Apostila de Aulas Práticas de Análises Citológicas e Biotecnologia

APOSTILA DE AULAS PRÁTICAS UC Análises Citológicas e Biotecnologia Professores Aline Martins Flávio Araújo Leandro Gonzaga Alun Curso Belo Horizonte 20222 2 Normas adotadas no laboratório É obrigatório o uso de equipamentos de proteção individual EPI jaleco luvas máscaras e vestimenta adequada sapato fechado não é permitido sapatilhas cabelos presos e calça comprida sem exposição da pele Obs É de responsabilidade do aluno a aquisição dos EPIs para a utilização durante as aulas práticas Os alunos deverão observar o horário tolerância máxima de atraso são 10 minutos Trazer o roteiro sempre Não fumar não comer nem levar à boca nenhum material para evitar a contaminação do operador Proibida a utilização de celular durante a execução das atividades práticas devendo o mesmo estar no modo silencioso ou desligado e guardado em bolsa ou mochila Material pessoal como mochilas e bolsas deverá ser mantido no escaninho durante todo período da aula prática No Laboratório o aluno deverá Ser rigoroso na atenção técnica e disciplina evitando desta forma a ocorrência de erros que invalidam parcial ou totalmente o trabalho realizado e acarretam em desperdício de material reagentes e tempo Manter o máximo de atenção e se comportar a fim de criar um ambiente silencioso para o aprendizado ao longo de todas as aulas Não realizar experiências extras a título de curiosidade pois podem levar a reações inesperadas Afim de alcançar a eficiência desejada é necessário ler as práticas com antecedência Colocar sobre a bancada apenas o material estritamente necessário como lápis borracha caneta régua e apostila de trabalhos práticos Demais objetos deverão ser deixados fora da bancada de trabalho em lugar designado Conservar a bancada de trabalho sempre limpa durante e ao término das aulas Ao término da aula a bancada deverá estar em condições de ser novamente utilizada Reagentes e respectivas pipetas estarão dispostas junto aos mesmos em uma bancada especifica e deverão ser utilizadas com atenção para evitar trocas Também deverão ser 3 transferidas alíquotas dos reagentes para beckers para evitar contaminação Cautela no trabalho com substâncias cáusticas tóxicas ácidos em geral substâncias inflamáveis e vidraria Os reagente corrosivos ou tóxicos ácidos ou bases fortes quando muito concentrados não deverão ser pipetados diretamente sendo medidos em provetas ou em alguns casos em buretas ou com auxílio de uma pêra Evitar tocar cheirar ou manusear produtos que tenham derramado ou extravasado de algum recipiente Manter o rosto o mais distante possível durante as operações de mistura ou aquecimento de reagentes Ao acender o bico de gás bico de Bunsen aproximar primeiro a chama ao bico e em seguida abrir o registro Mantenha o bico de gás aceso somente quando necessário CUIDADO verifique se não há substâncias inflamáveis por perto Seguir as normas de uso de cada equipamento Em caso de acidente quebra de material ou equipamento comunicar imediatamente ao professor Respeitar as normas de biossegurança e descarte A imagem abaixo apresenta a classificação dos resíduos e a forma correta de descarte Luvas máscaras toucas papel toalha e algodão devem ser descartados no lixo infectante saco branco devidamente identificado Resíduos comuns devem ser descartados no lixo comum saco preto devidamente identificado Agulhas lâminas lamínulas vidros e tubos de coleta devem ser descartados na caixa de perfurocortantes Na dúvida pergunte Excelente semestre de muito aprendizado para todos nós 4 Aula Prática 1 Coleta CérvicoVaginal Informações sobre a coleta Ministério da Saúde Secretaria de Atenção à Saúde Departamento de Atenção Básica A qualidade do exame citopatológico são fundamentais para o rastreamento de alterações cervicais Todas as etapas como coleta acondicionamento e o transporte das amostras conduzidos devem ser conduzidos de forma adequada Os profissionais de saúde devem assegurarse de que estão preparados para realizar todas as etapas do procedimento e de que dispõem do material necessário para tanto A garantia de esfregaço satisfatório para avaliação oncótica ocorre na presença de células em quantidade representativa bem distribuídas fixadas e coradas de tal modo que sua visualização permita uma conclusão diagnóstica A amostra é considerada insatisfatória quando sua leitura esteja prejudicada por material acelular ou hipocelular 75 do esfregaço De acordo com a Organização Mundial da Saúde o limite máximo de amostras insatisfatórias esperado é de 5 do total de exames realizados Recomendações prévias A utilização de lubrificantes espermicidas ou medicamentos vaginais deve ser evitada por 48 horas antes da coleta pois essas substâncias recobrem os elementos celulares dificultando a avaliação microscópica prejudicando assim a qualidade da amostra para o exame citopatológico A realização de exames intravaginais como a ultrassonografia também deve ser evitada nas 48 horas anteriores à coleta pois é utilizado gel para a introdução do transdutor Embora usual a recomendação de abstinência sexual prévia ao exame apenas se justifica quando são utilizados preservativos com lubrificante ou espermicidas Na prática a presença de espermatozoides não compromete a avaliação microscópica O exame não deve ser feito no período menstrual pois a presença de sangue pode prejudicar o diagnóstico citopatológico Devese aguardar o quinto dia após o término da menstruação Em caso de sangramento vaginal anormal o exame ginecológico é mandatório e a coleta se indicada pode ser realizada 5 Espaço físico necessário O consultório ou sala de coleta deve ser equipado para a realização do exame ginecológico com Mesa ginecológica Escada de dois degraus Mesa auxiliar Foco de luz com cabo flexível Biombo ou local reservado para troca de roupa Cesto de lixo Material necessário para coleta Espéculo de tamanhos variados preferencialmente descartáveis se instrumental metálico deve ser esterilizado de acordo com as normas vigentes Balde com solução desincrostante em caso de instrumental não descartável Lâminas de vidro com extremidade fosca Espátula de Ayre Escova endocervical Par de luvas descartáveis Pinça de Cherron Solução fixadora álcool a 96 ou spray de polietilenoglicol Gaze Recipiente para acondicionamento das lâminas mais adequado para o tipo de solução fixadora adotada pela unidade tais como frasco portalâmina tipo tubete ou caixa de madeira ou plástica para transporte de lâminas Formulários de requisição do exame citopatológico Fita adesiva de papel para a identificação dos frascos Lápis grafite ou preto nº 2 Avental ou camisola preferencialmente descartáveis Caso sejam reutilizáveis devem ser encaminhados à rouparia para lavagem segundo rotina da unidade básica de saúde Lençóis preferencialmente descartáveis Caso sejam reutilizáveis devem ser encaminhados à rouparia para lavagem 6 Etapas do atendimento prévias à coleta Identificação checar nome data de nascimento endereço Informação explicar o propósito do exame citopatológico e as etapas do procedimento História clínica perguntar a data da última menstruação se faz uso de métodos anticoncepcionais se utilizou lubrificantes espermicidas medicamentos vaginais realizou exames intravaginais ou teve relações sexuais com preservativos nas 48 horas anteriores quando foi realizado o último exame citopatológico ocorrência de exames citopatológicos anormais investigações eou tratamentos sangramentos vaginais póscoito ou anormais história obstétrica Preenchimento dos dados nos formulários para requisição de exame citopatológico do colo do útero é de fundamental importância o correto preenchimento pois dados incompletos ou ausentes podem comprometer a análise do material Preparação da lâmina a lâmina e o frasco ou caixa de portalâminas que serão utilizados para colocar o material a ser examinado devem ser preparados previamente O uso de lâmina com bordas lapidadas e extremidade fosca é obrigatório Verificar se a lâmina está limpa e caso necessário limpála com gaze a lâmina deve ser identificada com as iniciais do nome da mulher e o seu número de registro na unidade com lápis preto nº 2 ou grafite na extremidade fosca pois o uso de caneta hidrográfica ou esferográfica pode levar à perda da identificação do material já que essas tintas se dissolvem durante o processo de coloração das lâminas no laboratório o frasco ou a caixa de porta lâmina devem também ser identificados a lápis para evitar a perda de informações quando há derrame de álcool Solicitar que a mulher esvazie a bexiga e troque a roupa em local reservado por um avental ou camisola Procedimento de coleta O profissional de saúde deve lavar as mãos com água e sabão e secálas com papeltoalha antes e após o atendimento A mulher deve ser colocada na posição ginecológica adequada o mais confortável possível Cubraa com o lençol Posicionar o foco de luz Colocar as luvas descartáveis Sob boa iluminação observar atentamente os órgãos genitais externos prestando atenção à distribuição dos pelos à integralidade do clitóris do meato uretral dos grandes e pequenos lábios à presença de secreções vaginais de sinais de inflamação de veias varicosas e outras lesões como úlceras fissuras verrugas e tumorações 7 Colocar o espéculo que deve ter o tamanho escolhido de acordo com as características perineais e vaginais da mulher a ser examinada Não deve ser usado lubrificante mas em casos selecionados principalmente em mulheres idosas com vaginas extremamente atróficas recomendase molhar o espéculo com soro fisiológico O espéculo deve ser introduzido suavemente em posição vertical e ligeiramente inclinado de maneira que o colo do útero fique exposto completamente o que é imprescindível para a realização de uma boa coleta Iniciada a introdução fazer uma rotação deixandoo em posição transversa de modo que a fenda da abertura do espéculo fique na posição horizontal Uma vez introduzido totalmente na vagina abrir lentamente e com delicadeza Na dificuldade de visualização do colo sugira que a mulher tussa não surtindo efeito solicite ajuda de outro profissional mais experiente Nessa fase do exame também é importante a observação das características do conteúdo e das paredes vaginais bem como as do colo do útero Os dados da inspeção do colo do útero são muito importantes para o diagnóstico citopatológico e devem ser relatados na requisição do exame citopatológico A coleta do material deve ser realizada na ectocérvice e na endocérvice em lâmina única A amostra de fundo de saco vaginal não é recomendada pois o material coletado é de baixa qualidade para o diagnóstico oncótico Para coleta na ectocérvice utilizase espátula de Ayre do lado que apresenta reentrância Encaixar a ponta mais longa da espátula no orifício externo do colo apoiandoa firmemente fazendo uma raspagem em movimento rotativo de 360 em torno de todo o orifício cervical para que toda superfície do colo seja raspada e representada na lâmina procurando exercer uma pressão firme mas delicada sem agredir o colo para não prejudicar a qualidade da amostra Para coleta na endocérvice utilizar a escova endocervical Recolher o material introduzindo a escova endocervical e fazer um movimento giratório de 360 percorrendo todo o contorno do orifício cervical Estender o material sobre a lâmina de maneira delicada para a obtenção de um esfregaço uniformemente distribuído fino e sem destruição celular A amostra ectocervical deve ser disposta no sentido transversal na metade superior da lâmina próximo da região fosca previamente identificada com as iniciais da mulher e o número do registro O material retirado da endocérvice deve ser colocado na metade inferior da lâmina no sentido longitudinal 8 O esfregaço obtido deve ser imediatamente fixado para evitar o dessecamento do material É importante observar a validade do fixador Na fixação com álcool a 96 considerada mundialmente como a melhor para os esfregaços citológicos a lâmina deve ser colocada dentro do frasco com álcool em quantidade suficiente para que todo o esfregaço seja coberto fechar o recipiente cuidadosamente e envolvêlo com a requisição Na fixação com spray de polietilenoglicol borrifase a lâmina que deve estar em posição horizontal imediatamente após a coleta com o spray fixador a uma distância de 20cm Fixação e Fixadores Função do fixador preservação da estrutura celular e conservação dos detalhes evitando a distorção celular o aparecimento de artefatos e a perda da afinidade tintorial Tempo de fixação mínimo de 15 minutos Tipos de fixadores o álcool etílico a 95 9 o fixadores de cobertura o banho antes da coloração Acondiciona se cuidadosamente a lâmina em uma caixa de lâminas revestida com espuma de náilon e papel a fim de evitar a quebra para o transporte ao laboratório lacrandose a tampa da caixa com fita gomada Fechar o espéculo não totalmente evitando beliscar a mulher Retirar o espéculo delicadamente inclinando levemente para cima observando as paredes vaginais Retirar as luvas Auxiliar a mulher a descer da mesa Solicitar que ela troque de roupa Informar sobre a possibilidade de um pequeno sangramento que poderá ocorrer depois da coleta tranquilizandoa que cessará sozinho Enfatizar a importância do retorno para o resultado e se possível agendar conforme rotina da unidade básica de saúde Envio do material para o laboratório As lâminas devem ser enviadas para o laboratório devidamente acondicionadas e acompanhadas dos formulários de requisição Citologia em Meio líquido A citologia em meio líquido ocorre de modo diverso da citologia convencional Após a coleta o material é colocado em um recipiente com um material conservante o qual possui a capacidade de preservar o material genético As lâminas são preparadas de forma automatizada 10 Questões 1 Qual a importância da coleta e fixação 2 Faça um comparativo entre a coleta convencional e coleta em meio líquido 11 Coloração Papanicolau 1 Com o auxílio de uma espátula fazer a raspagem nas bochechas e passar na lâmina 2 Colocar imediatamente no álcool Aguardar 15 minutos para fixação Coloração 3 Após a fixação mergulhar a lâmina na água destilada por 30 segundos ou fazer vários mergulhos 4 Com o auxílio de uma pipeta de pasteur colocar a hematoxilina e deixar por 4 minutos 5 Lavar o excesso de corante com água corrente delicadamente 6 Mergulhar a lâmina no álcool por 30 segundos ou fazer vários mergulhos 7 Com o auxílio de uma pipeta de pasteur colocar o Orange G e deixar por 2 minutos 8 Mergulhar a lâmina no álcool por 30 segundos ou fazer vários mergulhos 9 Mergulhar a lâmina no álcool por 30 segundos ou fazer vários mergulhos 10 Com o auxílio de uma pipeta de pasteur colocar o corante EA e deixar por 2 minutos 11 Mergulhar a lâmina no álcool por 30 segundos ou fazer vários mergulhos 12 Mergulhar a lâmina no álcool por 30 segundos ou fazer vários mergulhos 13 Deixar secar em temperatura ambiente Após a secagem completa colocar algumas gostas de verniz e lamínula Questões 2 Descreva o mecanismo de ação de cada corante utilizado no processo de coloração 3 Qual a função do álcool 12 AULA PRÁTICA Nº 02 Visualização de Células Epiteliais Microscopia Reconhecimento das células escamosas glandulares e metaplásicas OBJETIVO Visualização de Células epiteliais através de microscopia Preparo de lâmina Materiais o lâminas de vidro para microscopia o lamínulas de vidro para microscopia o álcool 70 o Swab bucal o papel toalha o azul de metileno 05 o água destilada pisseta o Pipeta pasteur o Microscópios biloculares Procedimento experimental Realizar uma leitura atenta dos cuidados com o microscópio Evite o arrastamento do equipamento Quando arrastamos o microscópio as lentes saem de sua conformação original e com isso perde a qualidade de foco Se for necessário arrastar o microscópio na bancada façao lentamente sem movimentos bruscos Na remoção do equipamento segureo firmemente com uma das mãos no braço e outra na base Não deixar o aparelho com a luz acesa se não tiver realizando uma observação Ao finalizar o uso do MO seguir as regras do equipamento desligar o aparelho primeiro para depois desligar na tomada Enrolar o fio e colocar a capa Apenas o relatório de prática e material para escrita devem estar sobre a bancada O restante do material deverá ser colocado nas bancadas laterais do laboratório 13 Parte 1 1 Identificar as partes numeradas do microscópio óptico binocular a Qual o aumento das lentes oculares b Considerando o aumento da lente ocular os objetos observados serão ampliados nas lentes objetivas 4X 10X 100X em quantas vezes respectivamente c Escrever em um pedaço pequeno de papel a Letra B Colocar sobre uma lâmina para apoio e levar a mesa do MO Observar na objetiva de 4X Anotar o que visualizou abaixo Parte 2 Visualização Células da mucosa Como realizar a observação da lâmina no microscópio Abaixar a mesa ao máximo com ajuda do parafuso macrométrico Colocar a lâmina na mesa Ajustar a lâmina no centro com a ajuda do charriot Encaixar a objetiva de 4x e colocar os olhos na lente ocular Subir a mesa com ajuda do parafuso macrométrico até visualizar o objeto Realizar o ajuste fino com o parafuso micrométrico Para aumento girar o revólver para a objetiva de 10x Realizar o ajuste fino com o parafuso micrométrico Para aumento girar o revólver para a objetiva de 40x Realizar o ajuste fino com o parafuso micrométrico 14 OBS Não iremos utilizar a lente objetiva de imersão aumento de 100X Quando terminar de observar girar o revólver para voltar para a objetiva de 4x e descer a mesa toda Tirar a lâmina do microscópico Procedimento experimental 1 Com um palito de picolé ou swab raspar levemente a parte interna da bochecha 2 Fazer um esfregaço espalhando sobre uma lâmina de vidro o material raspado da bochecha 3 Fixar o material mergulhando a lâmina com o esfregaço em álcool 70 Aguardar 2 minutos 4 Retirar a lâmina do álcool e escorrer o excesso de líquido em um pedaço de papel filtro 5 Colocar a lâmina sobre a bancada e pingar sobre a região do esfregaço uma gota de azul de metileno Aguardar 2 minutos 6 Com o auxílio de uma pisseta remover o excesso de azul de metileno jogando sobre a lâmina um jato de água 7 Com o auxílio do frasco contagotas pingar uma gota de água sobre a região do esfregaço Cobrir a preparação com uma lamínula 8 Retirar as bolhas de ar pressionando levemente a lamínula com a pinça 9 Colocar a preparação dentro de um pedaço de papel filtro dobrado Pressionar levemente para retirar o excesso de líquido 10 Observar ao microscópio o material usando a objetiva de 4x de 10x e em seguida a de 40x Girar vagarosamente o micrométrico para obter o melhor foco Fazer um desenho das células observadas Ampliação Ampliação Ampliação 15 QUESTÕES 1 Que partes da célula de bochecha você observou 2 Por que se usou o corante no esfregaço da mucosa bucal Células Epiteliais do colo uterino Reconhecimento das células escamosas glandulares e metaplásicas Todas as imagens citológicas foram retiradas do Atlas de Citopatologia Ginecológica Células Epiteliais Escamosas Figura 3 Ilustração esquemática representando as diferentes camadas do epitélio escamoso do ectocérvice da vagina assim como os tipos de células correspondentes a cada camada encontradas nos esfregados Observar que a camada mais superior do epitélio é representada por células anucleadas queratinizadas escamas que podem aparecer em situações de irritação crônica como no prolapso uterino 17 1 Ilustre e descreva as características de cada uma das células epiteliais escamosas Células Epiteliais Metaplásicas 18 2 Descreva a importância da metaplasia 3 Ilustre e descreva as características de cada uma das células epiteliais escamosas 19 Células glandulares endocervicais 1 Ilustre e descreva as características de cada uma das células glandulares endocervicais 20 AULA PRÁTICA Nº 03 Microscopia Reconhecimento das alterações celulares ceratóricas e reativas Todas as imagens citológicas foram retiradas do Atlas de Citopatologia Ginecológica Alterações Celulares Reativas A reparação celular ocorre após destruição tecidual a qual pode ocorrer por diferentes causas como processos inflamatórios severos biópsia cauterização ou radioterapia As células de reparação envolvem tanto células epiteliais como mesenquimais dependendo da gravidade da lesão A maioria das células de reparação epiteliais é derivada das glandulares endocervicais metaplásicas escamosas imaturas e mais raramente de origem escamosa Na fase inicial do processo há uma atividade celular geral aumentada caracterizada por alterações citoplasmáticas e nucleares Em alguns casos as células no processo de reparação apresentam alterações nucleares significativas difíceis de diferenciar daquelas associadas às neoplasias malignas Nessa situação o processo de reparação é chamado atípico e está incluído na categoria atipia de células escamosas de significado indeterminado ASC Características citológicas do processo de reparação Fundo inflamatório 21 Agrupamentos unidirecionais de células com citoplasma abundante de coloração variável delicado às vezes com prolongamentos com limites geralmente mal definidos Células isoladas são raras Núcleos volumosos redondos ou ovais únicos ou múltiplos com bordas regulares Cromatina finamente granular Nucléolo proeminente único ou múltiplo redondo a oval Mitoses típicas às vezes Características citológicas do processo de reparação atípica Grupos celulares mais desorganizados às vezes pseudosincícios polaridade nuclear alterada e eventuais células isoladas Núcleos com a anisocariose variação no tamanho dos núcleos das células que constituem o agrupamento mais significativa hipercromasia e cromatina com granulação mais grosseira às vezes irregularmente distribuída Nucléolo pode ser atípico múltiplo ou com alteração da forma 22 Células de Reparação Atípicas Alterações Celulares associadas ao DIU 23 Alterações Celulares associadas à Radioterapia 24 Alterações Celulares associadas à Deficiência de Ácido Fólico Vitamina B12 1 Ilustre e descreva as características das alterações celulares reativas 25 Alterações Celulares Ceróticas O epitélio escamoso que reveste a ectocérvice e a vagina além de responder aos estímulos hormonais durante toda a vida da mulher pode ser alvo de estímulos externos resultando em várias alterações morfológicas benignas Tais alterações epiteliais podem ser classificadas como destrutivas ou degenerativas principalmente associadas à inflamação reparativas e protetoras Dentre as reações protetoras estão as alterações celulares queratóticas que são representadas pela hiperqueratose e a paraqueratose O epitélio escamoso da ectocérvice e da vagina é do tipo não queratinizado não exibindo as camadas granular e córnea Em certas condições contudo especialmente devido à irritação crônica como no prolapso uterino ou após inflamação e traumatismos o epitélio sofre hipermaturação com o aparecimento de uma camada de células granulares e queratinização sobrejacente estrato córneo É o que se chama de hiperqueratose Nos esfregaços a hiperqueratose é representada por escamas anucleadas em número variável Elas são intensamente eosinofílicas ou orangeofílicas às vezes exibindo uma área clara em substituição ao núcleo perdido os chamados núcleos fantasmas A paraqueratose consiste em queratinização anormal com persistência dos núcleos no estrato córneo do epitélio escamoso estratificado Corresponde a múltiplas camadas de células escamosas superficiais em miniatura queratinizadas com núcleos picnóticos Pode acompanhar a hiperqueratose É associada a lesões benignas mas também ocorre nas lesões précancerosas Nas amostras citológicas aparece como células em miniatura poligonais arredondadas ou alongadas com citoplasma denso corado em laranja ou vermelho e núcleos picnóticos Elas se mostram isoladas ou dispostas em pequenos conjuntos alongados ou concêntricos pérolas Pseudoparaqueratose A pseudoparaqueratose é referida como células orangeofílicas pequenas com núcleos picnóticos que aparecem em certas condições como na atrofia e para alguns autores associada à hiperplasia microglandular endocervical O citoplasma orangeofílico das células não se deve à produção de queratina mas decorre de um fenômeno degenerativo necrose coagulativa Na hiperplasia microglandular endocervical relacionada ao uso de contraceptivos orais de longa duração as células pseudoparaqueratóticas nos esfregaços são arredondadas ou colunares e aparecem geralmente na segunda metade de ciclo menstrual em arranjos lineares comumente imersas no muco cervical Em vez do citoplasma homogêneo das células paraqueratóticas exibem citoplasma granular ou 26 vacuolizado Alguns autores acreditam que essas células provavelmente representam células colunares endocervicais degeneradas Hiperqueratose 27 Paraqueratose 28 Pseudoparaqueratose 1 Ilustre e descreva as características das alterações celulares ceróticas 29 AULA PRÁTICA Nº 04 Microscopia alterações benignas Todas as imagens citológicas foram retiradas do Atlas de Citopatologia Ginecológica Células NãoEpiteliais 30 Outros elementos encontrados no esfregaço 1 Ilustre e descreva as características das alterações celulares benignas 31 AULA PRÁTICA Nº 05 Microscopia Reconhecimento da microbiota cérvicovaginal Todas as imagens citológicas foram retiradas do Atlas de Citopatologia Ginecológica Microbiologia Vaginal A microbiota vaginal é composta por Bactérias Lactobacillus vaginalis as quais são bacilos que representa a flora bacteriana padrão fisiológica As enzimas do microorganismo induzem à destruição proteolítica citólise das células epiteliais escamosas intermediárias ricas em glicogênio Este é metabolizado com a produção de ácido lático responsável pelo pH ácido da vagina O padrão citológico característico da citólise é o aparecimento de fragmentos citoplasmáticos e núcleos desnudos Gardnerella vaginalis Representa um cocobacilo que tem a propriedade de aderir ao citoplasma das células superficiais e intermediárias célulasguia Os microorganismos são mais facilmente identificados nas bordas citoplasmáticas A Gardnerella é frequentemente associada a outras bactérias constituindo o quadro conhecido como vaginose bacteriana O esfregaço não contém os lactobacillus e há escassez de neutrófilos A Gardnerella vaginalis se desenvolvem em pH alcalino Actinomyces Esta bactéria é geralmente associada ao uso de DIU numa frequência aproximada de 10 No esfregaço esses microorganismos se apresentam como estruturas filamentosas ramificadas em ângulo agudo basofílicas Os filamentos se irradiam a partir de um centro denso e escuro Leptothrix vaginalis São bactérias filamentosas encurvadas em forma de S U ou se apresentam enoveladas Associamse a Trichomonas em 75 a 80 dos casos 212 Fungos O fungo mais comum nas infecções do trato genital inferior é a Candida sp Este microorganismo pode se associar ou não a sintomas como prurido e corrimento vaginal esbranquiçado espesso A Candida aparece nos esfregaços sob a forma de pseudohifas septadas às vezes com ramificação aguda e esporos redondos ou ovais As pseudohifas muitas vezes se dispõem abaixo de conjuntos de células epiteliais e são mais facilmente visualizadas quando se altera o foco do microscópio exteriorizandose na extremidade 32 mais frouxa dos agrupamentos celulares É conveniente também examinar as margens do esfregaço já que podem exibir um certo grau de dessecação e consequentemente resultar no aumento artefatual especialmente dos esporos facilitando a sua identificação A infecção por Candida sp é associada geralmente a concentrações de neutrófilos e piócitos Habitualmente há alterações celulares degenerativas pseudoeosinofilia halos perinucleares e retração da borda nuclear e reativas tumefação nuclear Trichomonas vaginalis Tratase de um protozoário que aparece nos esfregaços como estruturas redondas ou ovais O citoplasma geralmente cora cinzaazulado e pode conter grânulos vermelho amarronzados O núcleo é excêntrico semitransparente levemente basofílico mal definido É importante visualizar o núcleo do parasita para diferenciálo principalmente de restos de citoplasma muco e neutrófilos degenerados Há alterações significativas nos esfregaços em associação com a infecção por Trichomonas vaginalis Além do exsudato purulento difuso é comum o encontro de acúmulos de neutrófilos se sobrepondo às células epiteliais degeneradas conhecidos como balas de canhão As alterações celulares degenerativas consistem em pseudoeosinofilia halos perinucleares e tumefação nuclear Pode ocorrer necrose celular representada por cariorrexe e cariólise Vírus Herpes simplex genitalis vírus que determina lesões cutâneas e mucosas sob a forma de pápulas ou vesículas que se rompem na sua evolução com consequente desenvolvimento de erosões Nos esfregaços há características celulares distintas As alterações ocorrem nas células escamosas parabasais metaplásicas imaturas e endocervicais Provocam inicialmente citomegalia aumento da célula como um todo e cariomegalia aumento nuclear Depois o núcleo adquire um aspecto fosco devido a alterações da estrutura cromatínica A cromatina restante se amolda contra o folheto interno da membrana nuclear determinando o espessamento da borda nuclear Encontramos também multinucleação com amoldamento nuclear e às vezes inclusões intranucleares O citoplasma das células acometidas é denso opaco devido a alterações do citoesqueleto e à necrose por coagulação Cervicite Crônica Folicular condição inflamatória caracterizada pela proliferação de folículos linfoides com centros germinativos no estroma do colo uterino Pode ocorrer em qualquer idade porém é mais comum em mulheres pósmenopausadas Aproximadamente metade dos casos é associada com infecção por Chlamydia trachomatis A cervicite folicular é diagnosticada em cerca de 05 dos esfregaços cervicais Nas amostras citológicas há linfócitos em diferentes estágios de maturação predominantemente inativados Esses linfócitos podem apresentar ocasionais mitoses Identificamse ainda macrófagos de corpos tingíveis contendo linfócitos degenerados intracitoplasmáticos e às vezes capilares Figura 32 Aspergillus Esfregaço cervicovaginal Papanicolaou 400x O Aspergillus é um fungo contaminante Observar que diferentemente das Candida as hifas são septadas enquanto as células escamosas Figura 33 Gardnerella vaginalis Esfregaço cervicovaginal Papanicolaou 100x Células escamosas superficiais e intermediárias com características inflamatórias discretas Observar a concentração de bactéria em cepas grandes especiarias As infecções vaginais das bandas citoplasmáticas basta característica de infecção por Gardnerella vaginalis A espécie de neisser também é comum nessa infecção 35 Protozoários Vírus 36 1 Ilustre e descreva as características da microbiota cérvicovaginal 37 AULA PRÁTICA Nº 06 Diagnóstico diferencial das lesões prémalignas ASCUS ASCG AGC Neo AGC Não Neo Laudos Todas as imagens citológicas foram retiradas do Atlas de Citopatologia Ginecológica A categoria atipia de células escamosas de significado indeterminado ASCUS foi descrita em 1988 pelo Sistema Bethesda de nomenclatura diagnóstica em citopatologia ginecológica O objetivo da criação de tal terminologia foi estabelecer e padronizar os critérios citomorfológicos nas condições associadas a anormalidades nucleares em células escamosas que ultrapassam em intensidade aquelas atribuídas aos processos reativos mas não preenchem todos os critérios associados às displasias Com a implantação dessa categoria diagnóstica terminologias ultrapassadas e confusas foram eliminadas facilitando a comunicação entre os laboratórios e os clínicos Em 2001 a categoria ASCUS passou a se chamar atipia de células escamosas ASC Nesta última versão do sistema Bethesda ASC representa alterações citológicas sugestivas de lesão intraepitelial escamosa mas que quantitativa ou qualitativamente são insuficientes para o seu diagnóstico definitivo A frequência da categoria ASC não deve ultrapassar 5 do total de exames em laboratórios de citopatologia exceto naqueles centros de referência para pacientes com lesões do colo uterino É estabelecido ainda que o número de casos de ASC não deve exceder duas a três vezes aquele das lesões intraepiteliais escamosas em um serviço de citopatologia A atipia de células escamosas inclui dois subgrupos Atipia de células escamosas de significado indeterminado ASCUS as quais correspondem maioria dos casos Atipia de células escamosas não sendo possível excluir lesão intraepitelial escamosa de alto grau ASCH Do ponto de vista clínico é importante a diferenciação entre ASCUS e ASCH uma vez que apresentam diferentes riscos de associação com lesão intraepitelial escamosa e as pacientes serão submetidas a condutas diversas A subcategoria ASCUS se associa à lesão intraepitelial escamosa em aproximadamente 10 dos casos enquanto que no ASCH essa associação pode chegar a 42 com percentual significativo de lesões de alto grau ASCUS Compreende as alterações citológicas sugestivas mas não definitivas para o diagnóstico de lesão intraepitelial escamosa de baixo grau Critérios Citomorfológicos Células escamosas maduras superficiais ou intermediárias comprometidas 38 Aumento nuclear 25 a 3 vezes o tamanho do núcleo de uma célula intermediária normal Normocromasia ou leve hipercromasia nuclear Borda nuclear lisa ou discretamente irregular 6 Atipia de Células Escamosas de Significado Indeterminado Cromatina finamente granular uniformemente distribuída ou cromatina compacta Ausência de alterações citopáticas definitivas pelo HPV Condições Que Podem Simular ASCUS Alterações reativas as alterações nucleares são difusas e geralmente associadas a fenômenos degenerativos pseudoeosinofilia vacuolização citoplasmática halos perinucleares entre outros Deficiência de ácido fólicovitamina B12 citomegalia discreto aumento do volume nuclear núcleos dobrados Lesão intraepitelial escamosa de baixo grau alterações nucleares mais significativas núcleos das células intermediárias 3 vezes maiores que aqueles das células intermediárias normais irregularidades das bordas nucleares e hipercromasia mais acentuada que aquelas relacionadas a ASCUS ASCH Compreende as alterações citológicas sugestivas mas não definitivas para o diagnóstico de lesão intraepitelial escamosa de alto grau Anteriormente a maioria destes casos era conhecida como metaplasia escamosa imatura atípica Correspondem a aproximadamente 510 dos casos da categoria geral ASC Critérios Citomorfológicos Aumento nuclear 152 vezes o tamanho do núcleo de uma célula metaplásica normal Aumento da relação nucleocitoplasmática maior que na célula metaplásica escamosa normal Leve hipercromasia nuclear Leve irregularidade nuclear Cromatina finamente granular uniformemente distribuída ou condensada Condições Que Podem Simular ASCH Metaplasia escamosa imatura Células de reserva Lesão intraepitelial escamosa de alto grau Carcinoma 39 ASCUS 40 ASCH 1 Faça um comparativo entre ASC US e ASCH 41 AULA PRÁTICA Nº 07 Extração de DNA de células sanguíneas 1 Introdução A extração de DNA permite a obtenção do material genético através de diversas amostras como sangue total plasma saliva bulbo capilar osso bactérias vírus amostras forenses material de biopsia material de aborto plantas dentre outras O material genômico extraído pode ser utilizado para diversas análises através de métodos moleculares O primeiro relato sobre isolamento de DNA data de 1869 e foi realizado por Friedrich Miescher a partir de leucócitos presentes em pus Existem diversos protocolos de extração de DNA contudo a escolha do protocolo de extração de DNA dependerá de diversos fatores como amostra utilizada grau de pureza e de integridade necessária para a realização do método subsequente como reação em cadeia da polimerase PCR sequenciamento clonagem gênica dentre outros Independente do tipo de amostra e protocolo utilizado a extração de DNA possui sempre quatro etapas principais Lise celular liberação das membranas celulares e exposição do material genético Purificação separação do DNA dos restos celulares e das proteínas Precipitação Precipitação do DNA Eluição Armazenamento do DNA em solução conservante 2 Objetivo Extração do DNA genômico a partir de células sanguíneas 3 Materiais Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega Tubos esterilizados de microcentrífuga de 15 ml para amostras de sangue de 300 μl Material de coleta tubo citrato garrote tubo CITRATO agulha descartável adaptador algodão álcool curativo 70 de etanol temperatura ambiente Isopropanol temperatura ambiente Ponteiras para micropipetas volumes de 100 a 1000 uL Ponteiras para micropipetas volumes de 10 a 100 uL banho de água 37 C Vórtex Microcentrífuga Centrífuga simples 42 Micropipetas volumes de 10 a 100 uL Micropipetas volumes de 100 a 1000 uL 4 Procedimento Realizar procedimentos conforme instruções do fabricante disponível no site httpswwwpromegacombrresourcesprotocolstechnicalmanuals0wizardgenomicdna purificationkitprotocol 1 Para 300µL da amostra Adicione 900µL de Cell Lysis Solution em um microtubo de 15mL estéril 2 Agite suavemente o tubo de sangue até ficar homogêneo em seguida transfira o sangue para o microtubo que contém a Cell Lysis Solution Inverta o microtubo 56 vezes 3 Incubar durante 10 min à temperatura ambiente inverta 23 vezes durante a incubação para lisar as células vermelhas Centrifugar a 10000rpm por 20s a temperatura ambiente 4 Descartar o máximo possível do sobrenadante sem mexer com o sedimento precipitado no fundo do tubo 5 Homogeneizar a amostra no vortex por 1015 segundos até que as células estejam ressuspensas 6 Adicionar 300µL de Nuclei Lysis Solution no tubo contendo as células ressuspensas Pipetar a solução 56 vezes para lisar as células brancas do sangue A solução deve tornarse muito viscosa Se aglomerados de células são visíveis depois de misturar incubar a solução a 37 C até que os aglomerados desapareçam 7 Opcional Adicionar 15µL RNase Solution para o lisado de células e misturar a amostra invertendo o tubo 25 vezes Incubar a mistura a 37 C durante 15 min e depois deixar a temperatura ambiente 8 Adicionar 100µL Protein Precipitation Solution para o lisado de células homogeneizar no vortex durante 1020 segundos Pequenos aglomerados de proteínas podem ser visíveis 9 Centrifugar a 10000rpm por 3 min a temperatura ambiente Um precipitado de proteínas deve ser visível no fundo do tubo 10 Transferir o sobrenadante para um tubo de 15mL contendo 300µL de isopropanol 11 Misturar suavemente a solução por inversão até formar uma massa visível 12 Centrifugar a 10000rpm por 1 min a temperatura ambiente O DNA será visível no fundo do tubo 43 13 Descartar o sobrenadante e adicionar 300µL de etanol a 70 ao DNA Inverta suavemente o tubo várias vezes para lavar o sedimento de DNA e os lados do tubo Centrifugar como no Passo 12 14 Aspirar cuidadosamente o etanol usando uma pipeta O sedimento de DNA é muito solto neste ponto e cuidados devem ser tomados para evitar a sucção do DNA para a pipeta Inverta o tubo em papel absorvente limpo e deixe secar por 1015 minutos 15 Adicionar 100µL DNA Rehydration Solution e incubar a solução durante a noite à temperatura ambiente ou a 4 C 16 Armazenar o DNA no freezer a 20 C Questões 1 Por qual motivo são realizadas a lise celular e lise nuclear 2 Qual a importância da centrifugação 3 Quais os fundamentos da etapa de precipitação do DNA 4 Qual a validade da extração de DNA 44 AULA PRÁTICA Nº 07 Eletroforese 1 Introdução A eletroforese é um método que utiliza a corrente elétrica para promover a separação de moléculas carregadas como proteínas e ácidos nucleicos A migração das partículas ocorre por diferença de carga elétrica e por peso molecular de forma que moléculas menores migram mais rapidamente do que as moléculas de carga maiores Figura 1 O princípio da eletroforese utilizada para separação de DNA se baseia na carga negativa de uma fita de DNA Ao final do processo as cadeias de DNA estarão próximas ao catodo positivo que atrai devido à polaridade moléculas de carga negativa Figura 1 Migração dos fragmentos de acordo com o peso molecular Existem dois métodos básicos de eletroforese géis de agarose Figura 2 ou géis de poliacrilamida Figura 3 As duas substâncias formam tramas de poros de tamanhos variáveis possibilitando a separação dos fragmentos que terá sua eficiência dependente da concentração do polímero e da intensidade da voltagem e amperagem aplicada Figura 2 Gel de agarose Figura 3 Gel de poliacrilamida 45 A eletroforese possui várias aplicações sendo utilizada no meio científico e na rotina laboratorial permitindo várias análises moleculares as quais permitem fornecer informações úteis sobre o estado geral do paciente contribuindo com diagnóstico e prognóstico de várias enfermidades 2 Materiais Gel de agarose 1 Agarose Tampão TBE 1 X TrisBoratoEDTA Brometo de Etídeo Tampão de amostra 6X Azul de bromofenol Marcador de peso molecular 1kb plus dna ladder Cuba de eletroforese horizontal Transluminador UV Microondas Erlenmeyer 250 ml Espátula com colher Balança eletrônica analítica Micropipetas 05 µL a 10 µL Micropipetas 10 µL a 100 µL Ponteiras brancas 01 µL a 10 µL Ponteiras amarelas 1 µL a 200 µL 3 Procedimento PREPARO DO GEL DE AGAROSE 1 1 Para 25mL de gel pesar 025g de agarose 2 Adicionar 25mL de TBE 1X 3 Fundir a solução no microondas até homogeneizar aproximadamente 1 min e 10 seg na potência máxima evitar fervura 4 Enquanto a solução de gel esfria morno preparar o suporte de gel selando as laterais com fita crepe ou na própria cuba 5 Acrescentar 1μL de Brometo de Etídeo 10mgmL e misturar com agitação leve Obs CUIDADO BROMETO DE ETÍDEO É CARCINOGÊNICO e deve ser manuseado com luvas 6 Despejar a solução de gel no suporte sem fazer bolhas 7 Colocar o pente da espessura desejada no suporte Obs Verificar o número e o volume das amostras para escolher o pente mais adequado 46 8 Esperar a solução solidificar 9 Colocar o suporte com o gel na cuba de eletroforese Adicionar tampão TBE 1X até cobrir a superfície do gel ANÁLISE DE AMOSTRAS DE DNA 1 Utilizar 10μL da amostra de DNA produto de PCR 2 Homogeneizar com 2μL de tampão de amostra 6X Azul de bromofenol 3 Aplicar as amostras nos poços 4 Reservar 2 poços para utilização de um padrão de corrida Ladder1Kb plus 5 Ajustar a voltagem de acordo com o tempo de corrida desejado média utilizada 80V 6 Analisar o gel sob radiação ultravioleta 7 Tirar foto dos resultados obtidos Questões 1 Sobre a eletroforese realizada pelo seu grupo a Represente em forma de desenho o resultado obtido b O que os resultados indicam c Quais as propriedades do material genético foram utilizadas para a execução da técnica 47 AULA PRÁTICA Nº 08 Reação em Cadeia da Polimerase PCR 1 Introdução A Reação em Cadeia da Polimerase PCR é considerada uma das técnicas de biologia molecular de grande importância revolucionária O responsável pela descoberta do método Kary Mullis 1983 em 1993 recebeu o prémio Nobel em química pela descoberta O método permite a amplificação de trechos específicos de DNA de interesse em milhões de cópias o que facilita a análise genética e permite o desenvolvimento de técnicas de diagnóstico muito mais sensíveis e mais específicas do que as tradicionalmente utilizadas A técnica de PCR exige a necessidade da padronização de protocolos a serem utilizados em todas as fases dos procedimentos desde a obtenção do ácido nucléico até a reação de amplificação propriamente dita Os materiais necessários para que a reação ocorra são basicamente os mesmos componentes do processo de replicação que ocorre nas células in vivo São componentes da PCR a Amostra de DNA que contém o segmento a ser amplificado DNA extraído de amostras de sangue de culturas de microrganismos de espécimes clínicos de plantas etc b Mix que contenha os nucleotídeos dNTPs dATPs dTTPs dCTPs e dGTPs necessários para a síntese das novas fitas de DNA c Enzima DNApolimerase que é responsável pela síntese das novas fitas de DNA TaqDNA polimerase em soluçãotampão d Cloreto de magnésio cofator da reação e Dois iniciadores ou primers que são pequenas sequências DNA que delimitam e são complementares à regiãoalvo de amplificação Os primers são sintetizados em laboratórios especializados e após a sua diluição são mantidos a 20C A PCR pode ser feita em tubos de 05 µL ou de 02 µL ou em placas empregandose volume total de 25 µL sendo 20 µL de master mix e 5 µL da amostra de DNA a ser analisada Outras variações de volume têm sido utilizadas em diferentes trabalhos científicos como 10 µL de master mix e 25 µL de DNA O volume das reações pode ser reduzido desde que as concentrações adequadas de todos os componentes da reação sejam mantidas 48 Figura 1 Componentes da PCR e Etapas da amplificação Adaptado de httpsibbioninjacomaustandardleveltopic3genetics35genetic modificationandpcrhtml 2 Materias Kit GoTaq Green Master Mix 2X Primer TPA FW 10 µM GTAAGAGTTCCGTAACAGGACAGCT Primer TPA RV 10 µM CCCCACCCTAGGAGAACTTCTCTTT Água nuclease free 15mL Termociclador Capela de fluxo laminar Microtubos de 02 mL Estante para microtubos Amostra de DNA genômico humano 3 Procedimento 1 Adicionar em um microtubo de 02mL os reagentes nas seguintes concentrações finais Go Taq Green Master Mix 1x 10µl Primer Forward 1 µl Primer Reverse 1 µl Amostra de DNA 50 ng 25 µl Completar com água nuclease free 105 µl Volume final da reação 25 µL 49 2 Obs Não esquecer de numerar e nomear os tubos para identificação da amostra 3 Acrescentar o DNA molde 4 Feche os tubos e posicioneos no termociclador 5 Programe a ciclagem de acordo com os seguintes parâmetros ou conforme orientação específica do Professor 95 C por 5 minutos 30 ciclos 95 C por 60 segundos 55 C por 60 segundos e 72 C por 60 segundos e uma etapa de extensão final a 72ºC por 5 minutos Questões a Descreva as propriedades do material genético empregadas na técnica de PCR b Qual a finalidade dos primers c Descreva três aplicações com exemplos da PCR 50 AULA PRÁTICA Nº 09 Cariótipo ANÁLISE DE CARIÓTIPO 1 Introdução Pouco se conhecia sobre citogenética humana até 1956 quando JoeHin Tijo 1919 e Albert Levan 19051998 desenvolveram as técnicas que permitiram o estudo dos cromossomos humanos O estudo dos cromossomos humanos ocorre com cromossomos em metáfase Em laboratórios de Citogenética Humana utilizase a cultura de células de origem fetal sanguínea ou epitelial O passo a passo para a preparação das lâminas de cariótipo a partir de cultura de linfócitos pode ser visualizado a figura 1 a seguir Figura 1 Cultura de linfócitos e preparo da lâmina para análise 51 ANALISANDO CARIÓTIPOS HUMANOS Siga as instruções abaixo para montar os cariótipos propostos Cada cariótipo deve ser montado seguindo o modelo da última folha 1 Localize os três pares cromossômicos de maior tamanho que constituem o grupo A Os cromossomos dos pares 1 e 3 são do tipo metacêntrico centrômero em posição aproximadamente central e os do par 2 são submetacêntricos centrômero um pouco deslocado do centro Oriente os cromossomos 1 e 3 com os braços que têm a faixa cinzenta para baixo da linha tracejada 2 Dos cromossomos restantes identifique os dois pares de maior tamanho que constituem o grupo B São grandes pouco menores que o cromossomo 3 e submetacêntricos O que tem uma faixa cinzenta na região do centrômero é o cromossomo 4 3 Localize agora os pares de cromossomos 21 e 22 que constituem o grupo G São os menores do conjunto e do tipo acrocêntrico centrômero localizado perto da extremidade O braço menor desses cromossomos possui uma pequena esfera terminal chamada satélite O cromossomo que apresenta faixa negra mais larga é o 21 4 Procure os pares de cromossomos 19 e 20 que constituem o grupo F Eles são um pouco maiores que os do grupo G e quase metacêntricos O cromossomo 19 apresenta uma faixa negra em torno do centrômero O cromossomo 20 tem uma faixa negra larga no braço ligeiramente menor superior e outra mais estreita no braço ligeiramente maior 5 Localize os pares cromossômicos 13 14 e 15 que constituem o grupo D Eles são do tipo acrocêntrico com satélites no braço menor O que apresenta faixas negras mais largas é o cromossomo13 o que tem faixas um pouco mais estreitas é o 14 e o 15 apresenta faixas ainda mais estreitas 6 Identifique os pares de cromossomos 6 e 7 os primeiros do grupo C Eles são os maiores entre os Cromossomos que restaram e são do tipo submetacêntrico O maior dos dois com faixas negras mais estreitas no braço menor é o cromossomo 6 7 Dos cromossomos restantes descubra agora os três pares de menor tamanho de tipo submetacêntrico São os cromossomos 16 17 e 18 que constituem o grupo E O cromossomo 18 é facilmente identificável por não apresentar nenhuma faixa escura no braço menor O cromossomo 16 possui no braço menor uma faixa negra mais larga que a apresentada pelo 17 8 Selecione o menor dos cromossomos restantes Tratase do cromossomo sexual Y Além de não apresentar homólogo ele é do tipo Acrocêntrico centrômero localizado próximo à extremidade e tem uma faixa cinzenta larga no braço maior 9 Dos onze cromossomos restantes identifique o cromossomo sexual X Ele apresenta uma faixa negra estreita no braço menor e é o único que não apresenta homólogo pois tratase de um cariótipo masculino 52 10 Selecione dos cromossomos restantes o par que possui três faixas negras largas no braço curto é o Cromossomo 9 Procure agora o par que apresenta apenas uma faixa negra larga no braço menor tratase do cromossomo 12 11 Faltam apenas três pares de cromossomos para identificar O que apresenta faixas negras mais largas no braço maior é o cromossomo 8 Dos dois pares restantes o que tem o centrômero mais deslocado para a extremidade é o cromossomo 10 Adaptado de TEMAS DE Biologia PROPOSTAS PARA DESENVOLVER EM SALA DE AULA NÚMERO 4 JANEIRO DE 1997 EDITORA MODERNA CARIOTIPO MONTADO MODELO CARIÓTIPO nº 1 55 AULA PRÁTICA Nº 10 Espermograma 1 Introdução O sêmen humano é formado por plasma seminal o qual contém elementos bioquímicos essenciais para os espermatozoides e por células como leucócitos células epiteliais células redondas em diferentes estágios da gametogênese além de espermatozoides imaturos e maduros A formação dos ocorre através da espermatogênese a qual consiste em quatro estágios proliferação das espermatogônias para originar espermatócitos diplóides divisão meiótica originando espermátides haplóides citodiferenciação de espermátide em espermatozoides maturação dos gametas no epidídimo A análise dos espermatozoides por meio da concentração morfologia e motilidade apresenta grande importância se destacando a confirmação da eficácia da vasectomia e a triagem inicial da infertilidade masculina Para a avaliação dos parâmetros seminais geralmente é utilizada a técnica manual clássica de rotina realizada através de avaliações microscópicas padronizadas pela Organização Mundial de Saúde No entanto a fim de otimizar o método alguns laboratórios têm optado por realizar a análise do líquido seminal através de métodos automatizado 2 Materias Lâminas Lamínula Tubos de coleta Fita indicadora de pH Tubos graduados de 15ml Tubos de ensaio Conta gotas Soro fisiológico Câmara de neubauer Solução de corante vital eosina 5 Palito de vidro Microscópio 3 Procedimento I INSTRUÇÃO PARA O PACIENTE IDIOGRAMA DO CARIÓTIPO nº DIAGNÓSTICO Montado por Série 56 O paciente deve estar consciente da importância do exame Deverá fazer rigorosamente um registro de 3 a 4 dias de abstinência sexual coito masturbação e ejaculação noturno II COLHEITA DO MATERIAL 1 OBTENÇÃO a Pode ser obtido através de manipulação autoerótica masturbação ou de coitus interruptus b Deve ser colhido de preferência no laboratório em vidro de boca larga limpo e seco 2 CUIDADOS a É indispensável marcar a hora em que foi colhido o material b Não deixálo em contato com altas temperaturas c Caso o material não tenha sido colhido no laboratório o que não é aconselhável o mesmo deverá ser entregue antes de completar 1 hora após a colheita pois poderá alterar a motilidade dos espermatozóides III EXAME MACROSCÓPICO Normalmente executase este exame logo após a liquefação do líquido seminal em banho Maria a 37ºC durante 1 hora Porém não há inconveniente executálo logo após a colheita devendo mencionar as condições em que o exame foi realizado a VOLUME 20 a 50 cm³ normal Volumes inferiores a 05 cm³ tratase de casos patogênicos porém volumes superiores a 50 cm³ não são considerados casos patogênicos b COR O líquido seminal normal apresenta uma opalescência ligeiramente acinzentada ou esbranquiçadaUm regime superior a 7 dias implica no aparecimento de uma opalescência ligeiramente amarelada Em geral podese observar que a presença de piócitos leucócitos degenerados hemácias e células epiteliais do tipo descamativas produzem uma opalescência intensamente amarelada purulenta c CHEIRO É característico d pH 75 a 82 normal Em termos de pH podese considerar 1 Líquido espermático TIPICO pH de 7 a 82 2 Líquido prostático ATIPICO pH menor que 7 57 e VISCOSIDADE Levandose um bastão de vidro o esperma é aderido Valor Normal 20 cm de altura Viscosidade Diminuida Abaixo De 20 Cm 86 Viscosidade Aumentada Acima De 20 Cm Viscosidade Nula Ou Ausente Quando o liquido não adere ao bastão f CONSISTÊNCIA Geralmente é gelatinosa porém podemos encontrála como fluída semifluida e grumosa IV EXAME MICROSCÓPICO Deve ser executado 1 hora após a colheita em liquefação a 37C em BM a MOTILIDADE É fundamental na fecundação TIPOS de motilidade I Lateral movimento ondulante II Progressivo lento movimento quase ondulante lento III Progressivo movimento rápido com direção específica IV Ativo movimento rápido mas sem direção específica Os tipos I e II são anormais Os tipos I e II são casos de nula ou pouca fertilização Devido a pouca movimentação o espermatozóide não alcança o útero sendo detraído pela acidez vaginal Todos os tipos podem ser encontrados embora sejam predominantes os tipos II III IV OBSERVAÇÃO A recuperação de motilidade pode ser obtida com a administração de hormônios O exame é a fresco 1 Após homogenização do líquido seminal colocase uma gota numa lâmina e cobrese com lamínula 2 Levar ao microscópio e focalizar primeiramente com a objetiva de 10x e posteriormente passar para objetivas de 40x 3 Examinar Fixar um espermatozóide e observar o seu movimento b VITALIDADE É a relação entre o número de espermatozóides vivos e mortos Expressase o resultado em percentagem de vivos Se necessário diminuir a ocular para possibilitar a contagem O executador deverá adquirir bastante experiência na contagem Contar de 4 a 8 no centro da lâmina 58 Espermograma Disponível em httpwww1pucminasbrimagedbdocumentoDOCDSCNOMEARQUI20130916153400pdf 59 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS LIMA DNO Atlas de citopatologia ginecológica Brasília Ministério da Saúde CEPESC Rio de Janeiro 2012 204p Il ISBN 9788532400314 DE SOUZA VIEIRA Luís Fernando et al Características microscópicas do sêmen de indivíduos que realizaram espermograma por método automatizado Revista Unimontes Científica v 16 n 2 p 0207 2014 ENCICLOPÉDIA BIOSFERA Centro Científico Conhecer Goiânia v11 n22 p 2015 OLIVEIRA MC de S et al Fundamentos teóricospráticos e protocolos de extração e de amplificação de DNA por meio da técnica de reação em cadeia de polimerase 2007 LOPES A C Tratado de Clínica Médica 1ed São Paulo Roca 2006 MINISTÉRIO DA SAÚDE SECRETARIA DE ATENÇÃO À SAÚDE DEPARTAMENTO DE ATENÇÃO BÁSICA Controle dos cânceres do colo do útero e da mama 2 ed Brasília Editora do Ministério da Saúde 2013 124 p il Cadernos de Atenção Básica n 13 MUNIZ M Citogenética Biologia Universidade Federal de Santa Catarina 2009 126 p ISBN 978 8561485207