Revisão sobre a Ocorrência de Staphylococcus aureus em Alimentos

DOI httpdxdoiorg1020873uft235936522017v4n4p15 Revista Desafios v 04 n 04 2017 15 STAPHYLOCOCCUS AUREUS EM ALIMENTOS Staphylococcus aureus in food Staphylococcus aureus em alimentos Amanda Campos Feitosa1 Rosimeire Mendes Rodrigues2 Edwin Angel Torres Torres1 Juliana Fonseca M Silva3 1Laboratório de Processos e Separação de Biomoléculas e Desidratação LAPSDEA Curso Engenharia de Alimentos Universidade Federal do Tocantins UFT Palmas Tocantins Brasil 2Laboratório de Ciências Básicas e da Saúde LACIBS Curso Nutrição Universidade Federal do Tocantins UFT Palmas Tocantins Brasil 3Laboratório de Microbiologia Geral e Aplicada LMGA Curso Medicina Universidade Federal do Tocantins UFT Palmas Tocantins Brasil Correspondência Laboratório de Microbiologia Geral e Aplicada Universidade Federal do Tocantins UFT Av NS 15 109 Norte Palmas Tocantins Brasil CEP77010090 email julianaafmsilvauftedubr RESUMO A intoxicação alimentar por estafilococos é uma das doenças transmitidas por alimentos DTA mais comuns e resulta da ingestão de enterotoxinas estafilocócicas EE préformadas em alimentos Este trabalho teve como objetivo elaborar uma revisão sobre a ocorrência de Staphylococcus em alimentos surtos de intoxicação estafilocócica enterotoxinas comumente envolvidas em surtos e métodos de identificação de enterotoxinas estafilocócicasNo Brasil os dados do Sistema Nacional de Agravos e Notificações da Secretaria de Vigilância em Saúde SINANSVS Ministério da Saúde atribuem ao S aureus a ocorrência de 77 dos surtos de origem alimentar no período compreendido entre 2000 a 2015 Para melhorar a caracterização de EE várias técnicas têm sido integradas na estratégia de diagnóstico sendo os métodos mais utilizados para detectar as toxinas bacterianas nos alimentos bioensaios biologia molecular e imunológico Os métodos convencionais de detecção de EE são de trabalho intensivo e incapaz de satisfazer as necessidades de detecção em tempo real A biologia molecular baseada em PCR é um método viável mais rápido e com resultados conclusivos Os métodos cromatográficos são eficientes e sensíveis porém os requisitos da amostra instrumentos caros e treinamento de pessoal limitam a sua aplicação Palavraschave Staphylococcus aureus Intoxicação alimentar Enterotoxinas estafilocócicas ABSTRACT Staphylococcal food poisoning is one of the most common foodborne diseases DTA and results from ingestion of preformed staphylococcal enterotoxins SE in food This work aimed to review the occurrence of Staphylococcus in food outbreaks of staphylococcal intoxication enterotoxins commonly involved in outbreaks and methods of identification of staphylococcal enterotoxins In Brazil data from the National Health and Aging System SINAN SVS Ministry of Health attribute to S aureus the occurrence of 77 of foodborne outbreaks in the period from 2000 to 2015In order to improve the characterization of EE several techniques have been integrated into the diagnostic strategy the most used methods being to detect bacterial toxins in food bioassays molecular biology and immunology Conventional EE detection methods are laborintensive and unable to meet realtime detection needs PCRbased molecular biology is a viable faster and conclusive method Chromatographic methods are efficient and sensitive however sample requirements expensive instruments and personnel training limit their application Keywords Staphylococcus aureus Food poisoning Staphylococcal enterotoxins Artigo recebido em 26042017 aprovado em 31082017 publicado em 03102017 Artigo Original Original Article Artículo Original Artigo Original Original Article Artículo Original DOI httpdxdoiorg1020873uft235936522017v4n4p15 Revista Desafios v 04 n 04 2017 16 RESUMEN La intoxicación alimentaria estafilocócica es una de las enfermedades transmitidas por los alimentos ETA más común y resulta de la ingestión de la enterotoxina estafilocócica EE preformada en los alimentos Este estudio tuvo como objetivo la revisión sobre la ocurrencia Staphylococcus en los alimentos brotes de intoxicación alimentaria por estafilococos enterotoxinas comúnmente involucradas en brotes y métodos de identificación de enterotoxinas estafilocócicas La metodología empleada se basó en la investigación cualitativa y sistemas de información En Brasil los datos del Sistema Nacional de Agravos e Notificações da Secretaria de VigilânciaemSaúdeSINANSVS Ministerio de Salud atribuyen al S aureus la ocurrencia de un 77 de los brotes de origen alimentario en el período de 2000 a 2015 Para mejorar la caracterización de EE diversas técnicas se han integrado en la estrategia de diagnóstico y los métodos utilizados para detectar toxinas bacterianas en los alimentos bioensayos biología molecular e inmunológica Los métodos convencionales de detección de EE son de trabajo intensivo e incapaz de satisfacer las necesidades de detección en tiempo real La biología molecular basada en PCR es un método más rápido y con resultados concluyentes Los métodos cromatográficos son eficientes y sensibles sin embargo los requisitos de la muestra instrumentos caros y la capacitación del personal limitan su aplicación Descriptores Staphylococcus aureus Intoxicación alimentaria Enterotoxina estafilocócica INTRODUÇÃO A ocorrência de surtos de intoxicação alimentar é registrado em todo o mundo No Brasil são poucas as informações quanto às doenças transmitidas por alimentos No entanto as intoxicações estafilocócicas são muito comuns no país sendo a maioria dos casos não investigada ou não notificada PEREIRA et al 1994 No período de 2000 a 2015 S aureus foi diagnosticado como agente causal de 77 dos surtos intoxicação alimentar ocorridos no Brasil BRASIL 2015 A intoxicação alimentar por estafilococos é uma das doenças transmitidas por alimentos DTA mais comuns e resulta da ingestão de enterotoxinas estafilocócicas EE préformadas em alimentos HENNEKINNE et al 2012 O diagnóstico de intoxicação alimentar por estafilococos de uma forma geral é confirmado pela identificação de contagens superior a 105 UFC g1 de S aureus a partir de restos de alimentos ou pela detecção de EE enterotoxinas estafilocócicas remanescentes nos alimentos SANTANA 2006 Para a detecção de EE vários métodos foram desenvolvidos como os biológicosimunológicos e moleculares O desenvolvimento das técnicas moleculares permitiu a utilização de ferramenta para detecção da sequência de nucleotídeos do gene responsável pela produção de enterotoxina pelos estafilococos SANTANA et al 2010 Outros métodos para identificação e enumeração de enterotoxinas estafilocócicas em alimentos tem se destacado como promissores WU et al 2016 Este trabalho teve como objetivo elaborar uma revisão sobre o Staphylococcus aureusem alimentos surtos de intoxicaçãoestafilocócica enterotoxinas comumente envolvidas em surtos e métodos de identificação de enterotoxinas estafilocócicas CARACTERIZAÇÃO DO STAPHYLOCOCCUS AUREUS DOI httpdxdoiorg1020873uft235936522017v4n4p15 Revista Desafios v 04 n 04 2017 17 Os estafilococos são bactérias Gram positivas cujo diâmetro oscila entre 05 e 15 micras Caracterizamse porque dividemse em grupos que assemelham com cachos de uva HARRIS et al 2002 Este grupo de bactérias são imóveis não esporuladas e geralmente não capsulados apresentando positividade para catalase KONEMAN 1997 com exceção das espécies S saccharolyticuse S aureus subsp anaerobius que são catalase negativa BERTRAND et al 2002 A superfície externa da maioria das cepas de S aureus contém o fator de coagulação coagulase ligada que se liga ao fibrinogênio e o converte em fibrina insolúvel sendo importante fator de virulência A sua detecção é utilizada para identificação desta espécie MURRAY 2009 Os estafilococos crescem em meios comuns caldo ou ágar simples pH 7 à temperatura ótima de 37o C As colônias formadas em placa após 1824 horas de incubação apresentamse arredondadas lisas e brilhantes Outro meio importante para a identificação dos estafilococos é o ágar manitolsal seletivo para essa espécie uma vez que o S aureus consegue fermentar o manitol produzindo ácido láticoSANTOS 2007 CONDIÇÕES PARA CONTAMINAÇÃO SOBREVIVÊNCIA E MULTIPLICAÇÃO EM ALIMENTOS Fatores que Influenciam o Crescimento Os estafilococos são microrganismos mesófilos com temperatura de crescimento entre 7 e 478ºC e podem produzir enterotoxinas termoresistentes a temperaturas entre 10 e 46ºC com temperatura ótima entre 40 e 45º C O pH ideal para seu desenvolvimento varia entre 7 a 75 mas é possível a multiplicação em alimentos com pH variando entre 42 e 93SANTANA et al 2010 Este grupo de microrganismos ainda tem a capacidade de sobreviver e se multiplicar em uma concentração de cloreto de sódio de até 15 e a produção de enterotoxina acontece em concentrações de sal de até 10 o que faz com que os alimentos curados também sejam veículos potenciais de intoxicaçãoSANTANA et al 2010 Quanto à atividade de água aw os estafilococos são únicos em sua capacidade de se multiplicarem em alimentos com valores de atividade de água inferiores ao normalmente considerados mínimos para outras bactérias halófilas O valor mínimo de aw é 086 apesar de já ter sido relatada a multiplicação desses microorganismos em alimentos com aw de 083 WONG et al 2002 FRANCO et al 2005 A presença de outros microrganismos também é um ponto importante pois os estafilococos são considerados mal competidores LOIR et al2003 Meios de Contaminação As infecções estafilocócicas podem ser causadas por bactérias do próprio indivíduo de outros doentes ou de portadores sadios como profissionais da saúde iniciando após o contato com áreas traumatizadas da pele ou mucosas permitindo ao microrganismo o acesso aos tecidos adjacentes ou à corrente sanguínea No entanto a infecção pode ficar localizada ou disseminarse o que depende da interação complexa entre os fatores de virulência do S aureus e os mecanismos de defesa do hospedeiro Nesse contexto o S aureus é a bactéria mais frequente na mucosa nasal LOWY 1998 Os portadores nasais podem por meio das mãos desempenhar papel importante na disseminação do microrganismo principalmente por meio dos alimentos por eles manuseados RADDI et al 1998 É a partir da cavidade nasal que o microrganismo atinge a epiderme ar água solo DOI httpdxdoiorg1020873uft235936522017v4n4p15 Revista Desafios v 04 n 04 2017 18 alimentos ou qualquer outro objeto que entre em contato com o indivíduo Os portadores nasais de S aureus ao manipularem alimentos podem se tornar importantes fontes de contaminação para os alimentos FRANCO 2005 ASPERGER 1994 LANCETTE et al1992 Reservatórios Os humanos são reservatórios naturais do S aureus tendo sua pele e mucosas colonizadas por este microrganismo o qual frequentemente integrase a flora comensal do hospedeiro caracterizando um estado de portador crônico O indivíduo portador transmite o S aureus por contato direto entre pessoas e as taxas de colonização na comunidade variam de 20 a 50 podendo aumentar entre pacientes e profissionais institucionalizados CORDEIRO 2011 O estado de portador de S aureus pode ser transitório ou permanente estendendose por anos Alguma condição que comprometa a integridade das defesas do hospedeiro tais como trauma procedimentos invasivos ou infecções viróticas constituem oportunidades para a manifestação do potencial de virulência do S aureus FRANCO et al2005 É válido lembrar que devido à sua capacidade de resistir à dessecação e ao frio o S aureus consegue permanecer viável por longos períodos em partículas de poeira o que torna sua distribuição ainda mais ampla CAVALCANTI et al 2006 SURTOS DE INTOXICAÇÃO ALIMENTAR POR S AUREUS A intoxicação alimentar por estafilococos é uma das doenças transmitidas por alimentos DTA mais comuns e resulta da ingestão de enterotoxinas estafilocócicas EE préformadas em alimentos por cepas enterotoxigênicas de S Aureus HENNEKINNE et al 2012 A ocorrência de surtos de intoxicação alimentar é registrada em todo mundo Em 2008 150 pessoas se reuniram para uma celebração de casamento em BadenWurttemberg na Alemanha Três horas depois da ingestão de uma variedade de alimentos incluindo panquecas com recheio de frango picado vários convidados apresentaram sintomas de gastroenterite aguda como vômitos diarréia febre aguda A investigação revelou que o possível agente causador do surto foi o S aureus JOHLER et al 2013 Em estudo recente investigouse a epidemiologia molecular de S aureus isolado de sete intoxicações por estafilococosentre 2006 e 2013 em Xian noroeste da China Um total de sete isolados de S aureus associados a sete surtos por estafilococos foram obtidos e caracterizados naquela ocasião LI GUANGHUI et al 2014 Mais de 100 indivíduos ficaram doentes depois de ingerirem uma variedade de sobremesas de uma padaria de Illinois A equipe de investigação identificou desvios substanciais do atual Regulamento de Boas Práticas de Fabricação e apontou o S aureus como possível agente etiológico KIM et al 2011 Em estudo realizado com 203 cepas de S aureus originadas de 83 surtos ocorridos em Tóquio estas foram examinadas quanto ao seu tipo de coagulase e genótipo de EE HAIT et al 2012 No Brasil os dados do Sistema Nacional de Agravos e Notificações da Secretaria de Vigilância em Saúde SINANSVS Ministério da Saúde retratama ocorrência de surtos alimentares fig1 BRASIL 2015 Figura 1 Notificações de surtos de origem alimentar Brasil 2000 a 2015 DOI httpdxdoiorg1020873uft235936522017v4n4p15 Revista Desafios v 04 n 04 2017 19 Quanto aos agentes etiológicos dos surtos fig 2 observase que o S aureus foi associado a 77 dos surtos no período analisado BRASIL 2015 Figura 2 Agentes etiológicos responsáveis por surtos de DTA Brasil 2000 a 2015 Ademais a maioria dos surtos se deve ao manejo inadequado de alimentos na indústria ou em casa Poucos surtos podem ser relacionados diretamente à contaminação durante o processamento de alimentos WU et al 2016 Na região Sudeste do Brasil doze pessoas foram acometidas de vômito e diarréia aproximadamente 4 horas após haverem ingerido bolo recheado servido em uma festa de aniversário No dia seguinte à festa S aureus produtor de enterotoxina A foi isolado no bolo fossa nasal leito subungueal e essencialmente em uma ferida em fase de cicatrização localizada na nuca da manipuladora que dispunha de longa experiência na área de produção de alimentos PEREIRA et al 1994 Ainda no Brasil em 1998 em um surto de intoxicação alimentar ocorrido com uma família que ingeriu queijo contaminado foi identificado um nível de contaminação para o Saureus superior a 106 UFCg 1 SABIONI et al 1998 Em outro surto de toxinfecção alimentar envolvendo 42 pessoas ocorrido após a ingestão de uma refeição servida num restaurante do município de Passos Minas Gerais Brasil foi relatado que trinta minutos após a ingestão dos alimentos 31 pessoas adoeceram apresentando tontura vômito cólica e diarreia Os alimentos suspeitos foram panqueca de frango arroz feijão molho de tomate e pasta de grão de bico Foram isolados na panqueca de frango contagens superiores a 20x108 UFC de estafilococos produtores de enterotoxinas A B e D por grama do alimento Culturas isoladas a partir da região orofaríngea subungüeal e mucosa nasal dos manipuladores de alimentos revelaram serem estes portadores assintomáticos de cepas de S aureus produtores de enterotoxinas A B C e D Na mucosa nasal de um dos manipuladores foi isolada a cepa de S aureus produtora de TSST1 Os resultados obtidos indicaram os manipuladores como prováveis fontes de contaminação dos alimentos CARMO et al 2003 ENTEROTOXINAS E PATOGENICIDADE DO STAPHILOCOCCUS AUREUS Várias cepas S aureus são produtoras enterotoxinas estafilocócicas EE em alimentos Cinco EE clássicas SEA SEB SEC SED e SEE são as causas mais comuns de DTA por S aureus Além disso 16 novos tipos de EE ou superantígenos SEG SEH SEI SEJ SEK SEL SEM SEN SEO SEP SEQ SER SES SET SEU e SEV também foram descritas e avaliadasKIM et al 2011 DOI httpdxdoiorg1020873uft235936522017v4n4p15 Revista Desafios v 04 n 04 2017 20 Atualmente 23 enterotoxinas foram identificadas como entidades sorológicas distintas incluindo SEA SEB SEC SED e SEE Estas toxinas são proteínas básicas constituídas por 220240 aminoácidos e têm pesos moleculares semelhantes de 2530 kDa As EE mais comuns são SEA e SEB A SEA é mais freqüentemente envolvida na intoxicação alimentar causada pelo estafilococo A SEB não está apenas envolvida na intoxicação alimentar mas identificada como uma potencial arma biológica de guerra e terrorismo WU et al 2016 Estudo realizado em cepas de S aureus isoladas na mastite bovina mostraram que das 72 cepas de S aureus estudadas 66 917 apresentaram produção de pelo menos um tipo de toxina isoladamente ou em associação evidenciando portanto elevado grau de toxigenicidade Revelou também que 12 167 produziram apenas um tipo de toxina enquanto 10 139 produziram simultaneamente até quatro EE e que apenas seis 83 mostraramse negativas na produção das toxinas SEA SEB SEC SED e TSST1Toxina do choque tóxico FILHO et al 2007 As doenças provocadas pelo S aureus podem ser decorrentes da invasão direta dos tecidos ou exclusivamente ser devidas às toxinas que ele produz Dessa forma a análise do mecanismo de invasão do S aureus revela que no primeiro momento essa bactéria adere à pele ou à mucosa para em seguida romper as barreiras do epitélio comprometendo estruturas de ligações intercelulares como desmossomos e junções de aderência Após a invasão do epitélio o S aureus utiliza diversas estratégias para permitir a sua sobrevivência e proliferação no organismo hospedeiro SANTOS 2007 Ainda a capacidade de colonização e a patogenicidade do S aureus são portanto uma consequência de seus fatores de virulência os quais têm papel relevante na adesão celular na captação de nutrientes e na sua evasão da resposta imunológica do hospedeiro Assim o alto potencial infeccioso do S aureus não está restrito apenas à sua facilidade de multiplicação e disseminação nos tecidos mas também à produção de moléculas com grande poder patogênico que incluem enzimas e toxinas SANTOS 2007 As EE aumentam rapidamente a temperaturas adequadas 2037 ºC e pH 474 O mecanismo de ação da intoxicação alimentar EE ainda não é totalmente compreendida Alguns pesquisadores afirmam que a intoxicação resulta em uma resposta inflamatória em todo o trato gastrointestinal caracterizada por danos no jejuno e íleo Outros pesquisadores mostraram que as EE não atuam diretamente do trato gastrointestinal mas indiretamente afeta a expressão de citocinas e metabólitos produzidos por células T macrófagos monócitos e mastocitos As crianças podem adocecer por ingestão de 100 ng de EE e as populações vulneráveis podem desenvolver intoxicação alimentar estafilocócica com alguns microgramas de toxinaWU et al 2016 IDENTIFICAÇÃO E ENUMERAÇÃO DE S AUREUS EM ALIMENTOS O diagnóstico de intoxicação alimentar por estafilococos de uma forma geral é confirmado pela identificação de pelo menos 105 UFC g1 de S aureus a partir de restos de alimentos ou pela detecção de EE enterotoxinas estafilocócicas remanescentes nos alimentos O S aureus é sensível ao calor podendo ser inativado durante o processamento de alimentos no entanto suas enterotoxinas não o são Dessa forma DOI httpdxdoiorg1020873uft235936522017v4n4p15 Revista Desafios v 04 n 04 2017 21 não é possível diagnosticar um surto de intoxicação alimentar enumerando o ECP estafilococos coagulasepositva em alimentos remanescentes ou detecção de genes em cepas isoladas HENNEKINNE et al 2012 Os estafilococos coagulase positiva são estafilococos que produzem coagulase livre enzima capaz de coagular plasma e considerada como fator de virulência O grupo ECP inclui S aureus e outros estafilococos patogênicos enquanto que os ECN estafilococos coagulasenegativa são considerados não patogênicos S xylosus ou S carnosus Muitas técnicas confiáveis estão disponíveis e dependem de contagem direta em meios seletivos métodos normalizados baseados em normas internacionais ou em técnicas baseadas em DNA reação em cadeia da polimerase PCR direcionada para genes específicos de S aureus CRETENET et al 2011 O S aureus normalmente é enumerado usando técnicas microbiológicas com meios seletivos como BairdParker BP que pode ser complementado com fibrinogênio plasmático de coelho BPRPF As normas internacionais atuais baseiamse nestes dois meios BP e BPRPF Modificações destes meios foram descritos tais como complementação com outros compostos sulfhamethazine acriflavina ou polimixina e ainda cicloheximida SMITH e BAIRD PARKER 1964 DEVRIESE 1981 BECKERS et al 1984 Os meios cromogênicos revolucionaram os testes microbiológicos por garantir a identificação presuntiva do microrganismo de acordo com a coloração que este apresenta no meio semeado As colônias são facilmente identificadas através da coloração diferenciada Isso aumenta a eficiência dos testes e poupa tempo e custos comparados aos procedimentos tradicionais Meios cromogênicos estão disponíveis comercialmente e oferecem detecção rápida identificação e quantificação de S aureusCRETENET et al 2011 Além dos métodos normalizados foram desenvolvidos métodos alternativos também comercialmente disponíveis alguns destes validados na França após estudos colaborativos e comparativos PetrifilmTMstaph Express 3M e Rapidstaph Test Biorad Esses testes são baseados em meios seletivos que permitem a identificação presuntiva de S aureus no prazo de 24 horas em vez das 48 horas dos métodos normalizados atuais CRETENET et al 2011 Esforços têm sido dedicados ao desenvolvimento de técnicas que permitam a identificação e quantificação de cepas de S aureus e ainda a virulência de genes associados com maior sensibilidade e rapidez do que os métodos atuais STEPAN et al 2004 Algumas técnicas de detecção baseadas em PCR têm sido aplicadas em alimentos e orientado regiões específicos de S aureus e alguns genes de enterotoxinas em ensaios de PCR simplex ou multiplexCRETENET et al 2011 A maioria dos genes EE é controlada pelo sistema agr Os genes seb sec e sed têm sido demonstrados como agr dependentes enquanto os sea e sej independentes LOIR et al 2003 Os métodos moleculares baseados em DNA se mostram independentes de características específicas em condições artificiais crescimento em meios laboratoriais alcançando 100 de identificação sendo essa uma vantagem em comparação com os métodos fenotípicos No entanto os métodos baseados em DNA podem levar à detecção de células mortas e resultar em contagens superestimadas de S aureus nas amostras CRETENET et al 2011 Enquanto S aureus normalmente é enumerado usando técnicas microbiológicas com DOI httpdxdoiorg1020873uft235936522017v4n4p15 Revista Desafios v 04 n 04 2017 22 meios seletivos BP e BPRPF três tipos de métodos além dos métodos convencionais são utilizados para detectar toxinas bacterianas nos alimentos bioensaios biologia molecular e imunológico IDENTIFICAÇÃO E ENUMERAÇÃO DE ENTEROTOXINAS EM ALIMENTOS As EEs são detectáveis nos alimentos a partir de contagens de população de células deS aureusde 106 ou mais por grama ou mililitro de alimento SANTANA 2006 Em pesquisas laboratoriais tem se observado que só é possível a detecção de enterotoxinas em contagens de S aureus acima de 106 UFC e na maioria dos alimentos associados às intoxicações contagens de 108 ou superiores raramente são relatadas SANTANA et al 2010 Métodos convencionais Os testes em animais estavam entre os primeiros métodos desenvolvidos para detectar EEs e por apresentar baixa sensibilidade e especificidade bem como uso limitado de testes em animais devido à origem e diferenças individuais o método caiu em desuso WU et al 2016A partir da identificação das proteínas enterotoxigênicas BERGDOLL et al 1959 as técnicas de detecção fundamentaramse no uso de anticorpos preparados contra as enterotoxinas Reações específicas de precipitação em agarose foram desenvolvidas com destaque para o ensaio de imunodifusão em microlâminas e OSP Sensibilidade Ótima em Placa PEREIRA et al 2001 Os testes sorológicos fazem parte dos métodos aplicados inicialmente para a detecção de EEs incluindo o teste de difusão em gel e o teste de aglutinação WU et al 2016 O primeiro teste sorológico desenvolvido foi o método de imunodifusão baseado na reação em gel da enterotoxina com anticorpo específico formando uma linha de precipitação SU e WONG 1997 O teste de aglutinação tem como base a aglutinação de células ou partículas revestidas com anticorpos Em 1963 foi desenvolvido um teste de difusão para determinar SEB em cremes frango camarão e outros alimentos sólidos HALL et al1963 Procedimentos de difusão de duplo gel foram relatados em ensaios com SEA e SEB em queijo apresentando limites de detecção tão baixo como 002 e 005 μg por grama de queijo READ et al 1965 Em 1968 foi introduzido um teste de aglutinação de látex para a detecção de SEB sendo utilizadas partículas de látex revestidas com anticorpos antiSEB específicos como indicadores e o limite de detecção foi de 02 ngmL SALOMON e TEW 1968 Kits de teste de aglutinação de látex passivo reverso RPLA foram desenvolvidos e aplicados para determinar EE em massas carne presunto peru cozido e alguns produtos lácteos PARK e SZABO1986 ROSE et al 1989 No entanto os testes sorológicos são semiquantitativos e carecem de especificidade e sensibilidade dessa forma alguns autores consideram que não foram desenvolvidos para a detecção de EE WU et al 2016 Identificação EE por métodos biomoleculares O desenvolvimento de técnicas moleculares viabilizou a aplicação de ferramenta para detecção da sequência de nucleotídeos do gene responsável pela produção de enterotoxina pelos estafilococos SANTANA et al 2010 Os métodos biomoleculares incluem hibridação de ácidos nucléicos e Reação em Cadeia da Polimerase PCR WU et al 2016 A PCR pode ser utilizada para detecção de diversos tipos de estafilococos enterotoxigênicos em culturas e alimentos A detecção de EE por PCR foi relatada pela primeira vez por WILSON et al 1991 Algumas variantes de PCR foram desenvolvidas para DOI httpdxdoiorg1020873uft235936522017v4n4p15 Revista Desafios v 04 n 04 2017 23 detectar EEs tais como PCR multiplex PCR em tempo real PCR RTPCR transcriptase inversa e amplificação isotérmica SHYLAJA et al 2010 RODRÍGUEZ et al 2016 CHIANG et al 2006 GOTO et al 2007 Multiplex apresenta vantagem da detecção simultânea de várias EEs com diferentes iniciadores em comparação com as outras técnicas A PCR apresenta a vantagem de poder ser combinada com outras técnicas como o número mais provável NMPPCR e ensaio imunoenzimático ligado à enzima PCR PCRELISA que pode fornecer resultados sensíveis MANTYNEN et al 1997 GILLIGAN et al 2000 Entre as técnicas convencionais disponíveis em comparação com testes em animais a PCR é muito mais rápida e pode ser aplicada para detectar EEs na maioria dos alimentos WU et al 2016 No entanto estes métodos apresentam duas limitações principais primeiro as cepas estafilocócicas são isoladas dos alimentos e em segundo lugar os resultados indicam a presença ou ausência de genes codificando EEs mas não fornecem informação sobre a expressão destes genes em alimentos HENNEKINNE et al 2012 Dessa forma esse método não pode ser utilizado para confirmação de S aureus como agente causal de surto Além disso a detecção de rotina de microrganismos usando PCR pode ser dispendiosa e complicada Todavia é um método de abordagem rápida e sensível que pode caracterizar as cepas de S aureus envolvidas em surtos proporcionando informações valiosasWU et al 2016 Identificação EE por métodos de cromatografia As EEs são proteínas básicas que podem ser degradadas enzimaticamente em peptídeos que podem ser subsequentemente separados por cromatografia líquida LC e analisados por colisão induzida pela dissociação no modo tandem por espectrometria de massa MSMS proporcionando informação relativa ao analito com base nos pesos moleculares ou sequências primárias de aminoácidos WU et al 2016 Estudo utilizando a cromatografia líquida acoplado a fonte de ionização por electropulverização com espectrometria de massaLC ESIMS foi aplicado para detectar SEB em concentrações tão baixas quanto 3 pmolmL KIENTZ et al 1997 Desde então relatos bem sucedidos sobre testes quantitativos de detecção de EEs em sucos leites feijão verde carne de frango e camarão utilizando LCMSMS têm sido relatados CALLAHAN 2006 A LCESIMS apresenta vantagens sobre as técnicas tradicionais tais como evitar medidas preliminares para isolar as toxinas dos alimentos a possibilidade de quantificação e limites mais baixos de detecçãoWU et al 2016 Identificação EE por imunoensaios O imunoensaio é um método analítico que é amplamente aplicado em vários campos incluindo a análise baseada no reconhecimento específico entre antígenos e anticorpos Os imunoensaios são sensíveis e específicos rápidos de operar e podem ser usados para detectar EEs em amostras complexas sem pré tratamento longo A combinação de anticorpos como componente de reconhecimento com transdutor formam biossensores chamados imunossensores Estes sensores podem ser classificados em três tipos principais detecção óptica técnicas de detecção eletroquímica e técnicas de detecção de massa WU et al 2016 Imunoensaios ópticos Métodos de detecção baseados em ótica apresentam elevada sensibilidade alta frequência e DOI httpdxdoiorg1020873uft235936522017v4n4p15 Revista Desafios v 04 n 04 2017 24 monitorização em tempo real que pode tornar a detecção de EEs menos demorada menor concentração da amostra e facilidade no pré tratamento da amostra WU et al 2016 A técnica de ELISA Enzyme LinkedImmunosorbentAssay é o método imunológico atualmente mais empregado para detecção de enterotoxinaestafilocócica É um método colorimétrico que apresenta vantagens por ser fácil de usar específico e aplicável para rastreio de alto rendimento Várias técnicas de ELISA foram desenvolvidas para a detecção de EEs em sobrenadantes de culturas e em amostras de alimentos sendo o ELISA sanduíche o método mais comum podendo detectar menos de 1ng de EE por mL de sobrenadante SANTANA et al 2010 Esta técnica é considerada a mais adequada para detecção de enterotoxinas estafilocócicas em alimentos por apresentar desenvolvimento de cor diretamente proporcional à quantidade de enterotoxina presente na amostra além de não necessitar de enterotoxinas altamente purificadas para o preparo da curva padrão No entanto a técnica pode apresentar falsos positivos devido às reações inespecíficas principalmente com a proteína A e também falsos negativos em alimentos que passaram por tratamentos térmicos SANTANA 2006 Os imunoensaios fluorescentes são a abordagem mais popular para a detecção de EEsTem sido utilizada uma variedade de marcadores no desenvolvimento de imunoensaios EE incluindo corantes fluorescentes ou nanopartículas fluorescentes que produzem sinais ópticos que podem ser correlacionados com a concentração da substância a analisar Quando comparado com imunoensaios mediados por enzimas determinouse que os imunoensaios baseados em fluorescência possuíam maior potencial para fornecer análise de alta sensibilidade aumentadaWU et al 2016 O primeiro imunoensaio fluorescente foi relatado em sanduíche para detecção de SEB TEMPELMAN et al 1996 Embora o método tenha apresentado variantes com aprimoramento significativo vantagens potenciais para a detecção simultânea de múltiplas EEs devido a multicorantes e nanopartículas fluorescentes como etiquetas existem poucos relatos de determinação simultânea de múltiplas EEs WU et al 2016 A quimioluminescência CL é uma tecnologia promissora com alta sensibilidade ampla faixa linear e instrumentação simples Os imunoensaios baseados em CL têm sido amplamente utilizados para a determinação de EE em alimentos LUO et al 2006 YANG et al 2008 YANG et al 2010 Em comparação com fluorescência e espectrofotometria UVvisível os imunoensaios baseados em CL têm as vantagens de instrumentação simples baixo custo e fácil automação devido à falta de uma fonte de excitação e filtros ópticos WU et al 2016 A eletroquimioluminescência ECL é um meio de converter energia eletroquímica em energia radiativa na superfície de um eletrodo através de um potencial aplicado Os sinais de luminescência podem ser obtidos a partir do estado excitação de um luminóforo ECL gerado na superfície do eletrodo durante a reação eletroquímica Embora os biossensores ECL apresentem vantagens de rapidez e alta sensibilidade configuração simplificada baixo sinal de fundo e facilidade da miniaturização e ter recebido atenção considerada por parte de muitos existem poucos relatos de aplicação de ECL à detecção de EE RICHTER 2004 MIÃO 2008 WU et al 2016 No entanto foi desenvolvido um sistema automatizado de imunodetecção de ponto de DOI httpdxdoiorg1020873uft235936522017v4n4p15 Revista Desafios v 04 n 04 2017 25 atendimento POC combinando o formato ELISA LOC ELISAlabonachip com detector sensível ECL para a determinação de SEB que simplifica o procedimento e reduz os custos de testes YANG et al 2011 A Ressonância plasmática de superfícieSPR é um dos métodos mais sensíveis para a detecção de EE Apresenta resposta sensível à superfície sem etiquetas de detecção e capacidade de medição em tempo real Numerosos estudos aplicaram SPR para a detecção de EE em leite hotdogs cogumelos salada de batata carne presunto dentre outros RASOOLY e RASOOLY 1999 RASOOLY 2001 MEDINA 2003 MEDINA 2006 Imunoensaios eletroquímicos Método possível para a quantificação das EEs baseado na mudança de um sinal elétrico O sinal elétrico pode ser observado como uma corrente potencial impedância ou condutância que podem ser classificados como amperométrica potenciométrica impedimétrico e sensores condutométricos Os imunoensaios eletroquímicos são simples sensível portátil barato e reprodutível tendo excelente compatibilidade com a tecnologia mais recente O método de detecção de EEs com base em eletroquímica tem sido relatado por diversos autores DONG et al 2001 CHATRATHI et al 2007 TANG et al 2010 WU et al 2013 Imunoensaios baseados em massa Os imunoensaios à base de massa são métodos de detecção sensível em que a transdução é baseada em pequenas mudanças na massa O meio de base de análise de massa depende do uso de cristais piezoelétricos e fitas ou fios ferromagnéticos amorfos HARTEVELD e colaboradores introduziram um imunossensor cristal piezoelétrico para detecção de SEB com base em um esquema de competição utilizando os anticorpos policloniais antiSEB e o limite de detecção de 01μgmL foi obtido HARTEVELD et al 1997 Outros estudos têm sido relatados por pesquisadores LIU et al 2014 MARALDO e MUTHARASAN 2007 LIN e TSAI 2003 KARASEVA e ERMOLAEVA 2015 RUAN et al 2004 Embora o imunoensaio seja uma tecnologia confiável para detecção de EE que exibe alta sensibilidade ampla faixa linear e de viabilidade eles exigem anticorpos de alta qualidade A preparação dos anticorpos por meio de experiências de imunização de animais é tediosa e consumidora de tempo além do que os anticorpos obtidos podem ser instáveis e suscetíveis a problemas de modificação WU et al 2016 Bioensaios em desenvolvimento Bioensaios baseados em aptâmeros com elevada afinidade e seletividade estão começando a emergir Aptâmeros são moléculas curtas de ssDNA ou RNA selecionadas por meio de seleção in vitro ou por Evolução Sistemática de Ligantes por Enriquecimento Exponencial SELEX Os aptâmeros apresentam baixo peso molecular e estabilidade superior que pode suportar repetitiva desnaturação e renaturação Em geral essas características únicas fazem dos aptâmeros um elemento ideal no reconhecimento de biossensores Recentemente aptâmeros têm sido elementos de reconhecimento alternativo aplicado à detecção de EEs WU et al 2016 Polímeros com impressão molecular MIPs incorporam uma nova classe de materiais que possuem alta seletividade e afinidade para as moléculas alvo Os MIPs apresentam propriedades de reconhecimento molecular devido a cavidades produzidas na matriz de polímero que são complementares em tamanho e forma a molécula alvo DOI httpdxdoiorg1020873uft235936522017v4n4p15 Revista Desafios v 04 n 04 2017 26 PILETSKY et al 2001 São considerados mais estáveis quando comparados com proteínas e ácidos nucléicos e podem resistir a condições mais duras tais como temperatura elevada pH extremo pressão e solventes orgânicos Além disso a preparação dos MIPs não exige animais que são essenciais para a produção de anticorpos MIPs são elementos sensores estáveis e econômicos e são adequados para a substituição de recursos naturais receptores e anticorpos em ensaios Vários métodos têm sido desenvolvidos para a determinação de EE baseado em MIPs como moléculas de reconhecimento para EEs GUPTA et al 2010 LIU et al 2012 LIU et al 2014 CONSIDERAÇÕES FINAIS Os estafilococos são patógenos de importância em doenças transmitidas por alimentos e apesar da riqueza de informações disponíveis sobre sua virulência e suas enterotoxinas eles ainda representam um campo ativo de pesquisa o que certamente irá proporcionar novas descobertas nos próximos anos Para melhorar a caracterização de EE várias técnicas têm sido integradas na estratégia de diagnóstico As diversas técnicas e ferramentas descritas na literatura para a detecção das EE apresentam vantagens e desvantagens Os métodos convencionais de detecção de EE são de trabalho intensivo e incapaz de satisfazer as necessidades de detecção em tempo real A biologia molecular baseada em PCR é um método confiável mais rápido e com resultados conclusivos No entanto destinamse apenas à análise de DNA e não são indicados para detecção direta de EEs Os métodos cromatográficos são eficientes e sensíveis porém os requisitos da amostra instrumentos caros e treinamento de pessoal limitam a sua aplicação Novas tecnologias imunossensores combinados com ópticas elétricas e as técnicas de transdutor de massa são opções confiáveis Os bioensaios em desenvolvimento baseados em novos elementos de reconhecimento tais como aptâmeros peptídeos e MIPs para a detecção de EE têm demonstrado características superiores em termos de sensibilidade seletividade rapidez e confiabilidadeNo entanto relatos de algumas dificuldades na aplicação de biossensores baseados em aptâmeros para detecção de Staphylococcus aureustem sido observado a exemplo dependência da seletividade com as condições da amostra interações não específicas com a matriz e interações entre nanopartículas com proteínas séricas Todos os autores declararam não haver qualquer potencial conflito de interesses referente a este artigo REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ASPERGER H Staphylococcus aureus Groupof Experts A1011 The significance of pathogenic microorganisms in raw milk International dairy federation v9405 p 2442 1994 BECKERS HJ VANLEUSDEN FM BINDSCHEDLER O GUERRAZ D Evaluation of a pour plate system with a rabbit plasma bovine fibrinogen agar for the enumeration of Staphylococcus aureus in food Canadian Journal of 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