Detecção e Identificação de Fungos de Importância Médica - Microbiologia Clínica

Agência Nacional de Vigilância Sanitária Anvisa Agência Nacional de Vigilância Sanitária Anvisa Módulo 8 Detecção e Identificação de Fungos de Importância Médica MICROBIOLOGIA CLÍNICA PARA O CONTROLE DE INFECÇÃO RELACIONADA À ASSISTÊNCIA À SAÚDE AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA ANVISA Módulo 8 Detecção e Identificação dos Fungos de Importância Médica MICROBIOLOGIA CLÍNICA PARA O CONTROLE DE INFECÇÃO RELACIONADA À ASSISTÊNCIA À SAÚDE Copyright 2013 Agência Nacional de Vigilância Sanitária Todos os direitos reservados É permitida a reprodução parcial ou total dessa obra desde que citada a fonte e que não seja para venda ou qualquer fim comercial A responsabilidade pelos direitos autorais de textos e imagens dessa obra é da área técnica A Anvisa igualmente não se responsabiliza pelas idéias contidas nessa publicação 1ª edição 2010 Elaboração distribuição e informações AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA SIA Trecho 5 Área Especial 57 CEP 71205050 Brasília DF Tel 61 34626000 Home page wwwanvisagovbr Diretoria Dirceu Brás Aparecido Barbano DiretorPresidente Jaime Cesar de Moura Oliveira José Agenor Álvares da Silva Adjuntos de Diretor Luiz Roberto Klassmann Luciana Shimizu Takara Neilton Araujo de Oliveira Doriane Patricia Ferraz de Souza Gerência Geral de Tecnologia em Serviços de Saúde GGTES Diana Carmem Almeida Nunes de Oliveira Gerência de Vigilância e Monitoramento em Serviços de Saúde GVIMS Magda Machado de Miranda Costa Coordenação Técnica Ana Clara Ribeiro Bello dos Santos Anvisa Carlos Emílio Levy Universidade de CampinasSP Ficha Catalográfica Brasil Agência Nacional de Vigilância Sanitária Microbiologia Clínica para o Controle de Infecção Relacionada à Assistência à Saúde Módulo 8 Detecção e identificação de fungos de importância médica Agência Nacional de Vigilância Sanitária Brasília Anvisa 2013 46p il9 volumes ISBN 1 Infecção Relacionada à Assistência à Saúde Controle 2 Infecção em Serviços de Saúde 3 Microbiolo gia Clínica 4 Vigilância Sanitária em Serviços de Saúde 5 Resistência microbiana I Título Redação Angélica Zaninelli Schreiber Universidade de Campinas UNICAMPSP Carlos Emílio Levy Universidade de Campinas UNICAMPSP Cláudia Maria Leite Maffei Universidade de São Paulo USPRibeirão PretoSP Márcia de Souza Carvalho Melhem Instituto Adolfo Lutz IALSP e Secretaria Estadual da Saúde de São Paulo SP Revisão técnica Anvisa André Anderson Carvalho Fabiana Cristina de Sousa Heiko Thereza Santana Magda Machado de Miranda Suzie Marie Gomes Cooperação técnica Termo de Cooperação nº 64 Organização PanAmericana da Saúde Organização Mundial da Saúde Representação Brasil Joaquin Molina Representante Enrique Vazquez Coordenador da Unidade Técnica de Doenças Transmissíveis e Não Transmissíveis e Análise de Situação de Saúde Rogério da Silva Lima Consultor Nacional da Unidade Técnica de Doenças Transmissíveis e NãoTransmissíveis e Análise de Situação de Saúde Projeto Gráfico e Diagramação All Type Assessoria Editorial Ltda Capa Camila Contarato Burns Anvisa SuMáRIO Apresentação 5 Capítulo 1 Detecção e Identificação dos Fungos de Importância Médica 7 11 Introdução 7 111 Fungos e Infecção Relacionada à Assistência à Saúde 7 12 Coleta transporte e armazenamento de amostras 11 121 Recomendações gerais de coleta e transporte de amostras 12 13 Processamento de amostras 15 131 Exame microscópico de amostras 16 132 Exame microscópico direto com hidróxido de potássio KOH a 20 16 133 Exame microscópico direto com tinta nanquim tinta da China 16 134 Exame microscópico com coloração pelo método de Gram 17 135 Exame microscópico com coloração panótica Giemsa Leishman ou Wright 17 136 Cultura de amostras biológicas para isolamento de fungos 19 137 Meios de cultura 19 138 Procedimentos para cultura 20 14 Identificação de fungos 22 141 Identificação de leveduras morfológica e bioquímica 24 142 Prova do tubo germinativo 27 143 Cultivo em lâmina para prova de filamentação e produção de clamidósporo 27 144 Prova da urease 28 145 Prova de assimilação de fontes de carbono e nitrogênio ou auxanograma 28 146 Fermentação de açúcares ou zimograma 29 147 Métodos comerciais para identificação de leveduras 29 148 Identificação de fungos filamentosos 29 149 Técnica de microcultivo para fungos filamentosos 30 1410 Identificação de fungos dimórficos 31 15 Descrição das principais micoses observadas no Brasil 31 151 Micoses superficiais 31 152 Micoses subcutâneas e profundas 32 153 Micoses oportunistas 35 16 Corantes e meios de cultura 41 Corante Azul de lactofenolalgodão 41 17 Glossário 43 18 Referências Bibliográficas 44 5 Módulo 8 Detecção e Identificação dos Fungos de Importância Médica APRESENTAÇÃO A resistência microbiana é um grave problema mundial estando associada ao aumento do tempo de internação dos custos do tratamento e das taxas de morbidade e mortalidade dos pacientes O uso indiscriminado e incorreto dos antimicrobianos na comunidade e no am biente hospitalar é reconhecidamente um importante fator de risco para o aparecimento e a disseminação da resistência microbiana Nesse contexto inserese o Laboratório de Microbiologia que tem como objetivo não ape nas apontar o responsável por um determinado estado infeccioso mas também indicar através do monitoramento de populações microbianas qual o perfil dos microorganismos que estão interagindo com o organismo humano possibilitando a indicação de tratamen tos mais adequados Para o desempenho satisfatório dessa função é fundamental que os laboratórios de microbiologia possuam estrutura capaz de estabelecer informações sobre a melhor amostra biológica reconhecer a microbiota e os contaminantes identificar micro organismos associados à infecção ou com propósitos epidemiológicos obter resultados rápidos em casos de emergência realizar o transporte rápido das amostras e manter uma educação contínua em relação aos aspectos da infecção relacionada à assistência à saúde Tendo em vista esses aspectos e considerando que a microbiologia é um campo muito dinâ mico a Agência Nacional de Vigilância Sanitária Anvisa em cooperação com a Organiza ção PanAmericana da Saúde OPAS propõe a terceira revisão do Manual de Procedimentos Básicos em Microbiologia Clínica para o Controle de Infecção Relacionada à Assistência à Saúde buscando atualizar informações nos temas considerados essenciais e contando com um seleto e conceituado corpo editorial O manual é composto por nove módulos a saber Módulo 1 Biossegurança e manutenção de equipamentos em laboratório de microbiolo gia clínica Módulo 2 Controle externo da qualidade Módulo 3 Principais Síndromes In fecciosas Módulo 4 Procedimentos laboratoriais da requisição do exame à análise micro biológica e laudo final Módulo 5 Tecnologias em Serviços de Saúde descrição dos meios de cultura empregados nos exames microbiológicos Módulo 6 Detecção e identificação de bactérias de importância médica Módulo 7 Detecção e identificação de micobactérias de importância médica Módulo 8 Detecção e identificação de fungos de importância mé dica e Módulo 9 Infecções virais A Anvisa e a OPAS esperam com essa publicação contribuir para que os laboratórios de micro biologia possam assimilar e alcançar novos níveis de complexidade laboratorial atendendo às exigências e características próprias de cada unidade hospitalar além de subsidiar a adoção de procedimentos básicos padronizados nesses serviços 7 Capítulo 1 Detecção e Identificação dos Fungos de Importância Médica Angélica Zaninelli Schreiber Cláudia Maria Leite Maffei Márcia de Souza Carvalho Melhem Carlos Emílio Levy 1 1 Introdução 1 1 1 Fungos e Infecção Relacionada à Assistência à Saúde Os avanços da medicina que permitem a sobrevida de pacientes críticos e imunocomprometidos uso de antimicrobianos de amplo espectro imple mentação das técnicas de transplantes de órgãos sólidos e de medula óssea são alguns dos fatores que têm transformado a rotina diagnóstica dos la boratórios de microbiologia e micologia Antes preocupados apenas com a detecção de patógenos fúngicos clássicos Quadro 1 hoje se deparam cada vez mais com a visualização e isolamento de fungos considerados saprófitas oportunistas e potencialmente patogênicos com a difícil tarefa de identifi cálos e em conjunto com o clínico valorizar ou não esse achado no material clínico coletado Quadro 1 Principais infecções micóticas que acometem os seres humanos no Brasil MICOSES CLáSSICAS OPORTuNISTAS Superficiais Pitiríase versicolor Cutâneas Dermatofitoses Subcutâneas Cromomicose esporotricose Profundas Paracoccidioidomicose Histoplamose Superficiais Candidíases Dermatomicoses Invasivas Candidemia Criptococose Aspergilose Fusariose Zigomicoses Outras hialohifomicoses Feohifomicoses Agentes como espécies de Aspergillus Candida Cryptococcus e zigomicetos considerados anteriormente como contaminantes ambientais e portanto de pouca importância clínica são agora conhecidos agentes causais de enfermidades disseminadas tais como endocardites infecções pulmonares ceratites entre outras em pacientes imunocomprometidos Dessa forma esses fungos devem ser considerados ao lado dos patógenos clássicos como possíveis agentes de quadros infecciosos Dentro das centenas de espécies descritas leveduras do gênero Candida são os importantes agentes de infecção relacionada à assistência à saúde e representam um desafio para a sobrevida de pacientes com doenças graves e aqueles em período pósoperatório Hospitais norteamericanos com sistema de vigilância operante notificaram espécies de Candida como 6º patógeno nosocomial e a 4ª causa mais comum de infecções de corrente sanguínea adquiridas em hospitais Diferentes espécies de Candida podem causar quadros de fungemia a saber Candida albicans Candida glabrata Torulopsis glabrata Candida tropicalis Candida parapsilosis Candida krusei Candida guilliermondii Candida lusitaniae Candida lipolytica Candida kefyr Candida inconspicua Candida norvegensis e Candida catenulata Um grupo europeu realizou na década de 90 um estudo multicêntrico e por análise univariada concluíram ser C glabrata a espécie associada à maior taxa de mortalidade e que o óbito estava relacionado com maior idade e severidade da doença de base do paciente A manifestação clínica mais comum nas candidíases hospitalares é febre A candidemia pode ser definida como a ocorrência de duas ou mais culturas positivas para a mesma espécie de Candida provenientes de amostras diferentes coletadas após 72 horas da admissão A infecção invasiva por Candida spp pode ser também considerada quando seu isolamento ocorrer a partir de material clínico estéril associado a pelo menos um outro sinal de infecção A sensibilidade da hemocultura para Candida spp é baixa aproximadamente 50 dos pacientes com infecção invasiva podem ter culturas negativas Além disso se houver infecção bacteriana concomitante essa pode diminuir a chance do isolamento da levedura Os fatores de risco reconhecidos para infecção invasiva por Candida spp são Permanência 4 dias em UTI Antibióticoterapia de largo espectro Cirurgia abdominal Cateterização venosa central Nutrição parenteral total Imunodepressão Índice APACHE II 10 Ventilação mecânica 48h Neutropenia Quimioterapia citotóxica O gênero Candida é sem dúvida o mais importante mas existem outras leveduras no ambiente hospitalar tanto em vegetais ar atmosférico e água quanto na pele e no trato gastrointestinal dos pacientes e funcionários que podem causar quadros infecciosos Os principais gêneros são Pichia spp Hansenula spp Rhodotorula spp e Trichosporon spp Em adição fungos filamentosos presentes no ambiente hospitalar também podem causar infecção em pacientes suscetíveis O gênero Aspergillus spp Aspergillus terreus A fumigatus A flavus e A niger é o mais citado na literatura como fungo oportunista especialmente em pacientes submetidos a transplante de medula óssea e neutropênicos A inalação de esporos é a via mais comum de transmissão e os surtos de aspergilose podem estar associados às reformas e construções dentro e ao redor de hospitais Doença pulmonar e mais raramente sinusite são as manifestações de aspergilose Outros gêneros tais como Fusarium sp Acremonium sp Penicillium sp outros hifomicetos como zigomicetos Rhizopus sp Mucor sp e alguns feohifomicetos fungos negros ou demácios também dispersos no ar são capazes de causar formas localizadas ou disseminadas de infecção relacionada à assistência à saúde Diante dessas condições recomendase monitoramento com exames micológicos de amostras biológicas dos pacientes tais como sangue escarro pontas de catéteres intravasculares líquido peritoneal e urina Culturas positivas podem significar apenas colonização mas podem conduzir à doença invasiva subsequente Estudo prospectivo em pacientes cirúrgicos de UTI mostrou que 38 de 29 pacientes desenvolveram infecção após colonização A colonização pode ser demonstrada por análise de três ou mais amostras coletadas do mesmo local ou de locais diferentes do mesmo paciente em dias consecutivos Nesse módulo será apresentada uma visão geral das principais infecções fúngicas para que os microbiologistas possam adquirir certa habilidade para identificar fungos isolados de amostras biológicas Para um estudo mais 10 Agência Nacional de Vigilância Sanitária Anvisa completo sobre diagnóstico de infecções fúngicas recomendamse as refe rências citadas ao final do capítulo Características gerais dos fungos Fungos são seres dispersos no meio ambiente em vegetais ar atmosférico solo e água e embora sejam estimados em 250 mil espécies menos de 150 foram descritos como patógenos aos seres humanos Os fungos de interesse médico agentes de micoses apresentamse sob dois tipos morfológicos leveduras prevalentemente unicelulares e bolores ou fungos filamentosos que são multicelulares Figura 1 Há ainda importan tes agentes de micoses endêmicas que na dependência principalmente da temperatura mas sob influência também do teor de CO2 e condições nutri cionais podem se apresentar sob ambas as formas sendo chamados fungos dimórficos Figura 1 Estruturas microscópicas básicas de fungos filamentosos a b c e leveduras d e Leveduras são fungos capazes de colonizar o homem e animais e frente à perda do equilíbrio parasitahospedeiro podem causar diversos quadros infecciosos com formas clínicas localizadas ou disseminadas De modo con trário fungos filamentosos ou bolores normalmente não fazem parte da microbiota animal e portanto o homem não é um reservatório importante para esse grupo de fungos As portas de entrada no hospedeiro são as vias aéreas superiores ou quebra na barreira epidérmica após traumatismos com objetos perfurocortantes 11 Módulo 8 Detecção e Identificação dos Fungos de Importância Médica As leveduras têm como estrutura primária visível ao microscópio ótico a partir de material clínico ou colônias em cultura células que se reproduzem por brotamento único ou múltiplo em geral de forma arredondada Essas células são esporos de origem assexual e são denominadas blastoconídios Alguns gêneros de leveduras menos importantes em micologia médica re produzemse por fissão Sob determinadas condições as leveduras podem produzir pseudohifas importantes para o processo de identificação presun tiva de espécies do gênero Candida ou até mesmo hifas verdadeiras A macromorfologia das colônias de leveduras a partir de crescimento em meios não diferenciais como ágar sabouraud dextrose não permite a dife renciação de gêneros A exceção é a colônia mucoide característica do gê nero Cryptococcus Assim a identificação de leveduras é realizada principal mente por características fisiológicas Os fungos filamentosos possuem como elemento constituinte básico a hifa que pode ser septada ou não septada cenocítica hialina hifomicetos ou demácea feohifomicetos A partir da hifa formamse esporos para propa gação das espécies Na grande maioria dos fungos os esporos podem ser chamados de conídios pois nascem diretamente delas ou sobre estruturas ligadas a elas Esses conceitos fundamentais representam a base para a identificação de um fungo pois a classificação de filamentosos é feita em geral pela associa ção de características morfológicas macroscópicas cor aspecto textura da colônia produção de pigmento difusível no meio etc microscópicas for ma e cor da hifa presença ou não de septos tipo e arranjo de esporos etc e de velocidade de crescimento lenta moderada ou rápida 1 2 Coleta transporte e armazenamento de amostras O tipo e a qualidade da amostra biológica submetida ao laboratório de micologia são fatores préanalíticos extremamente importantes para o sucesso do isolamento e identificação do verdadeiro agente etiológico de infecções fúngicas Para tanto a coleta do material biológico seu transporte e armazenamento adequa dos devem ser cuidadosamente considerados O correto diagnóstico laboratorial micológico também depende de outros aspectos como experiência do profissional que vai executar o exame adequada comunicação entre os clínicos vigilância e laboratório essencial para direcionamento do tipo de amostra e quantidade a ser coletada cuidados de coleta frascos e meios utilizados para transporte e armazenamento das amostras identificação correta das amostras incluindo a identificação do paciente data de coleta pressão de diagnóstico para auxiliar no direcionamento das análises laboratoriais e tempo de resposta ao clínico pelo laboratório 121 Recomendações gerais de coleta e transporte de amostras A esterilização e desinfecção dos materiais necessários deverá ser realizada previamente conforme recomendações específicas Lavar as mãos e secálas As amostras devem ser identificadas com nome do paciente número de registro hospitalar quando for o caso tipo de amostra e data de coleta entre outras informações adicionais para auxiliar o laboratório no direcionamento dos exames Coletar a amostra biológica após antisepsia e colocála em recipiente estéril e vedado conforme orientação para pesquisa de agente em quantidade suficiente 2 mL ou 05 cm³ ou duplicada e no período de coleta apropriado conforme especificação de agente em estudo para permitir todos os procedimentos laboratoriais necessários Os swabs são usados para coleta apenas para realização do exame cultura de materiais tais como ouvido nasofaringe orofaringe e boca Esses devem ser colocados em tubos contendo salina estéril e devem ser transportados o mais rápido possível eou conservados a 4ºC durante o prazo de 8 a 10 horas de modo a evitar a dessecação da amostra Os materiais ditos contaminados tais como urina fezes pus secreções de feridas ou trato respiratório devem ser enviados sob refrigeração a 4ºC ao laboratório o mais rápido possível até 18 horas Líquor e líquidos cavitários devem ser coletados sob cuidados de antisepsia antes da punção e enviados em tubo estéril selado hermeticamente e transportados o mais rápido possível para assegurar o diagnóstico mantidos à temperatura ambiente Sangue e material de punção de medula óssea são os únicos materiais biológicos que devem ser semeados diretamente em frascos contendo meio de cultura líquido ou bifásico líquido sobre sólido de modo a evitar coágulação e consequente diminuição da sensibilidade do exame o transporte deve ser em temperatura ambiente entretanto encaminhar o mais rápido possível ao laboratório uma vez que o processamento dessas amostras deve ser realizado em no máximo 8 a 9 horas Recomendações adicionais Sempre que possível coletar amostras antes do início da terapia específica e particularmente para lesões cutâneas de pele e unhas orientar o paciente para evitar uso de medicação tópica por 4 a 5 dias antes da coleta de escamas A requisição médica que acompanha a amostra deve conter sempre que possível as hipóteses diagnósticas que auxiliarão o micologista na escolha da coloração e do meio de cultura mais adequado para o isolamento do agente etiológico suspeitado Em pacientes imunodeprimidos ou muito debilitados o estudo de um mesmo tipo de amostra biológica coletada em 2 ou 3 dias consecutivos é importante para a interpretação correta de resultados positivos para fungos considerados como saprófitas ou seja contaminantes do meio ambiente ou mesmo constituinte da microbiota normal do paciente Nesses pacientes os fungos saprófitas podem se tornar oportunistas e comportaremse como patógenos Quadro 2 Procedimentos para coleta de amostras Material Clínico Procedimento de coleta Escarro Recolher de preferência a primeira expectoração da manhã após gargarejo com água limpa ou fervida em frasco de boca larga esterilizado Não deve conter saliva Aspirado gástrico Aspirar cerca de 5 a 10 mL de suco gástrico através de sonda nasogástrica pela manhã em jejum Aspirado traqueal e secreção obtida por broncoscopia Procedimento realizado por médico treinado O material colhido deve ser colocado em recipiente estéril Sangue e aspirado de medula óssea Fazer antissepsia rigorosa no local da punção e coletar cerca de 5 a 6 mL de sangue venoso que deverá ser injetado diretamente em frasco contendo meio de cultura ver detalhes no próximo item A última gota de material deve ser distendida em uma lâmina de microscopia para coloração de Giemsa Líquor Fazer antissepsia rigorosa no local da punção Coletar 2 mL ou mais para exame microscópico e cultura para fungos Os tubos na rotina hospitalar devem ser usados na seguinte sequência 1º exame biológico 2º exame de celularidade 3º microbiológico reduzindo assim a possibilidade do isolamento de contaminantes da pele Entretanto a coleta da amostra é importante pois aumenta a área de superfície e expor o microorganismo ligado ao tecido ao maior contato com o meio de cultura Tecido obtido por biópsia necropsia e peças operatórias Coletar assépticamente utilizando instrumentos estéreis e em recipiente estéril com salina Não adicionar nenhum líquido fixador 14 Agência Nacional de Vigilância Sanitária Anvisa Material Clínico Procedimento de coleta Urina A amostra biológica mais apropriada para o diagnóstico de micose do trato urinário é obtida por sondagem ou citoscopia Quando não for possível e para evitar contaminação com microorganismos presentes nas áreas vizinhas fazer limpeza prévia da região perineal com água e sabão desprezar o primeiro jato de urina da manhã e colher 3 a 5 mL de urina em frasco estéril Coleções de 24 horas não têm valor para diagnóstico micológico Fezes Fazer lavagem prévia da região anal com água e sabão coletar porções de fezes em recipiente estéril com tampa ou swab anal mergulhar o swab em salina estéril e enviar o tubo ao laboratório Secreção de conduto auditivo externo Colher material por curetagem da lesão ou com swab estéril Mergulhar o swab umedecido em salina estéril e enviar o tubo ao laboratório Material de Micose ocular O melhor método para recuperação de fungos requer raspado de córnea aspiração de líquido intraocular ou biópsia A coleta com auxílio de swab não é indicada em local de drenagem Lesão de nariz e seios paranasais Coletar secreção material necrótico ou tecido obtido por biópsia em recipiente estéril Mucosa oral e orofaringe Coletar com swab estéril o material de lesão de mucosa jugal papilas linguais ou região tonsilar Mergulhar o swab umedecido em salina estéril e enviar o tubo ao laboratório Secreção vaginal Com auxílio de espéculo coletar material da lesão ou do fundo de saco vaginal com swab estéril Mergulhar o swab umedecido em salina estéril e enviar o tubo ao laboratório Líquidos corporais pleural ascítico pericárdico e sinovial Fazer assepsia rigorosa no local da punção Coletar cerca de 5 a 10mL de líquido em tubo de ensaio estéril Pus e material de abscesso Devem ser colhidos de preferência por aspiração de abscessos fechados com seringa e agulha estéril Se a lesão for aberta limpar o local com gaze esterilizada embebida em salina estéril para eliminar os exsudatos superficiais que são altamente contaminados com bactérias A seguir colher o material com swab Mergulhar o swab umedecido em salina estéril e enviar o tubo ao laboratório Pele e pelos Se possível descontaminar a pele com álcool 70 antes da coleta Raspar com lâmina de bisturi as escamas cutâneas da borda das lesões Podese utilizar também uma lâmina de microscopia Colocar o material entre duas lâminas limpas de preferência esterilizadas vedandose as bordas das lâminas com fita adesiva para evitar perda do material Os pelos tonsurados devem ser retirados com pinça estéril e acondicionados entre lâminas ou em potes de preferência esterilizados Unhas Fazer limpeza prévia das unhas escovando com água e sabão Cortar com tesoura e desprezar a parte descolada da unha e com lâmina de bisturi raspar as áreas mais profundas e pulverulentas Colocar esse material entre lâminas e vedálas com fita adesiva O sucesso na visualização e isolamento do agente etiológico depende além da coleta transporte conservação e armazenamento adequados e volume suficiente da amostra de seu processamento correto antes do exame micológico As seguintes recomendações devem ser cuidadosamente seguidas para boa resolução diagnóstica Pelos cabelos escamas de unha e pele devem ser alíquota para exame microscópico direto e cultura pois para exame são clarificadas com solução aquosa de KOH a 20 e para cultura não podem sofrer nenhum tratamento prévio sendo por isso inoculadas diretamente na superfície do meio de cultura Líquor secreções e fluidos corporais como líquido pleural ascítico sinovial pericárdico aspirado transtraqueal lavado gástrico e broncoalveolar BAL devem ser concentrados por centrifugação 1500 a 2000 rpm por 10 minutos Os materiais coletados com swabs devem ser eluídos em solução salina e também devem ser centrifugados O sedimento obtido é o material adequado para o exame microscópico e semeadura em meios de cultura Para urina é recomendável que uma alíquota alça calibrada seja semeada por esgotamento sobre o meio de cultura distribuído em placa de Petri para exame quantitativo pela contagem de unidades formadoras de colônias UFC A outra alíquota deve ser centrifugada 1500 a 2000 rpm por 10 minutos e o sediment será utilizado para exame microscópico e nova semeadura em tubo cultura qualitativa Escarro pode ser digerido com enzima vv NacetilLcisteína 250 mg de enzima dissolvidas em 1 L de soluçãotampão citrato ou solução fisiológica que fluidifica e facilita a manipulação da amostra e formação de sedimento após centrifugação Porém não foi comprovado que esse tratamento melhore a recuperação de fungos da amostra sendo portanto opcional Podese utilizar como alternativa para digestão da amostra solução de KOH 20 A porção purulenta da amostra é preferível e porções liquefeitas não são adequadas para isolamento do agente A porção da amostra tratada com KOH porém só pode ser usada para exame microscópico pois a potassa destrói após algumas horas as estruturas do fungo inviabilizando seu isolamento em meio de cultura Nesse caso outra porção da amostra deve ser centrifugada e o sedimento usado para cultura 16 Agência Nacional de Vigilância Sanitária Anvisa mente após a coleta em frascos contendo meio de cultura O meio pode ser bifá sico 15 mL de ágar inclinado sob 50 mL de caldo composto de infusão de cére brocoração meio BHI ou Sabouraud Meios contendo saponina para lise e poste rior centrifugação da amostra são indicados Na prática frascos para hemocultura bacteriológica simples ou automatizada proporcionam isolamento adequado de fungos desde que respeitados os períodos necessários ao seu desenvolvimento Para fungos dimórficos de crescimento lento 15 d muitos autores consideram o método de lisecentrifugação o mais sensível Sangue e medula óssea não de vem ser coletados em seringas contendo EDTA pois essa substância se combina com elementos da parede dos fungos diminuindo a sensibilidade do exame Um dos procedimentos recomendados é a inoculação de 5 a 6 mL da amostra no fras co com meio bifásico sendo uma parte para 10 partes do meio líquido que deve ser então incubado à temperatura de 30C 131 Exame microscópico de amostras Na dependência do material clínico a observação de um fungo na amostra biológica tem grande valor diagnóstico pois demonstra sua presença no te cido e permite uma informação imediata ao médico a qual pode ser crucial para determinar a terapia apropriada ao paciente No entanto se a quantida de da amostra biológica for insuficiente para o exame microscópico e cultura do material a cultura na maioria das amostras tem prioridade sobre o exa me microscópico por ser mais específico e em muitos casos mais sensível O exame microscópico da amostra é realizado por várias técnicas depen dendo do tipo da amostra e suspeita clínica 132 Exame microscópico direto com hidróxido de potássio KOH a 20 Técnica utilizada para exame de pelos pele unha tecido obtido por bióp sia exsudatos espessos e outros materiais densos Colocar uma gota de KOH aquoso a 20 em uma lâmina de microscopia e sobre essa uma porção da amostra a ser examinada Cobrir a preparação com uma lamínula e para intensificar a clarificação aquecer ligeiramente sobre a chama de um bico de Bunsen sem deixar ferver a mistura Examinar a preparação após 20 mi nutos em microscópio óptico comum inicialmente com objetiva de 10x seguida de 40x 133 Exame microscópico direto com tinta nanquim tinta da China Utilizado em amostras de líquor urina secreções ou exsudatos para visuali zação de leveduras capsuladas do gênero Cryptococcus que se tornam mais evidentes contra o fundo negro proporcionado pela tinta Colocar uma gota de tinta nanquim e uma gota do sedimento da amostra centrifugada sobre uma lâmina Cobrir a preparação com lamínula e observar ao microscópio 17 Módulo 8 Detecção e Identificação dos Fungos de Importância Médica óptico objetivas de 10x e 40 x Nessa técnica um erro bastante frequente é confundir linfócitos com células de leveduras A diferenciação é feita pela refringência da parede celular e das inclusões no citoplasma das leveduras além da presença de brotamentos Figura 2 Figura 2 Cryptococcus sp leveduras em brotamento rodeadas de halo transparente cáp sula polissacarídica sobre fundo negro formado pela tinta nanquim 134 Exame microscópico com coloração pelo método de Gram Todos os fungos são Grampositivos assim a utilização da coloração não visa a diferenciação dos microorganismos mas possibilita discriminar elemen tos fúngicos de artefatos existentes em urina secreções e fezes A amostra é espalhada de modo homogêneo em movimentos circulares em uma lâmi na de microscopia fixada com calor e submetida à coloração 1 3 5 Exame microscópico com coloração panótica Giemsa Leishman ou Wright Essas colorações são usadas para pesquisa de Histoplasma capsulatum em diversas amostras biológicas medula óssea sangue aspirados e secreção cutânea Nesses casos fazse um esfregaço semelhante ao usado para colo ração de Gram Fixase com metanol e corase segundo o método escolhido Podem ser usadas ainda para corar imprints de tecidos obtidos por biópsia A seguir estão esquematizados os principais aspectos morfológicos obser vados ao exame microscópico e os possíveis agentes etiológicos de acordo com a amostra biológica 18 Agência Nacional de Vigilância Sanitária Anvisa Quadro 3 Interpretação de aspectos morfológicos encontrados em exames microscópicos de amostras biológicas Amostra Biológica Aspecto Morfológico Interpretação Pelos a Hifas hialinas eou artrosporos1 a Dermatófitos Unhas escamas de pele a Hifas regulares septadas ramificadas hialinas artrosporadas1 a Dermatófitos b Leveduras e pseudohifas b Candida spp c Grupo de leveduras eou pequenas hifas tortuosas hialinas1 c Malassezia sp Líquor a Levedura capsulada2 a Cryptococcus sp Secreção vaginal a Levedura e pseudohifa13 a Candida spp Secreções trato respiratório nasal oral nasofaringe a Hifas ramificadas hialinas septadas3 a Fungos filamentosos hialinos5 b Levedura capsulada2 b Cryptococcus sp c Levedura e pseudohifa13 c Candida spp d Leveduras globosas ou multiformes de parede espessa inclusões citoplasmáticas com múltiplos brotamentos1 d Paracoccidioides brasiliensis Tecidos pus e aspirados subcutâneo ganglionar cerebral pulmonar mucosa ou outro a Hifas irregulares largas cenocíticas13 a Zigomicetos b Hifas ramificadas hialinas septadas13 b Fungos filamentosos hialinos5 c Hifas septadas de cor castanha ou marrom13 c Feohifomicetos fungos demácios d Estruturas ovaladas com ou sem septos de cor castanha estruturas muriformes1 d Cromomicetos agentes de cromomicose e Levedura e pseudohifa12 e Candida spp f Levedura capsulada2 f Cryptococcus sp g Levedura globosa ou ovóide de parede espessa inclusões citoplasmáticas com brotamento único ou múltiplos1 g Paracoccidioides brasiliensis h Leveduras pequenas tipo charuto achado muito raro3 h Sporothrix schenckii i Leveduras pequenas em macrófagos4 i Histoplasma capsulatum 19 Módulo 8 Detecção e Identificação dos Fungos de Importância Médica Amostra Biológica Aspecto Morfológico Interpretação Fluídos oculares a Fragmentos de hifas hialinas septadas13 a Fungos filamentosos hialinos5 b Leveduras e pseudohifas13 b Candida spp Sangue e medula óssea a Fragmentos de hifas ramificadas hialinas septadas34 a Fungos filamentosos5 b Levedura capsulada2 b Cryptococcus sp c Leveduras em brotamento34 c Leveduras6 d Leveduras pequenas em macrófagos4 d Histoplasma capsulatum 1 Exame microscópico com KOH 2 Exame microscópico com tinta nanquim 3 Exame microscópico com coloração de Gram 4 Exame microscópico com coloração de Giemsa ou panótica 5 São fungos saprófitas que podem se tornar oportunistas por exemplo Aspergillus Fusarium Acremonium cuja identificação só é possível pela cultura 6 No sangue leveduras do gênero Candida não formam pseudohifas e a identificação de gênero e espécie é possível somente após isolamento em meio de cultura 136 Cultura de amostras biológicas para isolamento de fungos A amostra após o processamento poderá ser usada para isolamento do agente etiológico Para tanto deverá ser semeada em movimentos de estrias ziguezague sobre a superfície de meios sólidos de cultura distribuídos em tubos de ensaio tamponados com tampão hidrófilo 137 Meios de cultura O meio de cultura pode ser selecionado segundo tipo de amostra e agente etiológico conforme a suspeita clínica De acordo com os aspectos observa dos ao exame microscópico da amostra podese ainda redirecionar o pro cedimento para isolamento do agente Recomendase sempre 2 tubos de meio para semeadura da amostra biológica os quais deverão ser incubados à temperatura de 30C usada atualmente para todos os tipos de amostras Quando a hipótese diagnóstica apontar para um fungo dimórfico incubar um dos tubos a 35O C Para isolamento de fungos a partir de qualquer tipo de amostra devem ser utilizados meios não seletivos que permitam crescimento de fungos pato gênicos e bolores de crescimento rápido de 7dias Esses fungos apesar de serem contaminantes de meio ambiente podem ser agentes de micoses em pacientes suscetíveis ou seja são potencialmente oportunistas O meio básico em laboratório de micologia é o ágar Sabouraud dextrose ASD chamado simplesmente ágar Sabouraud O ASD é o meio mais utili zado por ser relativamente barato e permitir o crescimento de todos os fun 20 Agência Nacional de Vigilância Sanitária Anvisa gos com raríssimas exceções Em regra usase um antibiótico para impedir o crescimento de bactérias que poderiam prejudicar o isolamento de fungos O cloranfenicol é o mais indicado pois resiste à autoclavação Pode ser colo cado tanto no ASD como em outros meios de cultura para fungos Meios ditos seletivos para fungos patogênicos contêm cicloheximida que inibe parcialmente ou totalmente fungos anemófilos Esses meios são in dicados para cultivo de materiais coletados de lesões com suspeita de der matofitose para aumentar a sensibilidade no isolamento de dermatófitos Devese ressaltar que essa substância poderá inibir o isolamento de fungos oportunistas como Aspergillus sp além de Histoplasma capsulatum na fase leveduriforme e certas leveduras patogênicas dos gêneros Candida e Cryp tococcus Existem meios presuntivos que indicam presença de certos grupos de fun gos ou determinados gêneros como por exemplo ágar contendo compos tos fenólicos para Cryptococcus sp ágar contendo sementes de niger ou Guizzotia abssinica ou ágar especial para dermatófitos Dermatophyte Test Medium Existem ainda meios presuntivos por reação enzimática e colori métrica de espécies de Candida spp Candida Medium ChromAgar Biggy Ágar etc São meios mais caros que ASD e além disso sua maior aplicação é no isolamento primário de leveduras a partir de amostras biológicas muito contaminadas tais como secreção vaginal fezes e urina A identificação no entanto é feita somente após análise morfológica e fisiológica Para isolamento ou subcultivo de dermatófitos recomendase o ágar batata encontrado no comércio sob forma desidratada para aumentar a esporula ção e facilitar a identificação do gênero e espécie do fungo Para fungos dimórficos de crescimento lento 15 dias recomendase o uso de meios enriquecidos como o ágar infusão de cerebrocoração BHI para obtenção em menor tempo de culturas melhor desenvolvidas Pode ser acrescido de 5 a 10 de sangue de carneiro e de antibióticos de prefe rência cloranfenicol ou penicilina e estreptomicina 138 Procedimentos para cultura Os materiais devidamente processados devem ser semeados na superfície dos meios de cultura com alça de níquelcromo ou pipeta Pasteur com mo vimentos em estrias em ziguezague para permitir separação de eventuais contaminantes da amostra O material não deve ser colocado em profundi dade no ágar mas apenas aderido à superfície do meio A temperatura de in cubação recomendada para todas as amostras é 30C devido à possibilidade de agente etiológico ser oportunista e desse modo crescer melhor a 30C do que a 37C no primo isolamento Além disso pensando em Brasil em que as temperaturas são muito altas nas regiões Norte e Nordeste dificilmente alcançam 25C a menos que se utilize estufa BOD body oxygen demand A temperatura de 30C é verificada mais facilmente durante muitas horas do dia Hemoculturas fazem parte da rotina diagnóstica para casos de infecção relacionada à assistência à saúde e merecem algumas recomendações à parte para isolamento de fungos Os frascos contendo meio bifásico e sangue ou aspirado de medula óssea devem ser submetidos à agitação manual periódica para maior homogeneização do oxigênio na fase líquida do frasco Exames macroscópicos diários da superfície da fase sólida são indicados para verificar aparecimento de colônias de leveduras dos gêneros Candida Cryptococcus e outros 24 h7 dias fungos filamentosos e Sporothrix schenckii 2 a 15 d e fungos dimórficos como Paracoccidioides brasiliensis Histoplasma capsulatum 15 a 30d Qualquer colônia de fungo deve ser repicada em ASD para posterior identificação O crescimento de fungos ao contrário de bactérias não resulta em turvação imediata do meio líquido de modo que a análise microscópica de uma gota do meio abrevia o prazo de resultados positivos Recomendase a pesquisa microscópica do crescimento de fungos corando por Gram duas gotas do meio líquido periodicamente em cada um dos períodos acima citados Além do exame microscópico da fase líquida um procedimento que resulta em maior sensibilidade da cultura é a realização de repiques de 1 mL da fase líquida para tubos contendo ASD ou BHI em dias alternados 2º 10º e 30º dia Visto que a maioria dos laboratórios brasileiros não trabalha com o meio bifásico podese inocular a amostra na mesma proporção de 10 em frascos de hemocultura bacteriológica e fazer a leitura como anteriormente descrito Entretanto sistemas automatizados para hemoculturas que acusam o crescimento de qualquer microorganismo em até 7 dias não permitem identificar a presença de fungos de crescimento mais lento Nesses casos a incubação por período de até 30 dias com repiques do caldo em ASD O procedimento para sangue e aspirado de medula óssea denominado lisecentrifugação não é muito difundido no Brasil pelo custo de importação do sistema O material biológico é inoculado diretamente no frasco do sistema que contém saponina que lida as células liberando assim os microorganismos intra celulares A seguir devese realizar centrifugação que direcionará os elementos fúngicos para o fundo do tubo que já contém o meio de cultura O sobrenadante é desprezado e dessa forma a cultura foi realizada evitandose subcultivos que são ne Procedimentos laboratoriais para exame direto e isolamento de fungos segundo amostra biológica Qualquer amostra biológica que mostrou resultado positivo ao exame microscópico 24 Agência Nacional de Vigilância Sanitária Anvisa 141 Identificação de leveduras morfológica e bioquímica A macromorfologia das leveduras em especial as do gênero Candida não apresenta muita diversidade e portanto nem sempre é um parâmetro sufi ciente para sua identificação Colônias de levedura obtidas de amostra biológica só devem ser identifica das quando estiverem puras ou seja sem contaminação bacteriana ou em mistura de espécies Para tanto deve ser realizado o plaqueamento de cada colônia morfologicamente distinta e confirmada sua pureza por microsco pia De cada colônia deve ser feito um repique em ASD para sua identifi cação Para isolamento e identificação presuntiva ao mesmo tempo de al gumas espécies de Candida mais frequentes está disponível no mercado o meio comercial Chromagar Candida A pesquisa de cápsula característica marcante do gênero Cryptococcus é fei ta com uma gota de tinta nanquim e uma alçada da cultura A cápsula cons tituída de material polissacarídico aparece como um halo claro ao redor dos blastoconídios de Cryptococcus e contrastam com o fundo negro da lâmina As provas fisiológicas mais comuns e mais simples para identificação de Can dida albicans e Candida sp são tubo germinativo e filamentação em cultivo em lâmina No cultivo em lâmina avaliase a capacidade de produção de hifaspseudo hifas Desse modo a presença de hifas hialinas ramificadas e sem fragmen tação é sugestiva do gênero Candida sp e se além disso desenvolver cla midósporos células de reserva em adição ao tubo germinativo positivo é identificada como Candida albicans A presença de hifas hialinas ramificadas que podem se fragmentar em esporos denominados artroconídios indica espécies dos gêneros Geotrichum e Trichosporon Assim gêneros tais como Cryptococcus Rhodotorula Geotrichum e Trichosporon também podem na maioria das vezes serem identificados apenas por sua morfologia caracte rística O restante dos gêneros e a classificação em espécies porém necessita de provas bioquímicas para sua identificação No entanto do ponto de vista clínico nem sempre é importante a identificação acurada da levedura Por outro lado a simples identificação de Ckrusei intrinsecamente resistente a fluconazol é extremamente importante A prova de urease disponível em todo laboratório de microbiologia é muito utilizada em micologia A reação positiva para urease junto com a análise 25 Módulo 8 Detecção e Identificação dos Fungos de Importância Médica morfológica permite identificação presuntiva de Cryptococcus sp Leveduras do gênero Rhodotorula são também urease positiva mas como normalmen te apresentam colônias com pigmento avermelhado ou salmão são distin guidas de Cryptococcus sp A identificação também pode ter interesse epidemiológico Para leveduras relacionadas a episódios de infecção relacionada à assistência à saúde por exemplo há grande preocupação no estudo das espécies dos agentes como marcador epidemiológico temporal e espacial de infecções como no caso de espécies de Candida que têm menor sensibilidade a antifúngicos azólicos O esquema a seguir propõe um fluxo para identificação das principais leve duras de interesse médico Figura 3 Esquema simplificado para identificação de alguns gêneros de leveduras Tubo Germinativo Candida albicans Trichosporon sp Geotrichum sp Rhodotorula sp Cultivo em lâmina Positivo Positiva Positiva Negativo Negativa Negativa Artroporadas Hifas Somente blasroconídios Prova da Urease nãoartrosporadas blastoconídios com blastoconídios sem blastoconídios Associar à pesquisa de cápsula Associar à cor da colônia Auxanograma e Zimograma Laranja Avermelhada Salmão Branca Bege Candida sp Cryptococcus sp Se as provas não conduzirem à identificação presuntiva do gênero provas de assimilação de fontes de carbono e nitrogênio auxanograma e fermen tação de carboidratos zimograma devem ser realizadas e interpretadas se gundo tabelas existentes na bibliografia recomendada ao final deste capítu lo Um exemplo simplificado é o Quadro 5 26 Agência Nacional de Vigilância Sanitária Anvisa Quadro 5 Identificação das principais leveduras de interesse médico Levedura Tg Cultivo em lâmina ur Assimilação Fermentação Hifa Ar Sa Ma La Ce Tr Ra X I NO2 GI Sa Ma La Ra Tr C albicans V C tropicafis V V C parapsifosis V V C krusei C guilliermondii V C glabrata C neoformans V V Geotrichum V Trichosporon V V V V Rhodotorula sp V V Saccharomyces V V Tg tubo germinativo Ar artrósporo UR urease Sa sacarose Ma matose La lactose Ce celubiose T trealose Ra rafinose X xifose I inositol NO2 nitrato GI glicose pos neg V variável 27 Módulo 8 Detecção e Identificação dos Fungos de Importância Médica 142 Prova do tubo germinativo A partir de uma alçada da colônia isolada fazer uma suspensão em tubo de ensaio contendo 05 mL de soro humano podese usar também soro estéril de bovino cavalo ou coelho Incubar a 37ºC durante período máximo de 3 horas Esse prazo é importante porque após esse período outras espécies de Candida e de outros gêneros formam também tubo germinativo Depo sitar então uma gota da suspensão sobre lâmina cobrir com lamínula e exa minar ao microscópio óptico A presença de tubo germinativo na forma de pequeno filamento que brota do blastoconídio sem formar constrição com a célulamãe permite a identificação presuntiva de Candida albicans Figura 4 Figura 4 Prova do tubo germinativo com blastoconídios tubo germinativo e pseudohihas de Candida albicans 143 Cultivo em lâmina para prova de filamentação e produção de clamidósporo Depositar 3 mL de ágarfubá fundido sobre uma lâmina contida sobre um suporte dentro de uma placa de Petri O suporte para a lâmina pode ser um bastão de vidro outra lâmina ou apenas dois palitos de madeira Após soli dificação do meio semear a levedura com auxílio de uma agulha em L fa zendo 2 estrias paralelas Recobrir as estrias com lamínula esterilizada Fazer uma câmara úmida acrescentando 2 mL de água destilada estéril na placa ou embebendo um algodão estéril para evitar dessecação do meio durante o período de incubação da prova Tampar a placa e após 24 horas 48 horas e 72 horas examinar a preparação em microscópio ótico A presença de hifas hialinas septadas e ramificadas caracteriza o gênero Candida e se houver formação de clamidósporos indica Candida albicans Formação exclusiva de artrósporos permite identificação de Geotrichum mas quando são forma Prova da urease 29 Módulo 8 Detecção e Identificação dos Fungos de Importância Médica 146 Fermentação de açúcares ou zimograma A capacidade de fermentar carboidratos ao lado do auxanograma irá com pletar o perfil bioquímico da levedura permitindo a identificação acurada de gênero e espécie Quadro 5 As características morfológicas são fundamen tais para concluir a identificação desde que diversas espécies têm perfis bio químicos idênticos mas morfologias distintas Para o zimograma diversas fontes de carboidratos são colocadas em tubos respectivos contendo meio básico líquido A levedura é semeada em cada tubo e após um período de até 15 dias a 25C a fermentação é revelada por formação de bolhas de gás observadas dentro de tubos de Durhan colocados previamente durante a preparação do meio básico 147 Métodos comerciais para identificação de leveduras Em se tratando de espécies de Candida o mercado já dispõe de Kits manuais como API 20C AUX BioMerieux ID 32C BioMerieux Candifast Internatio nal Microbio e metodologia semiautomatizada como os cartões de identifi cação de fungos Vitek BioMerieux 148 Identificação de fungos filamentosos Os fungos filamentosos patogênicos ou contaminantes ambientais poten cialmente oportunistas formam um grupo muito extenso impossível de ser tratado neste Manual Para identificação das diversas espécies ou grupos existe bibliografia especializada de textos manuais e atlas indicados no final do capítulo Dentro do objetivo deste Manual serão ilustrados apenas aspec tos macroscópicos e microscópicos de alguns fungos de interesse médico isolados com maior frequência no Brasil A identificação de fungos filamentosos tem como fundamento a observa ção da morfologia da colônia e aspectos microscópicos A análise da colônia visa observar cor textura superfície pigmento difusível no meio de cultura entre outros e pode ser feita no tubo de ensaio contendo a cultura primária do fungo Porém o mais adequado é a análise a partir da colônia gigante ou seja uma cultura feita no ponto central de uma camada de ágar Sabou raud Dextrose ou ágar batata distribuído em placa de Petri A velocidade de crescimento que pode ser rápida 7 dias intermediária 8 a 14 dias ou lenta 15 dias é fundamental para identificação presuntiva do fungo A observação das estruturas microscópicas tais como hifa hialina ou demá cia septada ou cenocítica forma disposição e formação dos esporos são su ficientes em geral para a identificação dos gêneros mas nem sempre para a caracterização das espécies de fungos filamentosos Em alguns grupos 30 Agência Nacional de Vigilância Sanitária Anvisa como o dos fungos demácios pode ser necessário também uso de provas bioquímicas A morfologia microscópica é mais bem visualizada com a técnica de micro cultivo que preserva a disposição original dos esporos sobre as hifas e man tém íntegras certas estruturas formadoras de esporos por exemplo os espo rângios que são órgãos de reprodução de zigomicetos 149 Técnica de microcultivo para fungos filamentosos Colocar sobre uma lâmina esterilizada contida em uma placa de Petri es téril um cubo de ágar ASD ou ágar batata A lâmina deve estar sobre um suporte que pode ser formado por outra lâmina ou um pequeno bastão de vidro recurvado ou ainda dois palitos de fósforo Semear o fungo a partir de repique recente nos 4 lados do cubo de ágar Recobrir com uma lamínula esterilizada Fazer uma câmara úmida adicionando 1 a 2 mL de água destila da estéril no fundo da placa ou embeber um pequeno chumaço de algodão estéril para evitar a dessecação do meio de cultura durante o crescimento do fungo Tampar a placa e deixar à temperatura ambiente por 7 a 10 dias até que se observe desenvolvimento de hifas com ou sem pigmentação Fi gura 6 Após esse período inativar a esporulação adicionando 1 mL de formol ao algodão e vedando a placa com fita adesiva durante 24 horas 48 horas O vapor de formol além de inativar o fungo irá auxiliar na fixação das estrutu ras microscópicas Retirar a lamínula com auxílio de uma pinça cuidadosa mente uma vez que nela deverão estar aderidas as hifas e esporos do fun go Pingar uma gota de corante azul de lactofenolalgodão Cotton Blue e montar sobre uma lâmina Desprezar o cubo de ágar e em seu lugar pingar outra gota de corante lactofenolazul algodão e recobrir com lamínula para visualizar esporos e hifas também aderidos à lâmina Observar em micros cópio ótico com objetiva de 40 X o tipo e cor da hifa forma disposição e formação de esporos Figura 6 Técnica de microcultivo para análise microscópica de fungos filamentosos Dimórficos são fungos filamentosos que podem sob determinadas condições assumir forma de levedura diminuindo a capacidade de filamentoação e dividindose por brotamento conferindo às colônias aspecto cremoso Essa fase leveduriforme ocorre sob temperatura acima de 30C de preferência a 37C São fungos de crescimento lento 15 dias no primoisolamento Histoplasma capsulatum e Paracoccidioides brasiliensis ou moderado 8 a 14 dias como Sporothrix schenckii A identificação é feita pela comprovação do dimorfismo e pelo aspecto microscópico característico de cada fase Exame da amostra com KOH a 20 revela hifas regulares hialinas septadas refringentes frequentemente artrosporadas Cultura material deve ser semeado em ASD com auxílio de uma alça em L de forma a ficar em perfeito contato com o meio de cultura As colônias de dermatófitos geralmente crescem a partir do 10º dia de incubação à temperatura ambiente e os fungos são identificados pela sua morfologia macroscópica e microscópica No Brasil os dermatófitos mais frequentes são T rubrum e T mentagrophytes e M canis Doença granulomatosa crônica que pode acometer pele mucosas linfonodos sistema respiratório trato gastrointestinal adrenais fígado baço e SNC Apresenta grande variabilidade de manifestações clínicas desde formas localizadas até formas disseminadas de mau prognóstico na dependência da resposta imune do hospedeiro Existe também a paracoccidioidomicosesinfecção em que o indivíduo não apresenta sinais e sintomas mas demonstra por testes intradérmicos positivos que entrou anteriormente em contato com o fungo Apresenta muitas semelhanças com a tuberculose A aspergilose pode se apresentar em indivíduos imunocompetentes como lesões localizadas em unhas pés canal auditivo olhos e forma broncopulmonar alérgica Em pacientes imunocomprometidos tende a forma disseminação do sulcos centrais composta de hifas hialinas finas septadas e fragmentadas em esporos multiformes As colônias incubadas entre 30ºC a 35ºC são de cor creme pregueadas e enrugadas cuja microscopia revela as formas características leveduriformes que permitem a identificação do agente Figura 10 Microscopia em cultura de Paracoccidioides spp cultivado à temperatura ambiente A e a 37ºC B Histoplasmose Doença que acomete primariamente o sistema retículoendotelial A infecção pode ser localizada ou generalizada A histoplasmose primária afeta o sistema respiratório e a histoplasmose progressiva atinge fígado baço linfonodos mucosas médula óssea etc Em indivíduos hígidos a infecção tem bom prognóstico porém atualmente é importante infecção oportunista associada a Aids nos quais ocorre a forma grave e disseminada Agente etiológico Histoplasma capsulatum Ocorrência distribuição universal principalmente em países de clima temperado Fontes de infecção inalação de esporos presentes em aerossóis formados por solos contaminados com excretas de galinhas e morcegos Procedimento laboratorial Amostra secreção do trato respiratório sangue punção de médula óssea tecido obtido por biópsia de mucosas e outros Exame microscópico direto sem coloração requer muita habilidade do técnico Recomendase coloração por Giemsa para melhor visualização do agente em cortes histológicos onde se evidencia sob imersão pequenas leveduras 25 μm intracelulares dentro de células mononucleares Microscopia em cultura de Histoplasma capsulatum cultivado à temperatura ambiente A e a 37ºC B A transformação do dimorfismo é feita através de repique em meio rico BHI e incubação entre 30C e 35C A transformação da forma filamentosa ou miceliana à fase leveduriforme é vista com a formação de pequenas 25 μm leveduras em brotamento A identificação porém é feita pela micromorfologia da forma filamentosa com a observação de esporos grandes macrocôndios arredondados e com inúmeras espículas ou granulações na parede celular chamados hipnósporos ou esporos tuberculados Figura 11 Microscopia em cultura de Histoplasma capsulatum cultivado à temperatura ambiente A e a 37ºC B 153 Micoses oportunistas Candidíase Candidíase é uma doença com manifestações clínicas variadas As infecções aguda e crônica mostram lesões na boca faringe pele unhas sistema broncopulmonar intestinal e perianal Ocasionalmente endocardite meningite fungemia ou infecções em outras localizações podem ser observadas Agentes etiológicos Candida albicans e outras espécies que estão frequentemente envolvidas em casos de micoses oportunistas em pacientes debilitados São os principais agentes etiológicos de infecções relacionadas à assistência à saúde As espécies de Candida podem ser isoladas de vários locais do corpo humano como microbiota normal da cavidade oral mucosa vaginal região perianal e trato gastrointestinal Ocorrência universal incluindo as formas graves que ocorrem sob fatores predisponentes para desenvolvimento da doença tais como desnutrição obesidade diabetes gravidez antibioticoterapia quimioterapia e uso de corticosteroides manipulação endovenosa inadequada neoplasias e outras doenças debilitantes Procedimento laboratorial Amostra dependerá da sintomatologia clínica fragmentos de pele e unhas raspados da mucosa oral vaginal ou anal secreção do trato respiratório sangue líquido urina e fezes Exame de fragmentos de pele e unhas devem ser feitos com solução de KOH 20 Secreção do trato respiratório ou material de mucosa podem ser examinados pela coloração de Gram A levedura aparece como células areoledas com brotamentos ou sem hifas Pequenas células podem ter diâmetro de 26μm mas formas maiores são também observadas Cultura o crescimento é rápido 2472 horas entre 25C e 37C O aparecimento ocorre em torno de 3 a 4 dias com formação de colônias com coloração branca a bege Criptococose A criptococose é uma infecção subaguda ou crônica que envolve primariamente os pulmões com tropismo pelo sistema nervoso central meninges podendo atingir pele e outros tecidos Agente etiológico Cryptococcus neoformans Ocorrência no homem a distribuição da doença é universal Procedimento laboratorial Amostra líquido secreção do trato respiratório ou de lesão de pele aspirado de formação tumoral subcutânea e tecidos obtidos por biópsia O exame laboratorial deverá incluir urina de preferência após massagem prostática para monitorar a presença do agente na próstata que constitui seu órgão de reserva Exame obrigatoriamente com tinta nanquim para observação de células capsuladas com diâmetro variável entre 5 μm a 20 μm que sugerem Cryptococcus sp Cultura secreção do trato respiratório líquido e tecidos podem ser cultivados em ASD ou qualquer outro meio desde que não contenham cicloheximida que inibe Cryptococcus O agente cresce rápido 7 dias entre 25C e 37C sob forma de colônias mucoides de coloração creme a parda A identificação de gênero e espécie é feita através de provas bioquímicas como teste da urease e auxanograma nada ou cerebral de alta letalidade geralmente associada a neutropenia ou a doenças debilitantes Agentes etiológicos as espécies de Fusarium mais frequentemente relacionadas em casos de infecções humanas são Fusarium solani F oxysporum F chlamydosporum e F verticillioides F moniliforme 39 Módulo 8 Detecção e Identificação dos Fungos de Importância Médica Exame com KOH a 20 revela hifas hialinas e largas 650µm cuja ca racterística principal é a ausência de septos que caracterizam as hifas cenocíticas desse grupo de fungos Cultura fungos de crescimento rápido 72 h a 25ºC em ASD com hifas áereas abundantes A identificação é feita pela microscopia da colônia que evidencia hifas cenocíticas e esporos contidos dentro de estruturas fechadas denominadas esporângios Figura 14 Micromorfologia de Rhizopus sp As localizações topográficas mais frequentes relacionadas aos agentes fún gicos estão resumidas na Tabela 1 40 Agência Nacional de Vigilância Sanitária Anvisa Tabela 1 Agentes etiológicos e localizações topográficas Dermatófitos H capsulatum P brasiliensis S schenckii Aspergillus sp Candida sp C neoforman Zigomicetos Trato respiratório x x x x x x Sangue x x x x x x Osso x x x x x Medula óssea x Pele e Unha x x Pelo x Cérebro x x x x x x Líquor x x x Ouvidos x Olhos x x Fígado e Baço x x Nasofaringe x x x x Mucosas x x x Tecidos subcutâneo e gânglios x x x x x Trato urinário x x x Trato gastrointestinal x x Corante Azul de lactofenolalgodão Composição Ácido lático 20g Cristais de fenol 20g Glicerina 20g Azul algodão 005g Água destilada 20ml Preparar Dissolver os componentes na água destilada Acertar o pH em 56 Aquecer até a completa dissolução Distribuir cerca de 10 mL por tubo Esterilizar em autoclave a 120ºC por 15 minutos Ágar sabourauddextrose com cloranfenicol Dissolver 100 mg de cloranfenicol em 10 mL de álcool 95ºC Adicionar em 1 litro de ASD antes da esterilização Ágarsabourauddextrose com cloranfenicol e cicloeximida Meios comerciais mycosel micobiotic ágar ou meio seletivo para fungos Diluir separadamente 400 mg de cicloeximida Actidione em 10 mL de acetona Diluir 50 mg de cloranfenicol em 10 mL de álcool 95ºC Misturar as soluções e adicionar em 1 litro de ASD antes da esterilização pH 70 Brain heart infusion ágar com cloranfenicol bhi Dissolver 50 mg de cloranfenicol em 10 mL de álcool 95ºC Adicionar em 1 litro de BHI preparado de acordo com as instruções do fabricante antes da esterilização Ágar fubá Composição Fubá 20 g Ágar 10 g Tween 80 5 mL Preparar Adicionar o fubá em 250 mL de água e ferver até borbulhar Filtrar o fubá em gaze dobrada em quatro Dissolver o ágar em 250 mL de água Restaurar o volume da infusão de fubá para 250 mL com água quente juntar as suspensões ajustar o pH para 66 68 e adicionar o Tween 80 Distribuir volumes de 5 mL em tubos e esterilizar em autoclave a 120ºC por 15 minutos 17 Glossário Artósporo ou artroconídio esporo formado pela desarticulação da hifa de fungos filamentosos ou leveduras Blastosporo ou blastonconídio esporos formados por brotamento ou gemulação Bolor fungo filamentoso multicelular constituído de hifas Brotamento ou gemulação reprodução com divisão de citoplasma através de estrangulamento Cenocítica hifa desprovida de septos o mesmo que hifa contínua Clamidósporo estruturas de resistência constituídas de reserva nutritiva e membrana bastante espessa permitindo resistir aos fatores externos semelhantes aos esporos Conídio esporo assexuado externo Demácio ou demaciação fungos negros que têm pigmento melânico acastanhado na parede celular Dimórfico que apresenta duas formas leveduriforme e filamentosa Esporângio órgão de reprodução assexuada interna geralmente em forma de vesícula e contém inúmeros esporos denominados de esporangiosporos Feohimeticeto fungo filamentoso demáceo Hialino que não tem cor translúcido assumindo a cor do corante utilizado Hifa reunião de células justapostas formando estrutura tubular filamentosa que compõe o corpo vegetativo dos bolores e de alguns gêneros de leveduras por ex Candida spp Himeticeto fungo filamentoso Levedura fungo em regra unicelular que se reproduz geralmente por brotamento Pseudohifa uma série de blastoquinídios que permanecem aderidos uns aos outros formando filamentos semelhantes a hifas Tuberculdo com granulações ou nodosidades 44 Agência Nacional de Vigilância Sanitária Anvisa 1 8 Referências Bibliográficas HOOG GS GUARRO J FIGUERAS MJ GENE J Atlas of Clinical Fungi 2a Ed CBS Utrecht Holanda 2000 KANE J SUMMERBELL R SIGLER L KRAJDEN S LAND G Laboratory handbook of Dermatophytes a Clinical Guide and Laboratory Manual of Dermatophytes and Other Filamentous Fungi from kin Hair and Nails Star Publishing Co Belmont Ca 1997 KURTZMAN CP FELL JW coord The Yeasts A taxonomic study Elsevier Science BV Amsterdam Holanda 1998 KWONCHUNG KJ BENNETT J E Medical Mycology 1992 LACAZ CS Porto E MARTINS JEC HEINSVACCARI EM MELO NT Tratado de Micologia Médica 9a ed Sarvier São Paulo 2002 LACAZ C da S PORTO E HEINSVACCARI EM MELO NT Guia Para Identificação de Fungos Actinomicetos e Algas de interesse médico 8º ed ed Sarvier São Paulo 1998 LARONE DH Medically Important Fungi A guide to Identification 3º ed Washington DC 2000 MAZA P MAZA B Atlas de Diagnóstico em Microbiologia ed Artmed Porto Alegre 1999 MENDESGIANNINI MJ and MELHEM MSC FUNGOS In FERREIRA AW and ÁVILA SLM Diagnóstico Laboratorial das Principais Doenças Infecciosas e AutoImunes 2ªed GuanabaraKoogan Rio de Janeiro 2001 MIDLEY G CLAYTON YM HAY RJ Diagnóstico em cores Micologia Médica Ed Manole Ltda São Paulo 1998 MINAMI PS Micologia Métodos Laboratoriais de Diagnóstico das Micoses Ed Manole Ltda São Paulo 2003 RIPPON JW Medical Mycology The pathogenic fungi and the pathogenic actinomycetes 2ª ed WB Saunders Co Philadelphia 1982 SIDRIM JJC MOREIRA JLB Fundamentos clínicos e laboratoriais da micologia médica GuanabaraKoogan Rio de Janeiro 1999 VON NOWAKONSKY A SILVA CRN MELHEM MSC Fungos e Aids diagnóstico de infecções oportunistas ed Ministério da Saúde Coordenação Nacional de Doenças Sexualmente Transmissíveis e Aids Série Telelab no22 2001 ZAITZ C CAMPBELL I MARQUES SA RUIZ LRB SOUZA VM Compêndio de Micologia Médica ed Medsi Rio de Janeiro 1998 45 Módulo 8 Detecção e Identificação dos Fungos de Importância Médica 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Prancha 1 Pranchal Legenda Figura 1 Macromorfologia de Candida albicans em ágar Sabouraud Figura 2 Placa de Petri preparada para filamentoação Figura 3 Aspecto microscópico da filamentoação de Candida albicans Figura 4 Macromorfologia de Cryptococcus neoformans em ágar Sabouraud Figura 5 Artroconídios de dermatófitos em exame direto de material clínico Figura 6 Macromorfologia de Microsporum canis em ágar Sabouraud Figura 7 Macromorfologia de Trichophyton mentagrophytes em ágar Sabouraud Figura 8 Macromorfologia de Epidermophyton floccosum em ágar Sabouraud Figura 9 Macromorfologia de Paracoccidioides brasiliensis a 37º C Figura 10 Micromorfologia de Paracoccidioides brasiliensis a 37º C Figura 11 Macromorfologia de Histoplasma capsulatum a 25º C Figura 12 Micromorfologia de Histoplasma capsulatum a 25º C Figura 13 Placa de Petri preparada com microcultivo Figura 14 Macromorfologia de Aspergillus fumigatus Figura 15 Micromorfologia de Aspergillus fumigatus Figura 16 Micromorfologia de Aspergillus fumigatus evidenciando a célula pé Figura 17 Macromorfologia de Fusarium solani Figura 18 Micromorfologia de Fusarium solani Figura 19 Macromorfologia de Rhizopus sp Figura 20 Micromorfologia de Rhizopus sp Agência Nacional de Vigilância Sanitária Anvisa SIA Trecho 5 Área especial 57 Lote 200 CEP 71205050 Brasília DF Telefone 61 3462 6000 wwwanvisagovbr wwwtwittercomanvisaoficial Anvisa Atende 08006429782 ouvidoriaanvisagovbr