluem os cálculos dos resultados análise de consistência dos resultados liberação dos laudos armazenamento de amostra ou material de paciente transmissão arquivamento de resultados e consultoria técnica 47 BIOQUÍMICA CLÍNICA 311 Controle interno da qualidade Definese portanto como controle interno de qualidade CIQ os procedimentos conduzidos em associação com o exame de amostras de pacientes para avaliar se o sistema analítico está operando dentro dos limites de tolerância predefinidos O laboratório clínico deve realizar o controle interno da qualidade contemplando monitoramento do processo analítico pela análise das amostras de controle com registro dos resultados obtidos e na análise dos dados definição dos critérios de aceitação dos resultados por tipo de analito e de acordo com a metodologia utilizada liberação ou rejeição das análises após avaliação dos resultados das amostras de controle Para o CIQ o laboratório clínico deve utilizar amostras de controle comerciais regularizadas segundo a Anvisa Ministério da Saúde e de acordo com a legislação vigente Formas alternativas descritas na literatura podem ser utilizadas desde que permitam a avaliação da precisão do sistema analítico O laboratório clínico deve registrar as ações adotadas decorrentes de rejeições de resultados de amostras de controle As amostras de controle devem ser analisadas da mesma forma que amostras dos pacientes 312 Controle externo da qualidade Entendese por controle externo da qualidade também chamado avaliação externa da qualidade a atividade de avaliação do desempenho de sistemas analíticos através de ensaios de proficiência análise de padrões certificados e comparações interlaboratoriais O laboratório clínico deve participar de ensaios de proficiência para todos os exames realizados na sua rotina Para os exames não contemplados por programas de ensaios de proficiência o laboratório clínico deve adotar formas alternativas de controle externo da qualidade descritas em literatura científica Vale acrescentar que a participação em ensaios de proficiência deve ser individual para cada unidade do laboratório clínico que realiza as análises A normalização sobre o funcionamento dos provedores de ensaios de proficiência deverá seguir os critérios da Anvisa e o laboratório clínico deve registrar os resultados do controle externo da qualidade inadequações investigação de causas e ações tomadas para os resultados rejeitados ou nos quais a proficiência não foi obtida 32 Métodos estatísticos de controle Fornecem medidas que podem caracterizar o comportamento dos elementos de uma série possibilitando determinar se um valor está entre o maior e menor valor da série ou se está localizado no centro do conjunto de dados por exemplo As medidas de tendência central informam o valor em torno do qual os dados se distribuem Tem por objetivo representar os dados de uma forma mais condensada que uma tabela localizando a maior concentração de valores em torno de uma distribuição 48 Unidade I Média Médiana Medidas de tendência central Moda Figura 21 Organograma dos componentes de medida de tendência central Dispersão estatística As medidas de posição média mediana moda descrevem características dos valores numéricos de um conjunto de observações em torno de um ponto de equilíbrio dos dados Nenhuma delas informa sobre o grau de variação ou dispersão dos valores observados em relação à média Em um grupo de dados os valores numéricos não são necessariamente semelhantes e apresentam desvios em relação à tendência central usualmente a média aritmética As medidas de dispersão quantificam a variação dos dados em relação à média e indicam qual o seu grau de representatividade 1 2 75 cm 75 cm Figura 22 As peças produzidas pela linha 1 de produção são melhores que as da linha 2 pois a dispersão das medidas em torno da média é menor Desvio médio Amplitude Medidas de dispersão Variância Coeficiente de variação Desvio padrão Figura 23 Todas as informações necessárias para o estabelecimento das medidas de dispersão 49 BIOQUÍMICA CLÍNICA Com base nos dados estatísticos obtidos através de análises simples é possível aplicar um conjunto de regras e padrões que fornecerão os dados fidedignos voltados para o controle geral de qualidade Modelo probabilístico normal curva de Gauss Algumas variáveis contínuas exibem um comportamento muito particular quando visualizamos a distribuição de frequências de seus valores Concentração de valores em torno de um valor central simetria em torno do valor central frequência pequena de valores muito extremos O matemático alemão Carl Gauss popularizou um modelo proposto para a distribuição de probabilidades de variáveis do tipo descrito anteriormente A curva descrita por este modelo é conhecida como curva de Gauss ou também como curva normal A curva gaussiana é definida pela média µ e pelo desvio padrão σ Z z φz ϕZ Figura 24 Gráfico gaussiano clássico A utilização da técnica de distribuição de dados utilizados por Gauss mostra informações valiosas quando aplicadas às técnicas de controle de qualidade pois representa a extensão das variáveis a fim de serem minimizadas A distribuição normal é um modelo bastante útil na estatística e não seria uma surpresa pois a soma de efeitos independentes ou efeitos não muito correlacionados deveria se houvesse muitos desses se distribuir normalmente sempre sujeito a certos pressupostos Regras de Westgard O controle de qualidade CQ de regras múltiplas utiliza uma combinação de critérios de decisão ou regras de controle para decidir quando uma corrida analítica está sob controle ou fora de controle O procedimento de CQ de regras múltiplas de Westgard como é mais conhecido utiliza cinco regras de controle diferentes para julgar a aceitabilidade de uma corrida analítica Por comparação um procedimento de regra única de controle utiliza um único critério ou um único par de limites de controle assim como um gráfico de LeveyJennings com limites de controle calculados como x 2 DP média mais ou menos dois desvios padrão ou x 3 DP média mais ou menos três desvios padrão As regras de Westgard proporcionam maior sensibilidade do sistema na detecção de perdas de estabilidade Elas traduzem probabilidade estatística e quando violadas é necessário analisar os variados fatores envolvidos para encontrar a causa do problema e promover ações corretivas 50 Unidade I As regras de Westgard são geralmente utilizadas com duas ou quatro medições de controle por corrida o que significa que elas são apropriadas quando dois materiais de um controle diferentes são medidos uma ou duas vezes por material que é o caso em muitas aplicações bioquímicas Algumas regras de controle alternativas são mais apropriadas quando três materiais de controle são analisados o que é comum para aplicações em hematologia coagulação e imunoensaios Esses procedimentos são claramente mais complicados do que procedimentos de regras únicas o que é uma desvantagem Entretanto frequentemente oferecem melhores desempenhos do que os procedimentos de regras únicas 12s e 13s Há um problema de falso alarme com a regra 12s assim como o gráfico de LeveyJennings com limites de controle 2 DP Dados de controle Sob controle aprovar corrida analítica Fora de controle rejeitar corrida analítica Sim Sim Sim Sim Sim Sim Não Não Não Não Não Não 12s 13s R4s 22s 41s 10x Figura 25 Diferentes materiais de controle devem ser interpretados como diferentes níveis de controle As vantagens dos procedimentos de regras múltiplas são principalmente duas o número de falsas rejeições pode ser mantido baixo e ao mesmo tempo mantémse uma alta identificação de erros Isso é feito selecionandose regras individuais que tenham níveis de falsas rejeições muito baixos regras as quais quando utilizadas em conjunto aumentam a capacidade de identificação de erros é como realizar dois testes funcionais do fígado e diagnosticar um problema se um deles der positivo Um procedimento de regra múltipla utiliza dois ou mais testes estatísticos regras de controle para avaliar os resultados do controle de qualidade e então rejeitar uma corrida se qualquer um deles for positivo A regra 13s referese a uma regra de controle que é comumente utilizada com um gráfico de LeveyJennings quando os limites de controle calculados são x 3DP A corrida é rejeitada quando uma única medição de controle excede um dos limites 51 BIOQUÍMICA CLÍNICA 3DP 1DP Média 2DP 2DP 1DP 3DP 1 3 5 7 9 11 2 4 6 8 10 12 Regra 13s violada Figura 26 Regra de Westgard 13s A regra 12s referese a uma regra de controle que é comumente utilizada com um gráfico de LeveyJennings quando os limites de controle calculados são x 2DP No procedimento original de regras múltiplas de Westgard essa regra é utilizada como um alerta para acionar uma inspeção cuidadosa dos dados de controle por meio das seguintes regras de rejeição 3DP 1DP Média 2DP 2DP 1DP 3DP 1 3 5 7 9 11 2 4 6 8 10 12 Regra 12s violada Figura 27 Regra de Westgard 12s 52 Unidade I Regra 22s rejeitase quando duas medições de controle consecutivas excederem o mesmo limite de controle x 2DP ou x 2DP 3DP 1DP Média 2DP 2DP 1DP 3DP 1 3 5 7 9 11 2 4 6 8 10 12 Regra 22s violada Figura 28 Regra de Westgard 22s Regra 4s rejeitase quando uma medição de controle exceder o limite de controle x 2DP e a outra x 2DP em uma mesma corrida 3DP 1DP Média 2DP 2DP 1DP 3DP 1 3 5 7 9 11 2 4 6 8 10 12 Regra R4s violada Figura 29 Regra de Westgard 4s 53 BIOQUÍMICA CLÍNICA Regra 41s rejeitase quando quatro medições de controle consecutivas excederem o mesmo limite x 1DP 3DP 1DP Média 2DP 2DP 1DP 3DP 1 3 5 7 9 11 2 4 6 8 10 12 Regra 41s violada Figura 30 Regra de Westgard 41 Regra 10x rejeitase quando dez medições de controle consecutivas estiverem no mesmo lado em relação à média 3DP 1DP Média 2DP 2DP 1DP 3DP 1 3 5 7 9 11 2 4 6 8 10 12 Regra 10x violada Figura 31 Regra de Westgard 10x 54 Unidade I Regra 8x rejeitase quando oito medições de controle consecutivas estiverem no mesmo lado em relação à média 3DP 1DP Média 2DP 2DP 1DP 3DP 1 3 5 7 9 11 2 4 6 8 10 12 Regra 8x violada Figura 32 Regra de Westgard 8x Regra 12x rejeitase quando 12 medições de controle consecutivas estiverem no mesmo lado em relação à média 3DP 1DP Média 2DP 2DP 1DP 3DP 1 3 5 7 9 11 2 4 6 8 10 12 Regra 12x violada Figura 33 Regra de Westgard 12x Gráfico de LeveyJennings e aplicação das regras de Westgard O gráfico de LeveyJennings é um gráfico de controle em que os resultados da corrida analítica são plotados em função do tempo ou do número de corridas Ele é um importante aliado do profissional 55 BIOQUÍMICA CLÍNICA de laboratório no controle interno da qualidade ao evidenciar o estado do sistema analítico e ajudar a garantir a confiabilidade dos resultados entregues 0 1980 1990 2000 2010 2020 2030 1985 1995 2005 2015 2025 20 40 10 30 50 Resultado do teste 2 SD 1 SD Média 1 SD 2 SD Figura 34 Gráfico padrão de LeveyJennings Disponível em httpsbitly35Aww4b Acesso em 21 jun 2021 Por exemplo quando N 2 esperase que 9 de corridas com bons resultados sejam rejeitadas com N 3 esse valor é ainda maior aproximadamente 14 com N 4 esperamse quase 18 de falsas rejeições Isso significa que aproximadamente de 10 a 20 das corridas com bons resultados serão descartadas o que causa desperdício de tempo e esforço do laboratório Enquanto o gráfico de LeveyJennings com limites de controle 3DP tem uma taxa de falsa rejeição muito baixa apenas 1 com um N entre 2 e 4 sua capacidade de identificação de erros alarmes verdadeiros também será menor assim o problema com a regra de controle 13s será que erros clinicamente importantes não serão identificados 4 PERFIL BIOQUÍMICO RENAL E DOS FLUIDOS CORPORAIS Os rins apresentam uma série de funções de extrema importância para a manutenção da homeostase entre as quais podemos destacar excreção de produtos nitrogenados do metabolismo como a ureia e a creatinina bem como outros produtos do catabolismo de proteínas como o ácido úrico regulação da osmolalidade plasmática regulação da concentração de íons como sódio Na potássio K cálcio Ca2 magnésio Mg2 cloreto Cl bicarbonato HCO3 hidrogênio H e fosfatos HPO2 4 e H2PO 4 regulação do volume plasmático e da pressão arterial 56 Unidade I produção de eritropoetina pelas células intersticiais peritubulares responsáveis pela diferenciação da linhagem eritroide presentes na medula óssea produção de vitamina D ativa pela enzima 1αhidroxilase presente no túbulo proximal também conhecida como calcitriol que age sobre os receptores de diferentes órgãosalvo ação das prostaglandinas como vasodilatadoras na arteríola aferente aumentando a perfusão renal ação nos receptores tubulares inibindo o transporte de sódio e cloreto na alça de Henle promovendo a natriurese em contrapartida sua ação antagônica promove a diurese gliconeogênese jejum prolongado Em relação à estrutura macroscópica do sistema urinário podemos destacar os rins os ureteres a bexiga e a uretra Veia cava inferior Artéria aorta Artéria renal Rim Ureter Veia renal Bexiga Uretra Figura 35 Sistema urinário rins e vias urinárias 41 Estrutura microscópica dos rins e filtração renal Os rins estão localizados dentro da parede dorsal da cavidade abdominal na região médioposterior Cada rim filtra o sangue e o transforma em um ultrafiltrado a urina que por sua vez é direcionada para o ureter O ureter de cada rim conduz a urina para a bexiga urinária onde é armazenada até ser excretada pela uretra A uretra é formada por uma estrutura tubular curta que se conecta ao meio externo por 57 BIOQUÍMICA CLÍNICA meio do pênis ou na porção anterior da vagina Dois esfíncteres musculares circundam a base da uretra de modo a controlar a micção Nos bebês a micção é controlada pelo sistema nervoso autônomo assim quando a bexiga está cheia um reflexo espinal relaxa o esfíncter Cada rim contém mais de um milhão de néfrons os quais por sua vez são formados por pequenos túbulos e vasos conhecidos como glomérulo que emerge de uma arteríola aferente Os capilares glomerulares são revestidos pela cápsula de Bowman apresentando as seguintes estruturas túbulo contorcido proximal alça de Henle com um ramo descendente fino e um ramo ascendente grosso túbulo contorcido distal túbulos coletores e ductos coletores Glomérulo Cápsula de Bowman Túbulo contorcido proximal Túbulo contorcido distal Ramo ascendente da alça de Henle Ducto coletor Até o ureter Capilares peritubulares Alça de Henle Ramo descendente da alça de Henle Arteríola aferente Arteríola eferente Figura 36 Túbulos renais e vasos sanguíneos O néfron é a unidade funcional responsável pela formação da urina A urina é um ultrafiltrado modificado do plasma que se forma a partir dos capilares glomerulares para a cápsula de Bowman sendo produzido por três barreiras de filtração descritas a seguir membrana basal que controla a passagem de moléculas de acordo com o peso molecular e a carga podócitos que são células especializadas da Cápsula de Bowman cuja função é a manutenção da membrana basal e a filtração de moléculas carregadas negativamente capilares fenestrados que promovem uma barreira de filtração dos tipos celulares presentes no sangue 58 Unidade I Em condições normais a reabsorção tubular é de 1785 L ao dia ao passo que a excreção de urina é de 15 L ao dia Mas como o sangue é filtrado O sangue chega através dos rins pela artéria renal que se ramifica nas artérias interlobulares artérias arqueadas e nas artérias radiais corticais Essas por sua vez subdividemse em arteríolas As arteríolas aferentes levam o sangue para a primeira rede de capilares glomerulares onde ocorre a ultrafiltração O sangue então sai dos capilares glomerulares através das arteríolas eferentes que o conduzem para os capilares peritubulares que circundam o néfron Dos capilares peritubulares o sangue flui para pequenas veias que o drenam para a veia renal O volume médio de sangue filtrado gira em torno de 180 L o que corresponde a uma filtração glomerular de 125 ml por minuto ou seja 125 ml X 60 minutos X 24 horas 180000 mL Além disso para que ocorra o processo de filtração e a formação de ultrafiltrado no caso a urina é necessária uma força hidrodinâmica Biofisicamente falando a filtração glomerular sofre três pressões pressão hidrostática sanguínea pressão hidrostática urinária e pressão osmótica do sangue 42 Biomarcadores hidroeletrolíticos sódio e potássio Os eletrólitos são importantes componentes bioquímicos que controlam e mantêm o equilíbrio de nosso organismo Como principais agentes temos o sódio e o potássio os quais são componentes catiônicos presentes no líquido extracelular e intracelular respectivamente Regulados por diversos mecanismos de controle o sistema reninaangiotensinaaldosterona é um dos mais importantes meios de feedback para o controle a hipertensão arterial sódiodependente O sódio e o potássio são quantificados no soro humano por muitos métodos inicialmente pelo fotômetro de chama e por métodos enzimáticos Todavia atualmente destacamse os equipamentos automatizados que dispõem do módulo ISE eletrodos de íon seletivo Com a tecnologia da potenciometria os eletrodos específicos para cada marcador são dispostos no sistema e conforme a amostra soro do paciente circula nas tubulações e passa pelos eletrodos por diferença de potencial as concentrações de sódio e potássio são verificadas Seus valores de referência variam de 135 mEqL a 145 mEqL e 37 6 mEqL a 56 mEqL respectivamente 43 Biomarcadores de função e lesão renal Consideramos biomarcador toda substância ou molécula capaz de ser mensurada por meio de um exame clínico decorrente de uma doença ou outro estado fisiológico determinado em um indivíduo para fins de diagnóstico clínico e laboratorial Devemos considerar que os biomarcadores podem sofrer influência de fatores endógenos ou exógenos os quais muitas vezes podem levar à repetição do resultado laboratorial 59 BIOQUÍMICA CLÍNICA De acordo com Taal e Brenner 2006 os principais fatores que comprometem a função renal são diabetes mellitus hipertensão arterial sistêmica idade avançada tabagismo anemia dislipidemias obesidade e disfunção endotelial Vejamos agora alguns biomarcadores renais e suas aplicações no diagnóstico clínico 431 Creatinina Para estimar a taxa de filtração glomerular determinados compostos do catabolismo são de suma importância como a creatinina Mas para entender melhor a importância desse metabólito vamos entender como ele é formado Primeiramente tomemos creatina um antecessor no processo de formação da creatinina iniciada nos rins e finalizada no fígado A síntese de creatina começa nos rins com a combinação de dois aminoácidos a glicina e a arginina formando a guanidinoacetato Esse composto então vai para o fígado onde é metilado pela Sadenosilmetionina para formar a creatina Essa creatina formada no fígado se dirige para a corrente sanguínea e outros tecidos em particular para coração músculos e cérebro reage com o ATP para formar fosfocreatina ou fosfato e creatina Essa reação é catalisada pela creatinafosfoquinase conhecida como CK ou CPK do inglês creatine phosphokinase que por sua vez sofre ciclização espontânea ou seja uma reação não enzimática gerando então a creatinina que é filtrada livremente no glomérulo de 7 a 10 posteriormente é excretada na urina proveniente da secreção tubular Assim esse pequeno percentual é suficiente para estimar a taxa de filtração glomerular N O O P N N H2N P1 H2O H2O H3N H2C H3C H2C CH3 CH3 COO COO ADP ATP Creatina Fosfocreatina HN NH NH3 O O Glicina arginina Guanidinoacetato Creatinina Corrente sanguínea Creatinina Coração Músculo Cérebro Sadesilmetionina Sadesilmetionina H N Figura 37 Formação da creatinina 60 Unidade I 432 Ureia A ureia é certamente um dos principais metabólitos excretados na urina Mas antes de nos atentarmos a ela retomemos o conceito de proteínas Primeiramente vamos lembrar o conceito de proteínas o que são As proteínas são biomoléculas formadas por uma sequência de aminoácidos os quais por sua vez são ligados covalentemente por ligação peptídica Essa ligação é formada por uma reação de condensação entre o grupo carboxílico de um aminoácido e um grupo amina de outro aminoácido N N N N C C C C C H CH3 H O CH3 H H H H H H H H H H H C C C O O O OH H2O H2O OH OH Ligação peptídica Dipeptídeo Alanina Glicina Figura 38 Ligação peptídica A digestão de proteínas começa no estômago estimulando a mucosa gástrica a secretar gastrina responsável por estimular a produção de ácido clorídrico HCl pelas células parietais e a produção de pepsinogênio pelas células principais O ácido clorídrico atua como um agente desnaturante facilitando a ação das hidrolases Já o pepsinogênio forma inativa é convertido em pepsina forma ativa promovendo a remoção da extremidade aminoterminal da cadeia polipeptídica No estômago essa pepsina hidrolisa removendo o resíduo aminoterminal dos aminoácidos aromáticos como a tirosina fenilalanina e triptofano de forma que as ligações são rompidas em pequenos peptídeos Na sequência ocorre a produção de um hormônio a secretina que então estimula o pâncreas a secretar bicarbonato o qual se deslocará para o intestino delgado por meio do ducto pancreático promovendo o aumento do pH Ainda na porção superior do intestino delgado duodeno ocorre aliberação da colecistoquinina hormônio responsável pela estimulação da secreção de várias enzimas pancreáticas como o tripsinogênio o quimotripsinogênio e procarboxipeptidades forma inativa as quais são convertidas respectivamente em tripsina quimiotripsina e carboxipeptidades forma ativa promovendo cada uma ações proteolíticas específicas Além disso há a produção de uma proteína chamada de inibidor pancreático de tripsina que previne a destruição das células exócrinas do pâncreas por meio da ação proteolítica Dando continuidade ao processo a carboxipeptidase remove o resíduo carboxiterminal enquanto as aminopeptidades removem os resíduos aminoterminais gerando aminoácidos livres que entram nos capilares sanguíneos das vilosidades intestinais e são transportados para o fígado Quando esses aminoácidos chegam ao fígado sofrem ação enzimática pelas aminotransferases ou transaminases que apresentam um grupo prostético o piridoxal fosfato o qual remove o grupo αamino para os átomos de carbono do αcetoglutarato produzindo αcetoácido O αcetoglutarato forma o Lglutamato O glutamato presente nos hepatócitos sai do citosol para o interior da mitocôndria onde sofrerá a desaminação oxidativa pelo glutamato desidrogenase 61 BIOQUÍMICA CLÍNICA podendo então a amônia estar incorporada ao glutamato ou promover a sua liberação Esse processo fornece amônia para entrar no ciclo da ureia sendo esse composto eliminado pela urina e evitando sua toxicidade em particular para o cérebro Uma pequena parte da amônia NH3 30 µM a 60 µM é encontrada no sangue principalmente pelos aminoácidos alanina e glutamina Basicamente o ciclo da ureia consiste em cinco etapas com várias reações enzimáticas tudo isso descrito resumidamente a seguir síntese do carbamoilfosfato amônia bicabonato e ATP reagem para formar carbamoilfosfato catalisada pela enzima carbamoilfosfatosintetase I carbamoilfosfato reage com a ornitina para formar a citrulina citrulina reage com aspartato formando arginino succinato catalisada pela argininosuccinato sintetase clivagem da arginosuccinato pela enzima argininosuccinato liase formando fumarato e arginina clivagem da arginina pela arginase produzindo ureia e regeneração da ornitina Ciclo da ureia Argininosuccinato sintetase Argininosuccinato liase Figura 39 Ciclo da ureia Adaptada de Smith et al 2007 p 292 62 Unidade I 433 Ácido úrico O ácido úrico é um ácido fraco proveniente do catabolismo das purinas adenina e guanina que é metabolizado principalmente no fígado a partir da xantina e excretado pelos rins sendo empregado como marcador para várias anormalidades metabólicas e hemodinâmicas Dessa forma a degradação das purinas produz a hipoxantina e esta forma a xantina a qual sofre ação da xantinaoxidase formando o ácido úrico no plasma ele é encontrado como urato monossódico sua forma ionizada C C N HN C C NH2 O N N N N N H N H C C HC C CH CH Hipoxantina Xantina oxidase Xantina Ácido úrico H2N Adenina Guanina Purinas Figura 40 Formação do ácido úrico Tais biomarcadores suas dosagens séricas como a creatinina e a ureia são utilizados na avaliação indireta da função renal sendo considerados indicadores clássicos de problemas renais Vale acrescentar que também podem ser analisados os níveis de ácido úrico os quais em níveis elevados no sangue formam cristais de urato gerando precipitação nas articulações e provocando a artrite gotosa 434 Microalbuminúria Corresponde à excreção de albumina acima dos valores normais de referência detectados na urina isolada ou na urina de 24 horas esse parâmetro pode indicar insuficiência renal crônica A microalbuminúria está associada com uma elevada mortalidade por doença cardiovascular em pacientes diabéticos e não diabéticos A associação entre a sensibilidade à insulina e microalbuminúria tem sido demonstrada como a mesma em indivíduos normotensos e hipertensos Alguns estudos sugerem uma relação entre resistência à insulina e microalbuminúria em indivíduos não diabéticos que é parcialmente dependente de pressão arterial glicemia e obesidade A microalbuminúria é um importante fator de risco associado à nefropatia à retinopatia e à doença cardiovascular sendo um precioso marcador de dano vascular É importante atentar ainda para o fato de que a incidência de microalbuminúria é muita alta no diabetes tipo 2 ocorrendo já no momento do diagnóstico do diabetes em um grande número de indivíduos O diabetes tem sido demonstrado como a principal causa de doença renal no mundo sendo portanto de grande relevância a identificação precoce dos pacientes com elevado risco de desenvolver 63 BIOQUÍMICA CLÍNICA nefropatia diabética Isso é possível pela triagem sistemática através da avaliação da microalbuminúria Em relação às crianças diabéticas cerca de 20 delas podem desenvolver microalbuminúria como um sinal precoce de nefropatia incipiente Por fim é importante acrescentar que a retinopatia diabética está também comprovadamente associada com a microalbuminúria e com a hemoglobina glico A retinopatia diabética está também comprovadamente associada com a microalbuminúria e com a hemoglobina glicosilada 44 Avaliação da função renal em termos laboratoriais Do ponto de vista clínico a avaliação da função renal pode ser baseada em dois princípios básicos a função glomerular e avaliação da função tubular pois apresentam funções bem diferentes Sendo assim descreveremos resumidamente suas funções para entendermos do ponto de vista laboratorial como são feitas as análises e suas correlações com os possíveis diagnósticos No túbulo contorcido proximal ocorre o transporte ativo para a reabsorção de glicose e sódio além do transporte passivo para água e íons cloreto de modo a manter o equilíbrio osmótico aqui também se dá a absorção de aminoácidos e proteínas por transporte ativo Nesse segmento há a participação da bomba NaKATPase sódiopotássio ATPase e temos ainda a reabsorção do bicarbonato filtrado com sua posterior absorção para o sangue Já no túbulo contorcido distal temos a reabsorção de sódio controlada pela aldosterona processo que libera íons K ou H A eliminação dos íons H quando combinados com os íons fosfato ou com amônio promove a formação de bicarbonato No ducto coletor há a alteração da permeabilidade da água por meio das aquaporinas estimuladas pelo hormônio anidiurético ADH ocorrendo uma elevação da absorção de água 441 Secreção tubular e filtração glomerular A secreção tubular é a passagem de substâncias ou moléculas provenientes do sangue dos capilares peritubulares para o filtrado tubular Dessa forma há a regulação do equilíbrio ácidobase em face dos íons hidrogênio medicamentos que estão ligados a proteínas plasmáticas que por sua vez não foram filtrados pelo glomérulo Assim após a dissociação de suas proteínas transportadoras essas são então direcionadas para o túbulo contorcido proximal O primeiro ponto de partida é avaliar a taxa de filtração glomerular TFG isso porque através de equações matemáticas podemos mensurar os níveis de creatinina A TFG é definida como a capacidade renal de depurar uma substância a partir do sangue expressa de acordo com o volume de plasma determinado pela depuração em unidade de tempo dessa forma uma fração dos compostos que fazem parte principalmente do metabolismo proteico é excretada e outra fração de outros compostos que não obrigatoriamente fazem parte desse metabolismo são reabsorvidos Do ponto de vista clínico a TFG é de suma importância pois a partir dela podemos ter uma ideia das alterações fisiológicas e metabólicas bem como da hemodinâmica o que permite determinar o prognóstico de muitas patologias bem como definir a melhor estratégia terapêutica 64 Unidade I Para a determinação da TFG foram propostos vários modelos matemáticos mais de 46 fórmulas matemáticas Isso se deve em parte ao fato de a execução do exame depender da coleta de toda a urina no período de 24 horas o paciente não conseguir fazer a coleta adequada ou na própria execução do exame muitas vezes pode tornar nulo o resultado levando a erros e dessa forma invalidando o resultado laboratorial Vale lembrar que há uma associação com os níveis de creatinina sérica tais níveis quando dentro dos parâmetros da normalidade não descartam um comprometimento renal Vejamos agora as equações matemáticas mais utilizadas na determinação da TFG De acordo com a literatura da área como dito há mais de 46 fórmulas matemáticas mas a mais aceita e utilizada na clínica baseiase em dados específicos como níveis séricos de creatinina faixa etária sexo etnia e superfície corporal Contudo devemos lembrar que os valores obtidos por essas equações são uma estimativa ou seja os valores eou resultados obtidos apenas estão próximos da realidade dos resultados laboratoriais do paciente 442 Equação de CockcroftGault Essa equação foi descrita em 1973 a partir de um estudo feito com homens caucasianos na faixa etária aproximada de 57 anos No entanto dada a diferença da superfície corporal trabalhouse com um fator de correção para as mulheres de 085 mLmin Além disso outra dificuldade gerada é a exclusão de secreção tubular da creatina obesidade e sobrecarga de fluidos Alguns autores como Madero e Sarnak 2011 apontam que a obesidade reduz a massa muscular e por isso haveria uma redução na excreção diária de creatinina urinária principalmente quando comparado a um indivíduo com peso normal e condizente com a faixa etária Como essa equação baseiase na relação da redução da excreção da creatinina urinária com a faixa etária alguns autores enfatizam sua baixa acurácia para a determinação da TFG ainda que ela seja utilizada nos laboratórios de análises clínicas por ser um método barato principalmente quando utilizada em conjunto com equipamentos analíticos que aferem a creatinina sérica Mas então qual é a fórmula para se calcular a clearance de creatinina A fórmula descrita a seguir tem se mostrado a mais utilizada nos laboratórios de análises Depuração de creatinina ou clearance de creatinina creatinina urinária mgdL x volume urinário mlmin creatinina sérica mgdL Na equação de CockcroftGault atualizada a idade deve ser incluída em anos o peso corpóreo em quilogramas kg e a creatinina sérica em mgdL Depuração de creatinina 140 idade peso creatinina sérica 72 085 para mulheres É importante ressaltar que o resultado obtido deve ser corrigido para a superfície corporal de 173 m2 65 BIOQUÍMICA CLÍNICA Saiba mais A cimetidina inibidor da secreção de íons H no estômago usado para tratamento de úlcera gástrica e a trimetoprima um antibacteriano utilizado em associação com antibiótico para evitar a resistência bacteriana no combate a infecções usam aumento da creatinina sérica independente da TFG e inibem a secreção tubular da creatinina Você pode entender melhor o que acontece por meio do artigo indicado a seguir DALTON R N Creatinina sérica e taxa de filtração glomerular percepção e realidade Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial v 47 n 1 p 811 2011 Disponível em httpsbitly3vOTMWL Acesso em 22 jun 2021 443 Equação MDRD modification of diet in renal disease Essa equação foi desenvolvida em 1999 com base em dados de pacientes com doença renal crônica excluindo os pacientes saudáveis por meio de um contraste radiológico o iotalamatoI 125 Esse contraste iônico é aplicado por meio de infusão endovenosa e são realizadas várias coletas de amostras de sangue seguidas de coletas das diureses extremamente cronometradas Além disso esse contraste não é reabsorvido sendo facilmente filtrado pelo glomérulo Contudo como apresenta alta especificidade seu custo é elevado Essa equação estima precisamente a TFG usando variáveis como creatinina sérica idade etnia e gênero a fim de observar as diferenças causadas pela massa muscular No entanto quando essa equação é aplicada em diferentes grupos étnicos podem ocorrer redução da acurácia e da precisão Na sequência temos a equação do estudo MDRD completa TFG mLmin173 m2 170 x creatinina plasmática mgdL0999 x idade anos0176 x 0762 se mulher x 118 se negro x ureia plasmática mgdL017 x albumina plasmática gdL 0318 E a seguir sua versão simplificada TFG mLmin173 m2 186 x creatinina plasmática mgdL1154 x idade anos0203 x 0742 se mulher x 1212 se negro Já com a modificação para utilização com a creatinina calibrada a equação fica assim TFG mLmin173 m2 175 x creatinina plasmática mgdL1154 x idade anos0203 x 0742 se mulher x 1212 se negro 66 Unidade I 444 A equação CKDEPI chronic kidney disease epidemiology collaboration Essa equação foi desenvolvida em 2009 a partir da variação da fórmula MDRD a qual abrangeu indivíduos com ou sem doença renal por apresentar uma maior acurácia e menos viés Atualmente é bastante utilizada na área da nefrologia e exames laboratoriais A equação CKDEPI é expressa da seguinte forma TFG 141 x min CRsκ 1 α x máx CRsκ 1 1209 x 0993 idade x 1018 se mulher x 1159 se negro Onde CRs creatinina sérica mgdL κ 07 para mulheres ou 09 para homens α 0329 para mulheres ou 0411 para homens mín mínimo de CRsκ ou 1 máx máximo de CRsκ ou 1 Contudo alguns autores FLORKOWSKI CHEWHARRIS 2011 acreditam que essa equação na prática clínica pode não ser eficiente pelo fato de os pacientes poderem apresentar história clínica e fatores de risco diferentes em relação à doença renal crônica por isso são necessários uma boa avaliação clínica e resultados laboratoriais fidedignos a fim de determinar corretamente o diagnóstico do paciente Assim essa fórmula teria uma melhor aplicação para pacientes com doença renal crônica confirmada a fim de monitorar a doença 445 Equação de Schwartz específica para crianças Nessa equação a altura deve ser incluída em centímetros cm e a creatinina sérica em mcmolL TFG mLmin 055 alturacreatinina sérica Onde K 38 idade superior a um ano K 48 adolescentes 67 BIOQUÍMICA CLÍNICA Lembrete A quantidade de creatinina excretada por dia depende da quantidade da massa muscular corporal Sendo assim podemos encontrar níveis inferiores de creatinina em crianças e idosos devido à pouca massa muscular Além disso é necessário enfatizar que a determinação da creatinina em algumas etnias é diferente em razão de apresentar maior massa muscular Por isso é necessária a utilização da correta equação conforme os parâmetros adotados por cada uma delas BASTOS BASTOS PAULA 2007 Observação É possível calcular a clearance de creatinina sem a urina de 24 horas Sim por isso vimos as várias fórmulas que poderão ser aplicadas na análise do material biológico dos diferentes perfis de pacientes 446 Clearance de inulina A inulina é um marcador padrão ouro para estimar a TFG pois é considerada do ponto de vista fisiológico uma substância inerte a qual é livremente filtrada Além disso tratase de um polímero com peso molecular de 5200 daltons Contudo há uma limitação quanto a seu uso em razão do alto custo nas análises clínicas laboratoriais e da padronização do método pois é uma técnica altamente complexa e trabalhosa Quando a concentração de inulina na urina é medida e a formação da urina é determinada a velocidade de excreção da inulina pode ser calculada facilmente conforme a fórmula a seguir Quantidade excretadamin V x U Onde V taxa de formação da urina U concentração de inulina na urina 45 Marcadores séricos para monitoramento de doenças renais Vejamos agora os principais marcadores séricos para monitoramento de doenças renais e suas principais características 68 Unidade I Cistatina C Descrita pela primeira vez em 1961 pertence à superfamília das cistatinas tendo um peso molecular de 13359 daltons e composta de 120 aminoácidos formando uma cadeia polipeptídica simples Corresponde a uma proteína catiônica com ponto isoelétrico de 93 sendo dessa forma filtrada livremente pelos glomérulos Assim a Cistatina C é considerada um marcador precoce de lesão renal Por ser um marcador endógeno possibilita estimar a TFG sem a necessidade de coleta de urina Como desvantagem apresenta um custo elevado o que faz com que a dosagem sérica de creatinina seja a favorita para a análise laboratorial Por fim cabe destacar que o método utilizado para a dosagem é a imunoturbidimetria Lipocalina associada à gelatinase dos neutrófilos NGAL Identificada inicialmente pela técnica de Microarray diz respeito a proteínas que pertencem às superfamílias de lipocalinas encontradas em neutrófilos humanos ligadas covalentemente à gelatinase Possui uma sequência de 178 aminoácidos com formas monoméricas diméricas e triméricas podendo assim ser secretados pelos túbulos renais lesionados em particular a dimérica secretada pelos neutrófilos DEVARAJAN 2006 É expressa em vários tecidos como rins pulmões estômago e cólon em níveis muito baixos porém quando tais tecidos estão lesionados ou há uma infecção bacteriana há uma aumento significativo da sua expressão Tem se mostrado um bom indicador de lesão renal na medicina translacional NacetilbDglucosaminidase NAG Consiste em uma enzima lisossomal com aproximadamente 140 kDa presente em várias células e que catalisa a hidrólise de glicoproteínas É considerada um bom indicador de lesão renal por mostrarse sensível a lesões tubulares contudo pacientes com diabetes artritereumatoide e hipotireoidismo devem passar por uma análise criteriosa pois podem apresentar resultado falso positivo na determinação dessa enzima Kim1 kidney injury molecule1 Glicoproteína transmembrana apenas expressa em lesão renal como insuficiência renal aguda isquêmica e tóxica é considerada um bom marcador uma vez que não está expressa em rins normais e no processo de recuperação após lesão epitelial Interleucina18 Citocina próinflamatória de 24 kDa utilizada como indicador de necrose tubular aguda é clivada pela caspase1 que induz a síntese de interferon e outras citocinas inflamatórias além do fator de necrose tumoral Seu aumento é muito significativo pois elevase antes mesmo da creatinina sérica em pacientes com insuficiência renal aguda e com insuficiência respiratória aguda submetidos à ventilação mecânica Pode ser determinada no plasma ou na urina de 6 a 24 horas após lesão renal 69 BIOQUÍMICA CLÍNICA 46 O exame de urina tipo 1 aspectos fisicoquímicos O exame de urina de rotina inclui a análise das características físicas e químicas além da análise do sedimento Em cada etapa é analisado um parâmetro específico 461 Exame de características físicas As características analisadas na fase física incluem volume cor aspecto e densidade como veremos a seguir Volume Para a realização do exame de rotina de urina são necessários aproximadamente 15 ml de amostra Em algumas situações como no caso de paciente pediátrico a análise pode ser realizada com volumes menores Sabemos que o volume de urina depende da quantidade de água excretada pelos rins e esse parâmetro pode sofrer influência de diversos fatores como ingestão de líquidos perda de líquidos por fontes não renais variações na secreção do hormônio ADH etc Levando em consideração tais fatores o volume diário médio fica em torno de 1200 a 1500 ml Vale ressaltar que a medição do volume total da urina em 24 horas só é de interesse em função da dosagem de algumas proteínas ou para a verificação da função renal No exame de rotina o volume de interesse é de 15 ml no mínimo Alguns laboratórios não descrevem o volume urinário no laudo ficando apenas como critério de aceitabilidade da amostra O volume pode ser medido em um instrumento laboratorial chamado de proveta ou no próprio tubo de ensaio coletor Cor A cor da urina pode variar de incolor até preto Essa gama de variações pode decorrer de funções metabólicas normais pela atividade física por substâncias ingeridas como medicamentos ou por condições patológicas Normalmente a coloração de uma urina normal é amarelada resultante da excreção de três pigmentos presentes no nosso organismo urocromo amarelado uroeritrina rosa ou avermelhado e urobilina laranja produtos normais do metabolismo do organismo Aspecto O aspecto é um termo utilizado para descrever a transparência da urina A urina normalmente tem aspecto límpido o que pode ser observado mantendose o frasco de urina diante de um fundo branco e com uma boa fonte luminosa Esse parâmetro pode ser alterado para o aspecto turvo na presença de células urinárias cristais e leucócitos A terminologia utilizada para definir o aspecto da amostra inclui límpido opalescente ligeiramente turvo turvo e leitoso Devese tomar cuidado ao analisar esse parâmetro pois podem existir causas não patológicas para a alteração do padrão normal da urina como células escamosas de descamação do trato genital feminino muco contaminação fecal cremes vaginais e contraste radiológico tornando essa urina turva 70 Unidade I refrigeração e a má conservação da amostra também podem levar a uma turvação não patológica Já as causas patológicas estão relacionadas à presença de hemácias leucócitos leveduras e cristais Figura 41 Variação da coloração da urina Fonte Bidoia e Klimesch 2020 p 24 Densidade A densidade da urina está diretamente ligada à capacidade de reabsorção renal podendo também ser avaliada uma possível desidratação e até mesmo anormalidades do hormônio ADH Ela é medida com base na concentração das substâncias sólidas diluídas na urina na sua maioria os sais minerais presentes no fluido urinário em comparação com a densidade da água pura que é igual a 1000 gcm3 quanto mais próximo desse valor mais diluída a urina estará da mesma forma que quanto mais afastada mais concentrada ela estará É interessante assinalar que os valores normais variam de 1005 gcm3 a 1035 gcm3 Atualmente existem duas maneiras de medir a densidade uma pelo refratômetro e outra pela fita reagente que em alguns casos fica na parte do exame químico da urina O refratômetro vai avaliar a densidade determinando a concentração de partículas dissolvidas em uma amostra o que é chamado de índice de refração ou índice refratométrico o qual se baseia na comparação da velocidade da luz no ar com a velocidade da luz em uma solução A concentração de partículas dissolvidas presentes na solução determina a velocidade do ângulo pelo qual a luz passa através de uma solução Para usar o refratômetro primeiro é necessária a calibração do aparelho feita com uma gota de água destilada e com o auxílio de ferramentas que vêm com o aparelho ajustada para o número 1000 Após esse ajuste colocase uma gota de urina sobre o prisma azul obtendose então a leitura da densidade da urina 71 BIOQUÍMICA CLÍNICA 462 Exame de características químicas Nessa etapa os parâmetros analisados são pH proteínas hemoglobina glicose bilirrubinas urobilinogênio corpos cetônicos nitrito densidade e esterase leucocitária leucócitos Para isso podemos utilizar as fitas reagentes análise manual ou semiautomática do exame ou os aparelhos automatizados que existem atualmente nos laboratórios de análises clínicas A utilização das tiras reagentes permite de uma maneira rápida e fácil a realização das análises químicas da urina Existem no mercado diversas marcas de fita fazendo com que tenhamos uma certa variedade em relação ao número de parâmetros analisados às variações na sensibilidade e na especificidade e aos tipos de substâncias interferentes ficando a critério de cada laboratório escolher a mais adequada Já as análises realizadas em aparelhos automatizados requerem a utilização de fitas próprias de acordo com o fabricante As tiras reagentes fundamentamse em almofadas absorventes impregnadas com reagentes químicos que ficam fixadas a uma tira de plástico Figura 42 Modelo de fita reagente para análise de urina Fonte Bidoia e Klimesch 2020 p 29 Ocorre a reação química quando a urina entra em contato com a fita Os resultados podem ser interpretados comparandose a cor formada após a reação com uma tabela de cor padrão fornecida pelo fabricante Diversas cores ou intensidades de cores podem ser formadas para cada substância a ser testada na fita 72 Unidade I Os resultados podem ser interpretados então após a comparação cuidadosa dessas cores e um valor sem quantitativo de traços 1 2 3 ou 4 poderá ser relatado Para alguns parâmetros uma estimativa em miligramas por decilitros poderá ser descrita pH Como vimos uma das funções do rim é ajudar o corpo a manter o equilíbrio ácidobase Para que o nosso organismo consiga manter o pH constante no sangue cerca de 740 o rim deve variar o pH a fim de compensar a influência dos alimentos da dieta e dos produtos do metabolismo Essa compensação ocorre pela secreção de hidrogênio H e de ácidos orgânicos fracos além da reabsorção de bicarbonato do ultrafiltrado pelos túbulos contornados Se o organismo apresentar uma acidose excesso de ácido uma maior quantidade de H será secretada fazendo com que a urina se torne ácida Já se houver uma alcalose excesso de base uma menor quantidade de H será secretada fazendo com que a urina se torne alcalina O pH normal da urina pode variar entre 46 e 80 A dosagem de pH na fita reagente é baseada em uma reação química na qual um sistema de indicador duplo de vermelho de metila e azul de bromotimol irá reagir com a amostra e indicar através da variação de cor o pH da urina Essa variação de cor ocorre quando o vermelho de metila muda para a cor amarela na faixa de pH entre 4 e 6 e o azul de bromotimol vira de amarelo para azul na faixa entre 6 e 9 Vermelho de metila H azul de bromotimol H vermelho alaranjado amarelo verde azul pH 60 segundos 50 65 75 60 70 80 85 Figura 43 Variações de resultados da fita reagente para o parâmetro pH Adaptada de Mundt e Shanahan 2012 p 37 Devemos tomar certo cuidado para não umedecer demais a fita reagente para que o tampão ácido da proteína não escorra na placa do pH tornandoa laranja É importante esclarecer ainda que o crescimento bacteriano pode tornar o pH alcalino devido ao fato de a ureia ser convertida em amônio Urinas ácidas por sua vez são encontradas em condições de dieta rica em proteína acidose metabólica ou respiratória e uso de certos medicamentos Proteína A alta concentração de proteínas na urina ou a excreção de determinados medicamentos pode indicar comprometimento renal As alterações podem ser detectadas por fitas reagentes análise qualitativa ou por espectrofotômetros análise quantitativa Essas dosagens podem indicar o 73 BIOQUÍMICA CLÍNICA prognóstico do paciente portador de glomerulopatias doenças autoimunes mieloma e outros tumores como o uroepitelial Glicose A causa mais comum é o diabetes mellitus no entanto algumas gestantes podem apresentar tal quadro em um determinado período da gestação Mas caso o quadro persista a paciente deverá fazer um acompanhamento mais meticuloso com um endocrinologista Outras patologias como a síndrome de Fanconi também dificultam a reabsorção da glicose levando à grande liberação desse substrato por meio da urina Cetonas ou corpos cetônicos A presença de corpos cetônicos na urina acetona 2 ácido acetoacético 20 e ácido betahidroxibutírico 78 indica que os ácidos graxos estão sendo utilizados como fonte de energia e não os carboidratos caso de dietas jejum prolongado desidratação vômitos diarreias e em pacientes com diabetes mellitus descompensada MUNDT SHANAHAN 2012 A verificação de cetonas na urina ocorre por uma reação química em que é utilizado como reagente o nitroprussiato de sódio que irá reagir com o ácido betahidroxibutírico produzindo uma mudança de cor conforme a reação indicada a seguir Ácido acetoacético nitroprussiato de Na glicina pH alcalino cor violeta púrpura Sangue O sangue pode ser identificado na urina pela presença de hemácia íntegra hematúria e de hemácia lizada e a reação é positivada pela presença de hemoglobina hemoglobinúria Normalmente não é observada a presença de sangue na urina Quando a fita reagente está positiva devese investigar a causa e a origem dessa alteração anormal A hematúria indica um sangramento em qualquer parte do trato urinário desde o glomérulo até a uretra podendo ter como causa infecções tumor trauma cálculo renal glomerulonefrites nefrites ou o uso de anticoagulantes Já a hemoglobinúria indica uma hemólise intravascular Sangue 60 segundos Negativo Traços Baixo 1 Moderado 2 Alto 3 Hemolisado Traços não hemolisados Moderado não hemolisado Figura 44 Variações de resultados da fita reagente para o parâmetro sangue Adaptada de Mundt e Shanahan 2012 p 43 74 Unidade I Bilirrubina A bilirrubina é um pigmento derivado da degradação da hemoglobina Essa degradação ocorre no sistema reticuloendotelial principalmente do baço e do fígado A degradação libera componentes como ferro e proteínas que serão absorvidas pelo organismo e protoporfirina que será convertida em bilirrubina A bilirrubina formada então ligase à albumina na corrente sanguínea passando a ser chamada de bilirrubina indireta ou insolúvel deslocandose em direção ao fígado Nessa etapa a bilirrubina não é reabsorvida pelo rim pois além de estar ligada à albumina é insolúvel em água No fígado a bilirrubina é conjugada ao ácido glicurônico pela enzima glucoronil transferase transformandose em bilirrubina direta ou conjugada que passa a ser solúvel em água sendo possível ser excretada no fígado através do ducto biliar para o duodeno No intestino as bactérias intestinais reduzem a bilirrubina em urobilinogênio e estercobilinogênio que são oxidados e excretados nas fezes sob forma de urobilina Em pacientes normais não é observada a presença de bilirrubina na urina Quando isso ocorre é indicativo de obstrução do ducto biliar ou alteração hepática pois acontece o refluxo de bilirrubina conjugada para a circulação Na fita reagente a reação que ocorre é a reação de diazo na qual há uma mudança de cor de marromclaro para violeta Urobilinogênio Conforme visto no processo de sua formação assim que a bilirrubina chega ao intestino bactérias intestinais reduzemna a urobilinogênio e estercobilinogênio Uma parte do urobilinogênio é reabsorvida do intestino voltando para o fígado e excretada de volta para o intestino Nessa fase quando o urobilinogênio faz a recirculação no fígado ele passa obrigatoriamente pelos rins sendo filtrado pelo glomérulo Portanto uma pequena quantidade de urobilinogênio aparece na urina em pacientes saudáveis Já o estercobilinogênio que não pode ser reabsorvido fica no intestino e sofre oxidação transformandose em urobilina e então sendo excretado nas fezes Nitritos A pesquisa de nitrito na urina em um primeiro momento pode significar a presença de bactérias portanto uma infecção do trato urinário ITU Esse teste indica a presença de bactérias que reduzem o nitrato que está presente na composição da urina a nitrito Como exemplo temos as bactérias gramnegativas Escherichia coli Proteus Klebsiella Citrobacter e Aerobacter além de algumas cepas de Pseudomonas e raras de Staphylococcus e Enterococcus Cabe ressaltar que nem todas as bactérias causadoras de infecção urinária reduzem o nitrato a nitrito como o Staphylococcus saprophyticus o Enterococcus faecalis e as leveduras Por isso devese ter cuidado ao analisar o teste de nitrito uma vez que o paciente pode apresentar uma infecção e o 75 BIOQUÍMICA CLÍNICA parâmetro se mostrar negativo A verificação de nitritos nas tiras reagentes está baseada na reação de Griess em que qualquer intensidade da coloração rosa é positiva Ácido para arsanílico NO2 Ácido sal diazônio Sal diazônio tetrahidrobenzoquinolina Ácido azodye róseo Leucócitos ou esterase leucocitária A pesquisa de leucócitos na urina é útil para detectar processos infecciosos ou inflamatórios do trato urinário pielonefrite ou cistites Os leucócitos possuem em seu interior enzimas chamadas de esterase que podem ser detectadas pelas fitas reagentes através das reações descritas a seguir Reação A Indoxil ou pirrol éster de ácido carbônico Esterase Granulocítica Indoxil ou pirrol Reação B Indoxil ou pirrol sal de diazônio púrpura Observação O resultado do exame de urina tipo I é dependente de uma coleta da amostra realizada de maneira adequada Recomendase que o paciente esteja com retenção da diurese por aproximadamente 24 horas para exames de urgência e emergência Esse teste é vital principalmente para diagnosticar os pacientes que adentram os serviços hospitalares de pronto atendimento com sintomas relacionados à infecção do trato urinário A avaliação da função renal é importante para fins de prognóstico emonitoramento de doenças renais A seguir são descritas algumas doenças associadas aos parâmetros laboratoriais A insuficiência renal é a diminuição da taxa de filtração glomerular ou do volume urinário Pode ser classificada como aguda ou crônica As causas da insuficiência renal aguda IRA são classificadas em três grupos prérenal intrínseca e pósrenal Cerca de 60 são prérenais que são caracterizadas por cirrose insuficiência cardíaca e sepse É possível determinar a insuficiência renal aguda da crônica Sim Podese estimar pela TFG por meio da equação MDRD A hiperuricemia corresponde ao aumento dos níveis de ácido úrico A mais conhecida é a gota ou artrite gotosa Existem outras patologias associadas ao aumento do ácido úrico como as leucemias policitemia mieloma múltiplo e ao uso de alguns antiinflamatórios 76 Unidade I Já a hipercreatinemia ocorre pela diminuição da excreção urinária e portanto aumento dos níveis séricos Os níveis de creatinina são observados em pacientes com diabetes melito não controlado com insuficiência cardíaca congestiva hipertireoidismo lesão glomerular e hipertrofia prostática entre outros 47 Líquidos cavitários Os líquidos cavitários também conhecidos como líquidos serosos estão situados nas cavidades fechadas do organismo a cavidade peritoneal a cavidade pleural e a cavidade pericárdica Todas essas cavidades são revestidas por membranas chamadas de membranas serosas que recobrem cada órgão e a parede corporal A membrana que recobre a parede da cavidade é chamada de membrana parietal e a que recobre os órgãos é denominada membrana visceral Entre essas membranas encontrase o líquido seroso que tem a função de lubrificar o espaço entre as membranas permitindo a movimentação desses órgãos e diminuindo assim o atrito entre eles Um exemplo dessa movimentação é a expansão e a contração dos pulmões O líquido seroso tem origem na ultrafiltração do plasma que mantém suas características sem que nenhuma outra substância seja adicionada pelas células mesoteliais do revestimento das membranas nesse ultrafiltrado Portanto a composição do líquido é similar à do plasma sanguíneo Como dito o equilíbrio entre as pressões coloidosmótica e hidrostática faz com que o fluido fique localizado entre as membranas e a manutenção do volume desse líquido em situações fisiológicas depende do aumento da pressão coloidosmótica nos capilares que favorece a reabsorção do líquido de volta para os capilares mantendo o volume normal do líquido entre as membranas Caso ocorra qualquer desbalanço entre essas pressões o líquido aumentará e haverá a formação do derrame Para que ocorra a formação do derrame cavitário é preciso que haja aumento da pressão hidrostática insuficiência cardíaca congestiva diminuição da pressão oncótica da microcirculação hipoproteinemia aumento da permeabilidade capilar inflamação e infecção e obstrução linfática tumores A análise laboratorial do líquido cavitário inclui coleta análise física análise bioquímica análise citológica e análise microbiológica A origem e a classificação desse líquido em transudato e exsudato são os primeiros passos para um diagnóstico inicial pois dependendo dessa classificação será necessário realizar exames laboratoriais mais específicos que variam entre os líquidos ANGELERI et al 2016 O transudato tem suas causas no desequilíbrio da filtração e da reabsorção do líquido como as mudanças na pressão hidrostática criadas na insuficiência cardíaca congestiva e a diminuição da pressão oncótica plasmática na insuficiência hepática e na síndrome nefrótica causada por hipoproteinemia Já os exsudatos são produzidos por condições inflamatórias que envolvem danos às paredes dos vasos danos nas membranas das cavidades e diminuição da reabsorção pelo sistema linfático como nas infecções e nas neoplasias Quando o líquido é classificado como exsudato outras análises serão necessárias para descobrir a doença de base geralmente bacterioscópica e cultura citomorfológica diferencial além de pesquisa de células tumorais 77 BIOQUÍMICA CLÍNICA A classificação mais utilizada hoje para diferenciar laboratorialmente um transudato de um exsudato é o critério de Light sensibilidade de 98 especificidade de 83 que se baseia na relação da concentração de alguns analitos no líquido e no soro São dosadas proteína e desidrogenase láctica LDH e de acordo com os resultados a classificação é feita conforme mostra a tabela a seguir Tabela 1 Critérios de Light para a diferenciação laboratorial de transudatos e exsudatos em líquidos cavitários Diferenciação laboratorial de transudatos e exsudatos Aspecto Transudato Exsudato Límpido Turvo Relação de proteína fluido soro 05 0 5 Relação de LDH fluido soro 06 06 Contagem de glóbulos brancos 350µL 350µL Gradiente de albumina soro ascite GASA 06 06 471 Análise bioquímica dos principais líquidos cavitários Análise bioquímica do líquido peritoneal ou ascítico A coleta do líquido peritoneal é chamada de paracentese e é realizada pelo médico através de uma punção aspirativa estéril no quadrante inferior esquerdo no ponto central em uma linha imaginária que passa na crista ilíaca superior à cicatriz umbilical e longe dos vasos hipogástricos O líquido é transferido para tubos específicos para cada análise e enviado imediatamente após a coleta para o laboratório Um tubo contendo o anticoagulante etilenodiaminotetracético EDTA será utilizado para a contagem das células e o diferencial um tubo sem anticoagulante será utilizado para as dosagens bioquímicas imunológicas e de cultura microbiológica e uma seringa heparinizada será utilizada para dosar o pH As amostras devem ser analisadas logo após a coleta Caso isso não seja possível deverão ser armazenadas e conservadas sob refrigeração entre 2 ºC e 8 ºC por no máximo 48 horas As dosagens bioquímicas mais comuns utilizadas para avaliação do líquido peritoneal são as de glicose LDH e proteínas O valor da dosagem da albumina no líquido é representado da seguinte forma Albumina sérica albumina líquido ascítico GASA gdL Os valores normais para a glicose são semelhantes aos valores séricos do paciente se estão abaixo indicam peritonite bacteriana e tuberculosa nas neoplasias A dosagem de LDH possui correlação clínica para a diferenciação entre transudato e exsudado quando a relação entre a concentração do soro e a do líquido é realizada através dos critérios de Light modificados 78 Unidade I Vejamos os critérios para diferenciação das ascites Proteína do líquidoproteína sérica 05 LDH líquidoLDH soro 06 Dosagem da LDH líquido 400 UL Se apenas dois ou três desses critérios forem preenchidos considerase exsudato Outros analitos podem ser dosados em situações especiais A dosagem de fosfatase alcalina sofre elevação quando há perfuração do intestino delgado A amilase também pode ser dosada e quando elevada indica perfuração esofágica e adenocarcinoma na pancreatite e na necrose intestinal A análise citológica é um importante parâmetro na avaliação dos exsudatos pois detecta células neoplásicas de origem primária ou metástase A análise citológica é realizada em um esfregaço corado e nela são feitas a identificação e a contagem das células quando aumentadas é realizada a contagem diferencial para verificar qual tipo celular é predominante e com isso identificar as possíveis causas As células neoplásicas também são identificadas sendo um importante parâmetro para descobrir a origem da neoplasia que geralmente é gastrointestinal da próstata e do ovário As células mais comuns observadas são leucócitos hemácias células mesoteliais e macrófagos Análise bioquímica do líquido pleural A coleta do líquido pleural é chamada de toracocentese e é realizada pelo médico através de uma punção aspirativa estéril na região subescapular sempre na borda superior do arco costal para evitar o feixe vásculonervoso O líquido é transferido para tubos especiais específicos para cada análise e enviado imediatamente após a coleta para a análise no laboratório Um tubo contendo o EDTA será utilizado para a contagem das células e o diferencial um tubo sem anticoagulante será utilizado para as dosagens bioquímicas imunológicas e de cultura microbiológica uma seringa heparinizada será utilizada para dosar o pH As amostras devem ser analisadas logo após a coleta Caso isso não seja possível deverão ser armazenadas e conservadas sob refrigeração entre 2 ºC e 8 ºC por no máximo 48 horas As dosagens bioquímicas devem ser realizadas para avaliação de pH glicose proteínas adenosina deaminase ADA amilase e LDH A dosagem de triglicérides também pode ser utilizada para confirmar a presença de um derrame quiloso Os critérios de Light são muito utilizados para diferenciar um transudato de um exsudato no líquido pleural A seguir estão os parâmetros para a diferenciação entre transudato e exsudato baseada noscritérios de Light líquido pleural Relação proteína líquido pleuralproteína sérica 05 Proteína líquido pleural 30 gdL 79 BIOQUÍMICA CLÍNICA Relação LDH no líquido pleural 23 do limite superior da normalidade da LDH sérica Relação de LDH fluido soro 06 transudato 06 exsudato Glicose valor normal acima de 60 mgdL O valor de pH normal varia de 68 a 76 Abaixo disso pode indicar a necessidade de drenagem ou o uso de antibióticos nos casos de pneumonia Nos casos de acidose o pH do líquido pleural deve ser comparado com o pH sanguíneo caso apresente uma variação de 03 abaixo do pH sanguíneo teremos um achado significativo O valor normal para a glicose varia de 70 mgdL a 99 mgdL Abaixo disso indica tuberculose inflamação reumatoide e infecções purulentas Os valores normais para proteína vão até 29 mgdL acima de 30 mgdL já é sugestivo de exsudato A ADA enzima relacionada com o metabolismo e a proliferação dos linfócitos é de alta sensibilidade e especificidade Está aumentada em 95 dos derrames pleurais por tuberculose encontrase também aumentada no empiema e muito elevada nos linfomas Em caso de ADA 60 Ul é praticamente confirmado o diagnóstico de tuberculose já ADA 40 UI exclui tal possibilidade Níveis elevados de amilase estão associados a pancreatite e a amilase na maioria das vezes elevandose primeiro no líquido pleural Esse aumento pode também indicar uma ruptura esofágica em neoplasias Os níveis de LDH no líquido pleural com concentrações maiores que o nível de LDH no plasma são indicativos de exsudatos sugerindo a presença de doença inflamatória ou neoplásica Análise bioquímica do líquido sinovial Na análise bioquímica são dosadas as concentrações de glicose proteína ácido úrico e LDH As concentrações de glicose no líquido sinovial são semelhantes às plasmáticas Por isso a interpretação adequada dos valores de glicose do líquido sinovial requer uma comparação com os níveis séricos da glicose em jejum Em condições normais e na maioria das circunstâncias não inflamatórias a diferença é menor que 10 mgdL Diferenças significativas são encontradas nos processos inflamatórios e infecciosos maior que 40 mgdL Os valores da glicose podem ser mascarados pela glicólise quando da presença de um grande número de leucócitos A concentração normal de proteínas varia de 12 gdL a 25 gdL Valores aumentados são encontrados em processos inflamatórios e sépticos Durante a fase inflamatória proteínas maiores como o fibrinogênio entram no líquido sinovial O ácido úrico no líquido sinovial varia de 6 mgdL a 8 mgdL e a presença de valores aumentados faz o diagnóstico de gota Geralmente esse aumento do ácido úrico está relacionado com a presença de cristais 80 Unidade I A dosagem da LDH se mostra elevada na existência de artrites reumatoides artrite infecciosa e gota Nesses casos os níveis plasmáticos podem estar normais A presença de muitos leucócitos nos processos inflamatórios infecciosos contribui para aumentar a concentração da LDH O valor normal para a LDH é menor que o da sérica 240 UL 480 UL Análise bioquímica do liquor líquido cefalorraquidiano Na análise bioquímica as concentrações de glicose proteína lactato e LDH são dosadas rotineiramente no exame do liquor e fornecem informações fidedignas para uma correta interpretação clínica A glicose entra no liquor através de transporte facilitado pelas células endoteliais além de atravessar um gradiente por difusão simples A concentração normal de glicose no liquor corresponde a 23 da glicemia ou 60 mgdL Os níveis de glicose são utilizados para diferenciar meningites bacterianas de virais A diminuição da concentração de glicose hiperglicorraquia é resultado de processos infecciosos pois tanto leucócitos quanto microrganismos consomem a glicose como fonte de energia hipoglicemia e carcinoma metastático As proteínas presentes no liquor são derivadas das proteínas plasmáticas que são transportadas pelas células endoteliais das meninges e pela síntese intratecal constituídas em grande parte de albumina e em muito menor quantidade de globulina A dosagem de proteína é útil para detectar doenças do sistema nervoso central que estão associadas com o aumento da permeabilidade da barreira hematoencefálica ou a intratecal de imunoglobulinas Os valores normais para proteínas variam de 10 mgdL a 45 mgdL em adultos e 15 mgdL a 60 mgdL em recémnascidos A hiperproteinorraquia é a mais comum de acontecer e está presente em infecções hemorragias intracranianas esclerose múltipla neoplasias e condições inflamatórias Níveis reduzidos de proteína podem aparecer em perda de volume do liquor ruptura dural e hipertireoidismo A eletroforese de proteína pode ser realizada no liquor e indicará quais frações estão presentes assim como a concentração de cada uma delas O lactato encontrado no liquor é predominantemente produzido pela glicólise anaeróbica do sistema nervoso central e é independente do lactato sanguíneo A dosagem de lactato no liquor foi proposta como um teste para diferenciar a meningite bacteriana da viral A concentração normal de lactato varia de 11 mgdL a 22 mgdL O aumento de lactato no liquor indica situações em que há hipóxia do sistema nervoso central como no infarto cerebral no trauma encefálico na isquemia na hemorragia e em meningites 81 BIOQUÍMICA CLÍNICA Para a diferenciação das meningites encontramos o lactato com uma concentração de até 30 mgdL nas meningites virais e acima de 35 mgdL nas meningites bacterianas fúngicas e tuberculosas Os níveis de lactado se tornam mais importantes quando temos coloração gramnegativa com predomínio de polimorfonucleares e dosagem de glicose baixa A LDH é uma enzima citoplasmática que está presente na maioria dos tecidos do corpo humano sendo útil para diferenciar uma punção traumática de uma hemorragia preexistente já que na punção traumática com hemácias íntegras não ocorre a liberação e o aumento da LDH Alguns estudos têm demonstrado que pacientes que possuem patologias de origem neoplásica e infecções bacterianas apresentam níveis elevados de LDH no liquor quando comparados aos valores de pacientes normais Análise bioquímica do líquido seminal O sêmen é composto de células e do plasma seminal Nesse plasma encontramos várias substâncias que fornecem suporte nutricional para os espermatozoides e substâncias que são produzidas nas glândulas acessórias como vesícula seminal e próstata Embora existam testes para a determinação desses marcadores não se sabe ainda ao certo o papel de cada um deles A exceção a essa regra é a determinação da frutose um açúcar presente no plasma seminal que consiste na fonte de energia dos espermatozoides A frutose pode estar ausente ou diminuída em várias condições que causam infertilidade masculina A ausência de frutose pode indicar ausência congênita bilateral dos canais deferentes ou obstrução bilateral dos ductos ejaculadores O pH do sêmen reflete o equilíbrio entre as secreções da vesícula seminal alcalina da próstata ácida e das glândulas bulbouretrais O pH é medido com a fita de pH após 30 minutos da coleta pois pode ser influenciado pela perda de CO2 O pH de um sêmen normal deve ser maior que 72 Pacientes com prostatites apresentam pH maior acima de 75 Já em pacientes com alteração na vesícula seminal e nos ductos ejaculatórios os valores ficam abaixo de 70 82 Unidade I Resumo Atualmente as técnicas em bioquímica clínica nos laboratórios de rotina diagnóstica são praticamente 100 automatizadas Com equipamentos modernos e baseados principalmente em métodos colorimétricos na nefelometria e na turbidimetria os interferentes préanalíticos são desafiantes para o diagnóstico correto A utilização de técnicas adequadas no processo de coleta e manuseio da amostra é essencial para evitar danos ao material Dentro da área técnica na fase analítica os equipamentos e diferentes analitos devem ser submetidos a controles internos de qualidade respeitandose os critérios estabelecidos na curva de Gauss gráficos de LeveyJennings e regras de Westgard Aplicando todo esse conhecimento nos diferentes perfis bioquímicos o biomédico tem condições e segurança para liberar resultados de exames de forma assertiva Discutimos também sobre perfil renal testes e exames aplicados na avaliação de funçãolesão renal Vimos ainda que a análise dos líquidos biológicos permite diagnosticar várias condições patológicas desde que realizada de maneira correta A coleta é um passo importantíssimo para que as interferências não prejudiquem a análise física química e celular permitindo assim a liberação de um laudo exato Essas condições préanalíticas são imprescindíveis pois 70 das decisões clínicas são feitas com base nos resultados dos exames e dos fluidos corporais evidenciando a importância dos testes bioquímicos no diagnóstico diferencial de meningites em alterações de função renal e metabólicas ressaltando e trazendo à luz os principais marcadores bioquímicos aplicados ao diagnóstico de doenças renais e infecciosas 83 BIOQUÍMICA CLÍNICA Exercícios Questão 1 Leia o texto a seguir Para o seu rastreamento o exame citológico proposto por Papanicolaou 1941 baseiase em uma metodologia de diagnóstico presuntivo e preventivo para a detecção do câncer do colo de útero e suas lesões precursoras Como é um procedimento totalmente manual desde a coleta do material até a liberação do resultado pelo laboratório sua vulnerabilidade a erros é considerável e pode interferir na acurácia do diagnóstico Desse modo as etapas que compreendem a coleta a fixação a coloração do esfregaço a montagem da lâmina e a subjetividade na interpretação dos resultados são fatores que podem comprometer drasticamente a sensibilidade do exame No Brasil o Ministério da Saúde na tentativa de aumentar a eficácia do rastreamento e diagnóstico do câncer do colo útero tem implantado sistemas de controle de qualidade interno e externo nos laboratórios que realizam exames para o Sistema Único de Saúde SUS os quais visam garantir a organização e a integridade de qualidade do serviço prestado Na fase préanalítica são avaliados os procedimentos técnicos relacionados à qualidade de confecção de esfregaço fixação coloração e montagem Essas etapas de execução podem influenciar significativamente a qualidade do laudo e a produtividade entre os observadores SILVA G P F et al O impacto da fase préanalítica na qualidade dos esfregaços cervicovaginais Revista Brasileira de Análises Clínicas v 49 n 2 p 135140 2017 com adaptações Com base na leitura e nos seus conhecimentos avalie as afirmativas I A fase préanalítica consiste em um conjunto de ações que visam garantir a representatividade e a adequabilidade da amostra II Devem ser adotados critérios padronizados de controle interno da qualidade que contemplem o registro do material recebido a fixação a coloração e a montagem das lâminas III A conscientização dos profissionais envolvidos e o conhecimento de cada etapa da fase préanalítica são de grande relevância para garantir melhor confiabilidade dos resultados citológicos É correto o que se afirma em A I apenas B II apenas C III apenas D I e II apenas E I II e III Resposta correta alternativa E 84 Unidade I Análise das afirmativas I Afirmativa correta Justificativa de fato a fase préanalítica demanda ações e cuidados na detecção na classificação e na adoção de medidas para a redução das falhas garantindo a representatividade e a adequabilidade da amostra Esses processos podem ser aprimorados pela disponibilização de instruções escritas ou verbais em linguagem simples e pelas orientações quanto ao preparo e à coleta da amostra II Afirmativa correta Justificativa a fase préanalítica envolve determinados procedimentos e a adoção de critérios internos que visam aprimorar o preparo e a coleta da amostra por meio de instruções escritas ou verbais feitas em linguagem simples e de cuidados na manipulação dos materiais Assim haverá padronização do controle interno da qualidade desde o registro do material recebido passando pela fixação pela coloração e pela montagem das lâminas III Afirmativa correta Justificativa segundo o texto como é um procedimento totalmente manual desde a coleta do material até a liberação do resultado pelo laboratório sua vulnerabilidade a erros é considerável e pode interferir na acurácia do diagnóstico Logo os profissionais envolvidos devem estar bem treinados quanto às técnicas e às etapas a serem desenvolvidas estando conscientes de suas responsabilidades para garantir a confiabilidade necessária aos resultados citológicos Questão 2 Leia o texto a seguir De acordo com Xie et al 2020 os pacientes com provável infecção por SARSCoV2 podem apresentar resultados iniciais negativos na RTPCR por diversas razões mas principalmente pela extração inadequada de ácido nucleico e a insuficiência de material celular para a detecção do vírus Ressaltase que ainda não se sabe o intervalo dos níveis virais na covid19 e o tempo ideal para realizar a coleta do material Nesse contexto cabe frisar que é indicada a realização da RTPCR na fase aguda da doença entre o primeiro ao oitavo dia do surgimento dos sintomas para o diagnóstico da covid19 visto que após esse período ocorrem o aumento da produção de anticorpos inicialmente IgM e a diminuição da carga viral Dessa forma o resultado pode ser falsonegativo OLIVEIRA E S MATOS M F DE MORAIS A C L N Perspectiva de resultados falsonegativos no teste de RTPCR quando realizado tardiamente para o diagnóstico de covid19 InterAmerican Journal of Medicine and Health v 3 e202003016 p 17 2020 com adaptações 85 BIOQUÍMICA CLÍNICA O texto faz referência a um teste empregado na detecção de muitas enfermidades e que ganhou papel de destaque no diagnóstico da covid19 embora falhas possam ocorrer Sobre esse exame e as suas características técnicas avalie as afirmativas a seguir I A RTPCR é uma reação que utiliza a enzima transcriptase reversa seguida de PCR atuando sobre uma molécula de RNA cadeia simples para sintetizar uma cadeia de DNA complementar cDNA II Após a definição do RNA a ser usado na reação e a síntese do cDNA está na hora de permitir que as proteínas fiquem acessíveis à detecção pelos anticorpos pela transferência delas de um gel para uma membrana adsorvente III Por meio da RTPCR é possível monitorar o progresso da PCR enquanto ocorre a reação e os dados são coletados em tempo real ao longo dos ciclos É correto o que se afirma em A I apenas B II apenas C III apenas D I e III apenas E I II e III Resposta correta alternativa D Análise das afirmativas I Afirmativa correta Justificativa de fato a Real Time Polimerase Chain Reaction RTPCR destacase da técnica original por não usar o DNA cadeia dupla no início da reação mas sim o RNA cadeia simples em associação com a transcriptase reversa II Afirmativa incorreta Justificativa o procedimento descrito ocorre em um teste de eletroforese e não de RTPCR O correto seria afirmar que após a síntese dos cDNA deveria ser aplicado o PCR ou seja usar essas fitas de DNA como molde para mais uma síntese de DNA nos ciclos subsequentes e depois de 25 ciclos de síntese de DNA os produtos são além do DNA que começou o processo milhares de cópias da sequênciaalvo específica 86 Unidade I III Afirmativa correta Justificativa essa condição da técnica é verdadeira e corresponde a uma vantagem grande em relação a outros procedimentos O segredo está na utilização da primeira amplificação de uma sequênciaalvo e a partir daí quanto mais alto for o número de cópias iniciais dessa sequência mais rápido será o aumento da fluorescência