Apostila de Aulas Práticas de Bioquímica: Normas de Segurança e Cuidados Especiais

Faculdade de Americana FAM BIOMEDICINA BIOQUÍMICA 2S 2022 1 Apostila de Aulas Práticas de Bioquímica Profa Dra Paula Gabriele F Quaresma Bergonsi Adaptado de Prof Dr Leandro Rodrigues Normas de Segurança e Cuidados Especiais para Trabalho em Laboratórios 1 Aula 1 Introdução ao Laboratório de Bioquímica 3 Aula 2 Análise de pH 6 Aula 3 Sistema tampão 7 Aula 4 Identificação de proteínas 9 Aula 5 Enzimas 11 Aula 6 Carboidratos 13 Aula 7 Lipídeos 16 NORMAS DE SEGURANÇA E CUIDADOS ESPECIAIS PARA TRABALHO EM LABORATÓRIOS DE QUÍMICA E BIOQUÍMICA I INTRODUÇÃO Acidentes em laboratórios ocorrem frequentemente em virtude da pressa excessiva na obtenção de resultados Todo aquele que trabalha em laboratório deve ter responsabilidade no seu trabalho e evitar atitudes ou pressa que possam acarretar acidentes e possíveis danos para si e para os demais Deve prestar atenção a sua volta e se prevenir contra perigos que possam surgir do trabalho de outros assim como do seu próprio O usuário de laboratório deve portanto adotar sempre uma atitude atenciosa cuidadosa e metódica no que faz Deve particularmente concentrarse no seu trabalho e não permitir qualquer distração durante o processo Da mesma forma não deve distrair os demais enquanto desenvolvem trabalhos no laboratório A seguir estão relacionadas algumas regras de segurança que você deverá colocar em prática para sua segurança e de seus colegas II UTILIZAÇÃO As normas de segurança abaixo relacionadas devem ser rigorosamente observadas pelos profissionais técnicos que trabalham nos Laboratórios de Química e Bioquímica bem como pelos usuários a fim de que possibilite a maior segurança possível aos funcionários e aos seus próprios colegas III REGRAS PRÁTICAS PARA O TRABALHO 1 Qualquer laboratório onde se manipule substâncias químicas é potencialmente perigoso Portanto tenha o máximo de cautela e atenção ao realizar um experimento evitando conversas e brincadeiras que dispersem a concentração 2 Existe uma regra geral que deve ser seguida neste ambiente toda substância desconhecida é potencialmente perigosa até que se prove o contrário 3 Siga rigorosamente as instruções específicas do professor Consulteo quando tiver dúvidas e aviseo de qualquer acidente que ocorra por menor que pareça 4 Tão importante quanto trabalhar em segurança é trabalhar ordenadamente com consciência da seqüência a ser realizada Leia atentamente o procedimento experimental certificandose de que todos os materiais e reagentes necessários estão disponíveis Anote os resultados obtidos relacionadoos à teoria da prática 5 Em caso de acidentes mantenha a calma e chame o professor ou técnico responsável Faculdade de Americana FAM BIOMEDICINA BIOQUÍMICA 2S 2022 2 6 Evite trabalhar sozinho e fora das horas de trabalho convencionais 7 Localize os extintores de incêndio e familiarizese com seu uso ou seja aprenda a utilizálo antes que o incêndio aconteça 8 Certifiquese do bom funcionamento dos chuveiros e lavaolhos de emergência 9 Antes de usar qualquer equipamento elétrico verifique a voltagem correta e no caso de dúvida consulte o professor ou o técnico de laboratório 10 É obrigatório o uso de avental apropriado ou seja de algodão se possível e de mangas compridas na altura dos joelhos e fechado 11 Use sapato fechado de salto baixo ou tênis durante as aulas práticas 12 Óculos protetores de segurança são requeridos durante todo o período de trabalho no laboratório 13 Brincadeiras são absolutamente proibidas nos laboratórios 14 É proibido fumar no laboratório ou em qualquer outro lugar que possa por em risco a segurança ou saúde das pessoas 15 Não coma ou beba dentro do laboratório 16 Nunca use material de laboratório para beber ou comer 17 Não prove ou engula drogas ou reagentes do laboratório 18 Caminhe com atenção e nunca corra no laboratório 19 Lentes de contato não devem ser usadas em laboratórios pois podem absorver produtos químicos e causar lesões nos olhos 20 Objetos pessoais como bolsas garrafas blusas capacetes sacolas etc devem ser guardados em armários nas áreas externas aos laboratórios 21 Aventais de laboratório luvas óculos de proteção ou outras vestimentas não devem ser usados fora do laboratório 22 Não use relógios pulseiras anéis ou qualquer ornamento durante o trabalho no laboratório 23 Alunos que possuam cabelos longos devem trabalhar com os mesmos presos durante as aulas de laboratório 24 Observe a limpeza dos materiais antes de utilizálos 25 Não trabalhe com material defeituoso principalmente o de vidro 26 Vidrarias trincadas lascadas ou quebradas devem ser descartadas pelo técnico ou professor Portanto detectando problemas desta natureza chameos 27 Nunca jogue no lixo restos de reações 28 As substâncias químicas principalmente os solventes são normalmente voláteis corrosivos e combustíveis Desta forma o uso de chama deve ser evitado quando utilizado deve se cercar de todas as precauções 29 Trabalhando com reações perigosas explosivas tóxicas ou que envolvam a liberação de gases eou vapores tóxicos devem ser realizadas na câmara de exaustão capela 30 Quando utilizar soluções e reagentes certifiquese que o rótulo esteja voltado para cima evitando que se estrague 31 Feche adequadamente os frascos das soluções e regentes principalmente os que forem voláteis e inflamáveis 32 Não jogue resíduos de solventes nas pias Resíduos de reações devem ser antes inativados depois armazenados em frascos adequados 33 Não gaste reagentes e soluções inutilmente utilize somente o necessário para o experimento 34 Os reagentes e soluções devem ser claramente identificados e as soluções apresentar data de preparo validade e o nome do analista que a preparou 35 Leia com atenção o rótulo dos reagentes para se ter certeza de que pegou frasco correto 36 Nunca retorne um reagente líquido ou sólido não utilizado para o vidro de reagente estoque 37 Evite contato com qualquer substância com a pele Seja particularmente cuidadoso quando manusear substâncias corrosivas como ácidos e bases concentrados 38 Não jogue nenhum material sólido dentro da pia ou nos ralos ainda que seja ligeiramente solúvel 39 Não aqueça substâncias inflamáveis ou voláteis em chama direta use banhomaria 40 Nunca pipete com a boca utilize pêras de borracha Faculdade de Americana FAM BIOMEDICINA BIOQUÍMICA 2S 2022 3 41 Ao aquecer um tubo de ensaio contendo qualquer substância não volte a extremidade aberta do mesmo para si ou para uma pessoa próxima 42 Sempre que proceder a diluição de um ácido concentrado adicioneo lentamente sob agitação sobre a água e NUNCA o contrário 43 Antes de manipular qualquer reagente devese ter conhecimento de suas características com relação à toxicidade inflamabilidade e explosividade 44 Certifiquese que vidros que foram aquecidos estejam frios antes de tocálos Não se esqueça tubos e materiais de vidro frios ou quentes têm a mesma aparência 45 Ao introduzir rolhas em tubos de vidro umedeçaos convenientemente e enrole a peça de vidro numa toalha ou em um papel para proteger as mãos 46 Dedique especial atenção a qualquer operação que necessite aquecimento prolongado ou que desenvolva grande quantidade de energia calor 47 Devese tomar cuidados especiais quando manipular substâncias com potencial carcinogênico 48 Todas as substâncias são tóxicas dependendo de sua concentração Nunca confie no aspecto de uma droga devese conhecer suas propriedades para manipulála 49 Nunca pese material diretamente sobre o prato da balança use béquer vidro de relógio ou papel manteiga 50 Todo acidente com reagentes deve ser limpo imediatamente protegendose se necessário No caso de ácidos e bases devem ser neutralizados antes da limpeza 51 Ao final de cada aula as vidrarias utilizadas durante o trabalho de laboratório devem ser esvaziadas nos frascos de descarte e enxaguadas com água antes de serem enviadas para limpeza 52 Ao se retirar do laboratório verifique se não há torneiras água ou gás abertas Desligue todos os aparelhos deixe todo o equipamento e vidrarias limpas e lave as mãos 53 Receber visitas apenas fora do laboratório pois elas não conhecem as normas de segurança e não estão adequadamente vestidas Faculdade de Americana FAM BIOMEDICINA BIOQUÍMICA 2S 2022 4 Proveta Bureta AULA 01 Introdução ao Laboratório de Aulas Práticas de Bioquímica Materiais de Laboratório Balão volumétrico Balão de fundo chato Balão de destilação Pipeta volumétrica Pipeta graduada Pipeta automática Condensador Aparelhos Volumétricos Pisseta Erlenmeyer Bequer Funil Tubo de ensaio Os aparelhos volumétricos são classificados em TC To contain são aparelhos de volume determinado mas que não podem ser usados com precisão para transferência de líquidos pois o líquido retido nas paredes internas do aparelho não é transferido TD To deliver são aparelhos específicos para transferência de líquidos pois apresentam seus volumes corrigidos quanto à aderência do líquido às paredes internas do aparelho Quando usados corretamente transferem com precisão o volume requerido APARELHOS VOLUMÉTRICOS TC Balões volumétricos são adequados para se obter soluções precisas de concentrações conhecidas Os balões volumétricos apresentam um traço gravado em torno do gargalo que indica o nível do líquido quando preenchido com o volume para o qual foi construído A parte mais baixa do menisco do líquido deve ser ajustada com a marca do gargalo quando o balão estiver apoiado em uma superfície plana deve ser observado na horizontal APARELHOS VOLUMÉTRICOS TD Pipetas aparelhos usados em transferência com precisão de 005 As pipetas de precisão podem ser volumétricas ou graduadas As pipetas volumétricas são tubos estreitos com um bulbo no centro Na parte superior do tubo há uma linha de referência para o acerto do menisco quando a pipeta estiver preenchida As pipetas graduadas são tubos cilíndricos graduados que permitem a transferência de volumes fracionários do volume total embora com menor precisão As pipetas automáticas são instrumentos de medida utilizados para transferência de pequenos volumes de líquidos com precisão ou seja da ordem de microlitros µL Buretas são semelhantes às pipetas graduadas porém apresentam uma torneira na parte inferior que permite o controle do fluxo do líquido transferido Quanto mais próximo do volume total maior a precisão da medida Todo equipamento volumétrico é aferido a determinada temperatura geralmente a 20oC Quando usados em temperaturas que diferem em mais de 5oC da temperatura de aferição podem ocorrer erros significativos na medida do volume interferindo no resultado experimental Faculdade de Americana FAM BIOMEDICINA BIOQUÍMICA 2S 2022 5 Provetas são usadas em transferência com baixa precisão geralmente em torno de 1 Técnica para utilização de pipetas volumétricas e graduadas 1 Determinar a pipeta ideal para o volume a ser transferido 2 Verificar a limpeza do equipamento 3 Preencher a pipeta com o líquido a ser transferido Observação utilizar pêra de sucção ou pipetador automático 4 Descartar o líquido contido na pipeta na pia 5 Preencher novamente a pipeta com o líquido a ser transferido 6 Descartar o líquido novamente porém dentro de um frasco 7 Pipetar novamente preenchendo a pipeta até o nível superior à linha de referência menisco 8 Encostar a ponta da pipeta no frasco e escoar lentamente até ajustar a parte mais baixa do menisco com a marca de referência mantendo a pipeta na posição vertical 9 Escoar a pipeta na posição vertical dentro do frasco tomando o cuidado de evitar respingos 10 Esperar aproximadamente 15 segundos após o escoamento total para pipetas volumétricas ou parcial para pipetas graduadas 11 Encostar a ponta da pipeta na superfície da parede interna do frasco e retirar a pipeta Soluções e Unidades de Concentração Soluções misturas homogêneas de duas ou mais substâncias Soluções líquidas subdivididas de acordo com o estado físico original e puro de seus componentes Por exemplo a mistura de água e álcool ou de oxigênio dissolvido em água ou ainda de glicose dissolvida em água Soluto e solvente o solvente é considerado a parte líquida de soluções constituídas de gás e líquido ou de sólido e líquido Em soluções constituídas de líquidolíquido o solvente é considerado o componente que ocupa maior volume Concentração quantidade relativa de soluto em massa em determinado volume de solvente presente em uma solução Unidades de concentração Porcentagem em peso g indica o peso em gramas de um soluto em 100 gramas de solução Porcentagem em volume gdL indica o peso em gramas de um soluto em 100 mL 1 dL de solução Concentração molar indica a quantidade em mol do soluto por litro de solução molL Esta unidade de concentração é frequentemente utilizada em bioquímica como a molaridade M de uma solução embora o mais indicado seja utilizar a expressão molL Solução milimolar mM mmolL corresponde a 0001 molL e micromolar µM µmolL corresponde a 0001 mmolL Fórmula padrão utilizada para cálculo de concentração de soluções diluídas Ci x Vi Cf x Vf Ci concentração inicial corresponde à concentração da solução estoque de alta concentração Vi volume inicial corresponde ao volume utilizado da solução estoque para preparo da solução diluída Cf concentração final corresponde à concentração da solução diluída que se deseja obter Vf volume final corresponde ao volume total da solução diluída volume inicial volume do solvente adicionado Faculdade de Americana FAM BIOMEDICINA BIOQUÍMICA 2S 2022 6 EXPERIMENTO 1 Preparação de solução Utilização de balança analítica Reagentes Permanganato de potássio KMnO4 Técnica 1 Pesar uma massa de 01 g de permanganato de potássio KMnO4 2 Transferir para um béquer e dissolver em aproximadamente 500 mL de água destilada 3 Transferir a solução para um balão volumétrico de 100 mL e completar o volume com água destilada preparando desta forma uma solução na concentração g ou gdL ou gL EXPERIMENTO 2 Diluição de soluções Utilização de pipetas Reagentes Permanganato de potássio solução 01 g Técnica 1 Numerar 5 tubos de ensaio 2 Transferir a solução de permanganato de potássio 01 g preparada no experimento 1 para os respectivos tubos de ensaio considerando os volumes indicados na tabela abaixo 3 Adicionar água destilada para diluir as soluções conforme volume indicado na tabela e homogeneizar Obs Utilizar a pipeta mais adequada considerando o volume específico para cada reagente Tubos KMnO4 01g Água destilada 1 50 mL 50 mL 2 25 mL 75 mL 3 10 mL 90 mL 4 05 mL 45 mL 5 01 mL 49 mL Questões 1 Quais as regras mínimas necessárias para trabalhar com segurança no laboratório de aula prática de bioquímica 2 Qual a diferença entre os aparelhos volumétricos Exemplificar 3 Como determinar a pipeta ideal para medir o volume de uma solução Faculdade de Americana FAM BIOMEDICINA BIOQUÍMICA 2S 2022 7 AULA 02 Análise de pH Potencial Hidrogeniônico pH log H O pH indica o caráter ácidobásico de uma solução Soluções neutras apresentam pH igual a 70 que corresponde à concentração de íons hidrogênio igual a 1 x 107 molL Soluções ácidas apresentam a concentração de íons hidrogênio maiores que 1 x 107 molL e consequentemente o pH menor que 70 Soluções básicas ou alcalinas apresentam a concentração de íons hidrogênio menores que 1 x 107 molL e consequentemente o pH maior que 70 EXPERIMENTO Verificação de pH e caracterização do caráter ácidobásico de soluções Amostras Ácido acético 01molL Acetato de sódio 01molL Ácido clorídrico 01molL Hidróxido de sódio 01molL Cocacola Suco de laranja diluído 14 com água destilada preparar 40 mL Água mineral Suco de tomate diluído 110 com água destilada preparar 40 mL Água de arroz 5g preparar 40 mL mantendo em agitação por 5 minutos Técnica 1 Identificar 9 bequeres de acordo com as substâncias presentes na tabela 2 Coletar 40 mL de cada amostra e colocar no respectivo béquer 3 Verificar o pH de cada solução com papel indicador universal de pH e com aparelho pHmetro 4 Analisar o caráter ácidobásico de cada solução considerando os valores verificados no pHmetro Resultados AMOSTRA pH papel indicador universal pH pHmetro Caráter ácido básico Ácido acético Acetato de sódio Ácido clorídrico Hidróxido de sódio Cocacola Suco de laranja Água mineral Suco de tomate Água de arroz Questões 1 O pH verificado para as soluções é ácido básico ou neutro 2 Qual a relação entre pH e concentração de H 3 Calcular o pH de uma solução que apresenta a concentração de íons hidrogênio igual a 11063 e indicar o caráter ácidobásico da solução 4 Qual sistema para determinação de pH considerando a utilização de papel indicador universal de pH e aparelho pHmetro é mais preciso Faculdade de Americana FAM BIOMEDICINA BIOQUÍMICA 2S 2022 8 AULA 03 Sistema tampão Solução Tampão é aquela que resiste à adição ou perda de ácido ou base sem que ocorra acentuada mudança na concentração hidrogeniônica da solução e consequentemente no pH Geralmente são misturas de um ácido fraco ou uma base fraca em presença do sal correspondente O pH de uma solução tampão e a variação do pH em função da adição de um ácido ou de uma base pode ser calculado à partir da equação de HendersonHasselbach onde pH pKa log sal ácido pK logarítmo negativo da constante de dissociação do ácido A análise da equação de HendersonHasselbach indica que o pH da solução será igual ao pKa ou pKb do ácido fraco ou da base quando a concentração molar de sal e de ácido for a mesma Este valor de pH corresponde ao tamponamento mais eficiente da solução caracterizado como o ponto de equilíbrio entre as moléculas doadoras ácido fraco e as aceptoras de H ânion reagindo com a mesma eficiência à adição de bases ou ácidos EXPERIMENTO 1 Caracterização de sistema tampão Reagentes Ácido acético 01molL Acetato de sódio 01molL Ácido clorídrico 01molL Hidróxido de sódio 01molL Técnica 1 Identificar 4 béqueres e colocar as soluções indicadas abaixo Béquer 1 100 mL de ácido acético 01 molL 100mL de acetato de sódio 01 molL Béquer 2 100 mL de ácido acético 01 molL 100mL de acetato de sódio 01 molL Béquer 3 200 mL de água destilada Béquer 4 200 mL de água destilada 2 Verificar o pH inicial de cada solução utilizando papel indicador universal de pH e aparelho pHmetro 3 Adicionar 10 mL de ácido clorídrico 01 molL nos béqueres numerados 1 e 3 4 Homogeneizar e verificar o pH final 5 Adicionar 10 mL de hidróxido de sódio 01 molL nos béqueres numerados 2 e 4 6 Homogeneizar e verificar o pH final 7 Interpretar os resultados Resultados BEQUER pH inicial pH final 1 2 3 4 Interpretação As soluções dos béqueres 1 e 2 resistem à variação de pH quando da adição de ácido ou base o que caracteriza SOLUÇÃO TAMPÃO Os íons acetato do Sistema Tampão reagem com os íons hidrogênio do ácido clorídrico produzindo ácido acético que devido ser fracamente dissociável não acarreta mudança apreciável no pH do meio A adição de hidróxido de sódio à solução tampão acarreta discreto aumento no valor do pH quando comparado com a mesma quantidade de hidróxido de sódio adicionada à água Na solução tampão ocorre reação dos íons hidrogênio decorrentes da dissociação do ácido acético com os Faculdade de Americana FAM BIOMEDICINA BIOQUÍMICA 2S 2022 9 4 4 3 4 2 4 4 4 2 radicais hidroxilas da base produzindo água e acetato O efeito tamponante é mais eficiente no valor de pH 476 que corresponde ao pK do ácido acético A eficácia do sistema tampão preparado em aula pode ser avaliada comparando o valor do pH verificado quando da adição da mesma concentração de sal e ácido e o valor teórico do pK CH3COO H CH3COOH CH3COOH CH3COO H EXPERIMENTO 2 Caracterização de sistema tampão biológico Reagentes Fosfato dibásico de sódio Na2HPO4 ou potássio K2HPO4 01molL Fosfato monobásico de sódio NaH2PO4 ou potássio KH2PO4 01molL Técnica 1 Numerar 2 béqueres e colocar as soluções indicadas abaixo Béquer 1 400 mL de água Béquer 2 solução tampão 200 mL de fosfato dibásico 200 mL de fosfato monobásico 2 Verificar o valor do pH gotejando 5 gotas de azul de bromotimol anotar a colocaração 3 Assoprar por 30 segundos e verificar a coloração final obtida 4 Interpretar os resultados colocar os valores de pH a partir das colorações alcançadas Resultados BEQUER pH inicial pH após assoprar 1 água 2 solução tampão Interpretação As soluções dos béqueres 1 e 2 resistem à variação de pH quando da adição de ácido ou base o que caracteriza SOLUÇÃO TAMPÃO Os íons HPO42 do Sistema Tampão reagem com os íons hidrogênio do ácido clorídrico produzindo H2PO4 que devido ser fracamente dissociável não acarreta mudança apreciável no pH do meio A adição de hidróxido de sódio à solução tampão acarreta discreto aumento no valor do pH quando comparado com a mesma quantidade de hidróxido de sódio adicionada à água Na solução tampão ocorre reação dos íons hidrogênio decorrentes da dissociação do H2PO com os radicais hidroxila da base produzindo água e HPO 2 Ao assoprar ocorre reação do CO2 com a água resultando ácido carbônico que após dissociação libera íons hidrogênio Na água os íons hidrogênio acarretam a diminuição do pH entretanto no sistema tampão os íons hidrogênio são tamponados pelo HPO42 não ocorrendo alterações significativas no valor do pH HPO 2 H H PO H2PO OH HPO 2 H O H2O CO2 H2CO3 H HCO QUESTÕES 1 Qual a função de um sistema tampão Qual o mecanismo de atuação 2 Caracterizar os termos acidose e alcalose 3 Relacionar alterações no equilíbrio da equação abaixo com o pH do sangue CO2 H2O H2CO3 H HCO3 Faculdade de Americana FAM BIOMEDICINA BIOQUÍMICA 2S 2022 10 AULA 04 Identificação de proteínas EXPERIMENTO 1 Identificação de Proteínas Reação de Biureto Soluções de polipeptídeos e proteínas na presença de Reagente de Biureto que contém íons cúpricos em meio alcalino resultam em complexo de coloração arroxeada A cor é devido a um complexo de coordenação do átomo de cobre e quatro átomos de nitrogênio cada um decorrente de uma ligação peptídica Desta forma aminoácidos e dipeptídeos não reagem com o Biureto sendo necessárias no mínimo duas ligações peptídicas para que a reação ocorra Reagentes Proteína ovalbumina solução aquosa 1g Reativo de Biureto Técnica 1 Numerar 3 tubos de ensaio e proceder conforme indicado abaixo Controle Positivo Tubo 1 20 mL de proteína ovalbumina Controle Negativo Tubo 2 20 mL de água Amostras Tubo 3 20 mL de solução de gelatina Tubo 4 20 mL de leite desnatado 2 Acrescentar 10 mL do Reativo de Biureto em cada tuboCUIDADO SOLUCÃO ALCALINA 3 Homogeneizar 4 Observar a coloração das soluções controles e comparar com a coloração das amostras Resultados Tubo 1 proteína ovalbumina Tubo 2 água Tubo 3 amostra de solução de gelatina Tubo 4 amostra de leite desnatado Interpretar os resultados avaliando a presença de proteínas na composição das amostras Faculdade de Americana FAM BIOMEDICINA BIOQUÍMICA 2S 2022 11 AULA 04 B Precipitação e purificação de proteínas EXPERIMENTO 1 Precipitação proteica com ácidos fortes A mudança de pH e o aquecimento são fatores que acarretam a desnaturação de proteínas Desnaturação é a alteração da conformação proteica podendo ocorrer alterações na estrutura tridimensional da proteína permanecendo íntegra a estrutura primária Com a desnaturação são alteradas as interações não covalentes como pontes de hidrogênio e ligações iônicas que estabilizam a conformação tridimensional das proteínas Desta forma ficam expostos os grupos hidrofóbicos presentes no interior das moléculas acarretando a interação destes grupos e coagulação proteica evidenciada através de precipitado A desnaturação acarreta a perda da atividade biológica e funcional e altera as propriedades das proteínas acarretando aumento na reatividade química e diminuição da solubilidade Reagentes Solução proteica solução aquosa de ovalbumina 1g Ácido nítrico concentrado Técnica 1 Colocar 20 mL de solução proteica em um tubo de ensaio 2 Adicionar 10 mL de ácido nítrico concentrado 3 Homogeneizar lentamente e observar o precipitado branco característico de proteínas Resultados Proteína Ovalbumina ácido nítrico EXPERIMENTO 2 Precipitação proteica com solventes orgânicos Os solventes orgânicos apresentam menor constante dielétrica que a água diminuindo a repulsão entre as cargas opostas em consequência ocorrendo maior interação entre as moléculas proteicas e diminuição da solubilidade A adição de etanol constante dielétrica igual a 24 ou acetona constante dielétrica igual a 214 em uma solução proteica aquosa constante dielétrica da água igual a 80 aumenta as forças de atração entre as cargas opostas acarretando agregação das moléculas Em meio ácido ou alcoólico pode ser observada a precipitação da glicoproteína mucina presente na saliva A mucina constitui de 01 a 03 dos componentes da saliva e caracteriza a alta viscosidade deste fluido bucal que normalmente apresenta densidade da ordem de 1000 a 1020 Reagentes Etanol anidro Acetona Técnica 1 Identificar dois tubos de ensaio e colocar Tubo 1 10 mL de leite 20 mL de etanol Tubo 2 10 mL de leite 20 mL de acetona 2 Homogeneizar e observar o precipitado branco característico de proteínas Resultados Tubo 1 leite etanol Tubo 2 leite acetona Faculdade de Americana FAM BIOMEDICINA BIOQUÍMICA 2S 2022 12 A P x C mg de glicose em 100mL de soro Onde A absorbância da amostra P absorbância do padrão C concentração do padrão mgdL AULA 05 Enzimas EXPERIMENTO 1 Determinação de glicose em soro ou plasma A glicose pela ação catalítica da glicose oxidase GOD é oxidada a ácido glicônico formandose também peróxido de hidrogênio este pela ação da peroxidase POD se decompõe e o oxigênio liberado oxida a odianisidina produzindose um complexo de coloração pardoavermelhada cuja intensidade é diretamente proporcional à concentração de glicose existente na amostra Reagentes Soro ou plasma Padrão de glicose 100mgdL Tampão fosfato 01M pH 70 Mistura de reação glicose oxidase peroxidase e solução de odianisidina Técnica a Coleta de sangue b Inicio da parte bioquímica 1 Numerar 5 tubos de ensaio e colocar 002 mL 20μL das seguintes soluções Tubo 1 soro 1 002 mL Tubo 2 soro 2 002 mL Tubo 3 soro 3 002 mL Tubo 4 padrão de glicose 002 mL Tubo 5 água destilada 002 mL 2 Adicionar em cada um dos tubos 2mL de mistura de reação agitar e deixar em repouso a 37C durante 15 minutos evitandose a luz direta 3 Efetuar as leituras espectrofotométricas em 500 nm ajustando o zero do aparelho com o tubo correspondente ao branco 4 Cálculos Resultados Tubo Amostra Leitura Espectrofotômetro Concentração de glicose mgdL Tubo 1 soro 1 Tubo 2 soro 2 Tubo 3 soro 3 Tubo 4 padrão de glicose Tubo 5 água destilada Faculdade de Americana FAM BIOMEDICINA BIOQUÍMICA 2S 2022 13 AULA 06 Caracterização de carboidratos EXPERIMENTO 1 Identificação de Carboidratos Reação de Molisch Os carboidratos em presença de ácido sulfúrico concentrado são desidratados originando furfural ou derivados A complexação de furfural com substâncias fenólicas reativo de Molisch origina produtos coloridos A reação de Molisch não é específica para carboidratos entretanto constitui prova qualitativa da presença de carboidratos em uma amostra 3H2O glicose Hidroxi metil furfural OH HIDROXI METIL FURFURAL PRODUTO COLORIDO Reagentes naftol Solução aquosa 1 g de glicose frutose maltose sacarose e amido Reativo de Molisch Ácido sulfúrico concentrado Técnica 1 Numerar 9 tubos de ensaio e colocar 20mL de cada solução indicada abaixo Controles Positivos Monossacarídeos Tubo 1 20 mL de solução de glicose 1g Tubo 2 20 mL de solução de frutose 1g Dissacarídeos Tubo 3 20 mL de solução de maltose 1g Tubo 4 20 mL de solução de sacarose 1g Polissacarídeo Tubo 5 20 mL de solução de amido 1g Controle Negativo Tubo 6 20 mL de água destilada Amostras Tubo 7 20 mL de leite Tubo 8 20 mL de suco de fruta Tubo 9 20 mL de suspensão de batata 2 Acrescentar 5 gotas do Reativo de Molisch em cada tubo Homogeneizar 3 Adicionar 20 mL de ácido sulfúrico concentrado lentamente pelas paredes de cada tubo CUIDADO 4 Observar 5 O aparecimento de um anel violeta na interfase das soluções caracteriza a presença de carboidratos 6 Comparar os padrões com as amostras PREENCHER A TABELA DE RESULTADOS Interpretar os resultados avaliando a presença de carboidratos na composição das amostras Faculdade de Americana FAM BIOMEDICINA BIOQUÍMICA 2S 2022 14 EXPERIMENTO 2 Caracterização de Carboidratos Redutores Reação de Fehling Os carboidratos que possuem hidroxila semiacetálica livre podem reduzir íons por exemplo de Cu e Ag O Reativo de Fehling é constituído de solução de sulfato de cobre Fehling A e tartarato duplo de sódio e potássio em meio fortemente alcalino Fehling B O sulfato de cobre em meio alcalino forma hidróxido cúprico O tartarato duplo de sódio e potássio complexase com os íons Cu não ocorrendo a precipitação do hidróxido cúprico O carboidrato redutor na presença do reativo de Fehling é oxidado a ácido do carboidrato e o cobre é reduzido a óxido cuproso que pode ser evidenciado pela presença de um precipitado vermelho tijolo O ácido é em seguida salificado pela base alcalina A quantidade de Cu reduzido a Cu é proporcional à quantidade de carboidrato redutor presente na amostra Reagentes Solução aquosa 1 g de glicose frutose sacarose maltose e amido Reativo de Fehling A e Fehling B Técnica 1 Numerar 9 tubos de ensaio e colocar 20mL de cada solução indicada abaixo Controles Monossacarídeos Tubo 1 20 mL de solução de glicose 1g Positivos Redutores Tubo 2 20 mL de solução de frutose 1g Dissacarídeo Redutor Tubo 3 20 mL de solução de maltose 1g Controles Dissacarídeo não Redutor Tubo 4 20 mL de solução de sacarose 1g Negativos Polissacarídeo não Redutor Tubo 5 20 mL de solução de amido 1g Amostras Tubo 6 20 mL de água destilada Tubo 7 20 mL de leite Tubo 8 20 mL de suco de fruta Tubo 9 20 mL de suspensão de batata 2 Acrescentar 10 mL do Reativo de Fehling A mais 10mL do Reativo de Fehling B CUIDADO em cada tubo Homogeneizar 3 Aquecer em banhomaria fervente por aproximadamente 2 minutos 4 Retirar do banhomaria e observar a coloração das soluções Coloração marrom tijolo indica a presença de carboidrato redutor 5 Comparar os controles com as amostras e avaliar a presença de carboidratos redutores na composição das amostras PREENCHER A TABELA DE RESULTADOS Interpretar os resultados avaliando a presença de carboidratos na composição das amostras Faculdade de Americana FAM BIOMEDICINA BIOQUÍMICA 2S 2022 15 EXPERIMENTO 3 Caracterização de Polissacarídeos Reação de Lugol O amido é um polissacarídeo constituído de duas glicosanas distintas a amilose e a amilopectina Em meio aquoso a cadeia linear longa não ramificada de amilose assume várias formas entre elas a helicoidal Nesta forma apresenta a propriedade de fixar iodo no interior da hélice resultando em complexo corado em azul O glicogênio apresenta uma glicosana mais ramificada que a amilopectina adquirindo coloração vermelha na presença de iodo Reagentes Solução aquosa 1 g de glicose frutose sacarose maltose e amido Reativo de lugol Técnica 1 Numerar 9 tubos de ensaio e colocar 20mL de cada solução indicada abaixo Monossacarídeos Tubo 1 20 mL de solução de glicose 1g Controles Tubo 2 20 mL de solução de frutose 1g Negativos Dissacarídeos Tubo 3 20 mL de solução de maltose 1g Tubo 4 20 mL de solução de sacarose 1g Controle Positivo Polissacarídeo Tubo 5 20 mL de solução de amido 1g Amostras Tubo 6 20 mL de água destilada Tubo 7 20 mL de leite Tubo 8 20 mL de suco de fruta Tubo 9 20 mL de suspensão de batata 2 Acrescentar 2 gotas do Reativo de Lugol em cada tubo 3 Homogeneizar 4 Observar a coloração das soluções Coloração azul intensa indica a presença de polissacarídeo amido 5 Comparar os padrões com as amostras e identificar a presença de amido na composição das amostras PREENCHER TABELA DE RESULTADOS Interpretar os resultados avaliando a presença de amido na composição das amostras Resultados Tubo Solução Presença de anel Molisch Coloração Fehling Coloração Lugol Tubo 1 solução de glicose 1g Tubo 2 solução de frutose 1g Tubo 3 solução de maltose 1g Tubo 4 solução de sacarose 1g Tubo 5 solução de amido 1g Tubo 6 água destilada Tubo 7 leite Tubo 8 suco de fruta Tubo 9 suspensão de batata Questões 1 Através dos resultados apresentados na tabela podemos concluir que existem carboidratos nos tubos 78 9 Como poderíamos classificar os carboidratos nas soluções Faculdade de Americana FAM BIOMEDICINA BIOQUÍMICA 2S 2022 16 AULA 07 Lipídeos EXPERIMENTO 1 Solubilidade de Triglicerídeos A solubilidade dos triglicerídeos depende da polaridade do solvente Considerando que semelhante dissolve semelhante os triglicerídeos são mais facilmente solúveis em solventes menos polares como a acetona Reagentes Álcool etílico e Acetona Técnica 1 Numerar 3 tubos de ensaio e colocar 5 gotas de óleo de soja em cada tubo 2 Acrescentar 50 mL de água destilada no tubo 1 50 mL de álcool etílico no tubo 2 e 50 mL de acetona no tubo 3 3 Homogeneizar 4 Verificar a solubilidade do óleo de soja em cada solvente considerando que solução límpida caracteriza solubilidade total sistema turvo caracteriza solubilidade parcial e sistema heterogêneo bifásico caracteriza insolubilidade Resultados Tubo 1 óleo água Tubo 2 óleo etanol Tubo 3 óleo acetona EXPERIMENTO 2 Identificação de Ácidos Graxos Livres Nos triglicerídeos a maior parte dos ácidos graxos encontrase na forma esterificada ocorrendo apenas traços na forma livre Os ácidos graxos livres sofrem dissociação em água conferindo à solução um caráter levemente ácido Reagentes Papel indicador universal de pH Técnica Verificar o pH do óleo de soja utilizando papel indicador universal de pH Resultados pH EXPERIMENTO 3 Prova do Corante O corante apresenta característica hidrofóbica e lipossolúvel Reagentes Corante Sudan IV Técnica 1 Colocar 30 mL de água destilada em um tubo de ensaio 2 Acrescentar uma ponta de espátula de corante sudan IV e agitar 3 Observar a solubilidade do corante em água 4 Acrescentar 50 gotas de óleo de soja e tornar a agitar 5 Observar a solubilidade do corante em óleo Faculdade de Americana FAM BIOMEDICINA BIOQUÍMICA 2S 2022 17 Resultados Solubilidade do corante em água Solubilidade do corante em óleo EXPERIMENTO 4 Caracterização do Glicerol Teste da Acroleína O glicerol quando aquecido sofre reação de desidratação e oxidação intramolecular formando o produto propenal2 comumente denominado de acroleína O bissulfito de potássio tem a função de catalisar a reação de desidratação A produção de acroleína comprova que a porção alcoólica do triglicerídeo é constituída do álcool glicerol Reagentes Glicerol Bissulfito de potássio Técnica 1 Numerar 2 tubos de ensaio e proceder conforme esquema abaixo Tubo 1 5 gotas de glicerol Cristais de Bissulfito de potássio Tubo 2 5 gotas de óleo de soja Cristais de Bissulfito de potássio 2 Aquecer em chama direta do bico de Bunsen 3 Observar 4 O aparecimento de fumaça branca com forte cheiro irritante caracteriza a formação de acroleína 5 Interpretar os resultados considerando o princípio do experimento e a presença de glicerol na composição do óleo de soja Resultados Tubo 1 glicerol Tubo 2 óleo vegetal Faculdade de Americana FAM BIOMEDICINA BIOQUÍMICA 2S 2022 18 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ARANHA FL Bioquímica Didática Ed Copola Campinas 1998 BERNARDES CF Bioquímica Experimental Manual Campinas 2001 BERNARDES CF GÁSPARI PE Bioquímica Experimental 2004 BOBBIO FO BOBBIO PA Manual de Laboratório de Química de Alimentos Ed Livraria Varela São Paulo 1995 CAMPBELL MK Bioquímica Ed Artmed Porto alegre 2000 CAMPBELL JM CAMPBELL JB Matemática de Laboratório Ed Roca São Paulo 1986 CECCHI HM Fundamentos Teóricos e Práticos em análise de Alimentos Ed Da UNICAMP Campinas 2001 CHAMPE PC HARVEY RA Bioquímica Ilustrada Ed Artmed Porto alegre 2000 CISTERNAS JR VARGA J MONTE O Fundamentos de Bioquímica Experimental Ed Atheneu São Paulo 1997 COLLINS CH BRAGA GL Introdução a Métodos Cromatográficos Ed UNICAMP Campinas 1997 DEVLIN TM Manual de bioquímica com correlações clínicas Ed Edgard Blucher Ltda São Paulo 2000 FOX EL BOWERS RW FOSS ML Bases Fisiológicas da Educação Física e dos Desportos Ed Guanabara Koogan Rio de Janeiro 1991 HIRANO ZMB e col Bioquímica Manual Prático Universidade Regional de Blumenau EDIFURB Blumenau 2001 HOUSTON ME Bioquímica Básica da Ciência do Exercício Ed Roca São Paulo 2001 LEHNINGER AL NELSON DL COX MM Princípios de Bioquímica Ed Sarvier São Paulo 2002 MARZZOCO A TORRES BB Bioquímica Básica Ed Guanabara Rio de Janeiro 1999 MONTGOMERY RF e col Bioquímica uma abordagem dirigida por casos Ed Artes Médicas São Paulo 1994 MORETTO E FETT R Tecnologia de óleos e gorduras vegetais Ed Varela São Paulo 1998 MURRAY RK GRANNER DK MAYES PA RODWELL VM Harper bioquímica Ed Atheneu São Paulo 2002 NEPOMUCENO MF RUGGIERO AC Manual de Bioquímica Ed Tecmedd Ribeirão Preto SP 2004 RAVEL R Laboratório clínico 6ª ed Ed Guanabara Koogan Rio de Janeiro 1997 REMIÃO JOR SIQUEIRA AJS AZEVEDO AMP Bioquímica guia de aulas práticas Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul EDIPUCRS Porto Alegre 2003 SILVA DJ Análise de alimentos Ed Universidade Federal de Viçosa 1998 STRYER L Bioquímica Ed Guanabara Koogan Rio de Janeiro 1996 VILLELA GG BACILA M TASTALDI H Técnicas e experimentos de bioquímica Rio de Janeiro Guanabara Koogan 1973 ZANCAN GT e col Bioquímica aulas práticas Universidade Federal do Paraná 6ª Ed Curitiba 2002