Enzimas: Estrutura, Função e Aplicações Clínicas

ENZIMAS Chamamos de enzimas as proteínas complexas heteroproteínas ou proteínas derivadas que atuam como catalisadores nos processos biológicos A enzima e a substância sobre a qual vai agir chamada substrato formam um composto intermediário que posteriormente sofre um desdobramento regenerando a enzima ENZIMAS Classificação Internacional das Enzimas ENZIMAS SÍTIO ATIVO O sítio de ligação do substrato de uma enzima é dado por um arranjo tridimensional especial dos aminoácidos de uma determinada região da molécula geralmente complementar à molécula do substrato e ideal espacial e eletricamente para a ligação do mesmo A zona sombreada são os aminoácidos desta enzima proteína que configuram neste caso o sítio ativo da enzima Centro ativo INFARTO DO MIOCÁRDIO Ligação da Enzima com o Substrato Modelo chave fechadura Prevê um encaixe perfeito do substrato no sítio de ligação que seria rígido como uma fechadura Emil Fisher 1894 Ligação da Enzima com o Substrato Modelo ajuste induzido MODELO DO AJUSTE INDUZIDO prevê um sítio de ligação não totalmente préformado mas sim moldável à molécula do substrato Kosland Evidências experimentais sugerem um terceiro modelo que combina o ajuste induzido a uma torção da molécula do substrato que o ativaria e o prepararia para a sua transformação em produto APLICAÇÕES CLÍNICAS DE ENZIMAS I ENZIMAS PLASMÁTICAS Está presente no plasma em concentração elevada é específica do plasma e tem papel funcional no plasma Ex trombina II ENZIMAS TECIDUAIS Normalmente os níveis plasmáticos dessas enzimas são muito baixos ou ausentes Uma patologia pode causar alterações na permeabilidade da membrana celular ou a morte celular resultando no extravasamento destas para o plasma Depuração ocorrerá em função da estabilidade da enzima e de sua captação Enzima Principal fonte Aplicaçãoões clínicas Amilase Glândulas salivares pâncreas ovários Enfermidade pancreática Aminotransferases Fígado músculo esquelético coração rins eritrócitos Doenças do fígado infarto do miocárdio doença muscular Antígeno prostático específico Próstata Carcinoma de prostáta Creatinoquinase Músculo esquelético cérebro coração músculo liso Infarto do miocárdio enfermidades musculares Fosfatase ácida Próstata eritrócitos Carcinoma de próstata Fosfatase alcalina Fígado osso mucosa intestinal placenta rim Doenças ósseas enfermidades hepáticas γglutamiltranspeptidase Fígado rim Enfermidade hepatobiliar alcoolismo Lactatodesidrogenase Coração fígado músculo esquelético eritrócitos plaquetas nódulos linfáticos Infarto do miocárdio hemólise doenças hepáticas Lipase Pâncreas Enfermidade pancreática DISTRIBUIÇÃO DE ALGUMAS ENZIMAS DE IMPORTÂNCIA DIAGNÓSTICA Diagnóstico Prognóstico Acompanhamento de tratamentos Detecção da cura de doenças ENZIMAS DE INTERESSE CLÍNICO Pancreáticas Cardiovasculares Hepáticas Musculares Ósseas Renais Outros tecidos Malígnas Principais causas de erro nas determinações enzimáticas Coleta da Amostra Uso de Anticoa gulante Hemólise Estase venosa Coagula ção Soro Lipêmico Principais causas de erro nas determinações enzimáticas Conservação da Amostra 4oC Determinação rápida Não congelar Estabilidade Proteólise Principais causas de erro nas determinações enzimáticas Medida da Atividade Condições da Reação Estabilidade dos Reagentes Pipetagem Limpeza da Vidraria Espectrofotô metro Principais causas de erro nas determinações enzimáticas Avaliação do Resultado Trabalho Criterioso Controle de Qualidade Linearidade da reação Valores de Referência Metodologias Determinação da atividade enzimática Métodos Colorimétricos Medida da quantidade de produto formado Produto formado é um composto corado Ex Método BesseyLowry PAL Fenilalanina amônioliase pnitrofenilfosfato PAL pnitrofenol Pi incolor amarelo Produto formado é transformado em composto corado Ex Método de Roy PAL Timolftaleína monofosfato PAL Timolftaleína Pi NaOH Na2CO3 azul Métodos Colorimétricos Medida da quantidade de substrato consumido Substrato não consumido é transformado em composto corado Ex Método de Caraway Amido AMS glicose maltose dextrinas Iodo Complexo coloidal azul Metodologias Determinação da atividade enzimática Metodologias Determinação da atividade enzimática Método Cinético Medida da variação da concentração da coenzima Método de Wacker LDH COOH COOH CHOH LDH CO CH3 CH3 NAD NADH H Ácido lático Ácido pirúvico FUNDAMENTO capacidade de óxidoredução de NADH FORMA REDUZIDA absorve a 340 nm enquanto que a forma oxidada não tem absorbância significativa a esse comprimento de onda 280 nm ESPECTROFOTOMETRIA POR ULTRAVIOLETA REAÇÕES CINÉTICAS ENZIMAS PANCREÁTICAS E HEPÁTICAS Profª Regina H Pires Amilase Lipase DIAGNÓSTICO ENZIMÁTICO DAS DOENÇAS DO PÂNCREAS Principais enzimas pancreáticas de interesse clínico Diagnóstico Enzimático das Doenças do Pâncreas Pancreatite aguda autólise das células acinosas enzimas celulares liberadas no tecido intersticial e chegam à circulação AMS e a LPS têm baixo peso filtradas pelo glómerulo renal LPS reabsorvida pelos túbulos renais LPS 23 sofre reabsorção e catabolização pelos túbulos renais e outra parte é excretada pela urina Amilasúria Amilasemia Lipasemia Tempo dias Atividade UL AMS LPS ELS Valor Clínico da Medida da Atividade das Enzimas Diagnóstico Enzimático das Doenças do Pâncreas Amilase Símbolo AMS Nome 14glucan4glucano hidrolase Classificação EC3211 PM 45000 daltons pH ótimo 70 01 Ativadores íons Cloreto Inibidores íons metálicos Cu2 Hg Ag Pb uréia EDTA citrato fluoreto oxalato NaCl 10mmolL Isoenzimas pancreática 13 do total salivar 23 do total Fontes pâncreas parótidas fígado músculos intestino Valores de referência Soro 28 a 100 UL Urina 1 a 17 UL Amilase A AMS catalisa a reação de hidrólise das ligações 14glicosídicas do amido e glicogênio A enzima atua sobre estes polissacarídeos promovendo a ruptura progressiva das moléculas que vão sendo fragmentadas em unidades menores Assim o amido se desdobra em dextrinas estas são rapidamente hidrolisadas liberando unidades menores como maltose e glicose Diagnóstico Enzimático das Doenças do Pâncreas Amilase VR 28 a 100 UL Métodos de Análise Amiloclástico Amido Glicose Maltose Dextrinas Amido Amido Iodo Complexo coloidal azul Sacarogênico Glicose Método Específico Cor específica Cinético Maltotetraose AMS 2 maltose 2 maltose maltose fosforilase 2 glicose 2 glicose 1P 2 glicose 1P fosfoglicomutase 2 glicose 6P 2 glicose 6P G6PDH 2 6Pgliconato 2 NADP 2 NADPH H Diagnóstico Enzimático das Doenças do Pâncreas AMS Diagnóstico Enzimático das Doenças do Pâncreas Hiperamilasemia Pancreatite aguda Elevações entre 4 e 6 horas após o início da crise Pico máximo entre 20 e 30 horas 1050 x VRS Normalização se efetua entre 2 e 8 dias 4 a 10 dias Vida média da enzima no plasma é em torno de 12 horas Hiperamilasúria 5 a 6 horas após a hiperamilasemia persistindo alguns dias mesmo após a normalização da amilasemia Diagnóstico Enzimático das Doenças do Pâncreas Lipase Símbolo LPS Nome Triacilglicerol acil hidrolase Classificação EC3113 PM 48000 daltons pH ótimo 35 a 70 Ativadores Cl Ca Mg albumina colipase Inibidores hemoglobina Zn Co Fe EDTA Fonte pâncreas mucosa gástrica e intestino Reação catalisada a LPS catalisa a hidrólise de ésteres na posição de triglicerídeos produzindo monoglicerídeos e ácidos graxos CH2OCOR1 CH2OH CHOCOR2 H2O LPS CHOCOR2 2 AG CH2OCOR3 CH2OH Triacilglicerol 2 Monoacilglicerol 2 AG Valor de Referência Variável conforme método Adultos até 60 anos 10 a 40UL Acima de 60 anos 18 a 180 UL Lipase Pancreatite aguda Elevações 4 e 8 horas após o início da crise Pico máximo em 24 horas 250 x VRS Normalização se efetua entre 8 e 14 dias Aumento LPS 2 a 3 x VRS Úlcera gástrica ou duodenal perfurada Obstrução intestinal Obstrução vascular mesentérica Colecistite aguda Diagnóstico Enzimático das Doenças do Pâncreas ENZIMAS HEPÁTICAS Profª Regina H Pires DIAGNÓSTICO DAS DOENÇAS HEPÁTICAS ALT Alanina aminotransferase AST Aspartato aminotransferase LDH Lactato desidrogenase PAL Fosfatase alcalina GGT gama glutamiltransferase Diagnóstico enzimático das doenças hepáticas Fígado Membrana basal muito permeável Células muito próximas dos capilares Difusão das enzimas diretamente para o sangue Vaso linfático Tecido intersticial Hepatócitos Capilar sangüíneo Arterial Venoso Diagnóstico enzimático das doenças hepáticas Alanina aminotransferase ALT TGP Classificação EC2612 PM 101000 daltons Inibidores oxalato fluoreto Isoenzimas no soro é encontrada uma fração de origem 100 citosólica Fontes fígado rins coração músculo esquelético pâncreas baço pulmão VR 6 a 37 UL Aspartato aminotransferase AST TGO Classificação EC2611 PM 110000 daltons Inibidores oxalato fluoreto Isoenzimas a citoplasmática 60 do total e a mitocondrial 40 do total Fontes coração fígado músculo esquelético rins pâncreas VR 5 a 34 UL Diagnóstico enzimático das doenças hepáticas Alanina aminotransferase Mét Wroblewski e La Due 1 Alanina ác cetoglutárico ALT ác glutâmico ác pirúvico ácido pirúvico NADH H LDH ácido lático NAD O decréscimo da absorbância em 340 nm devido a formação de NAD é proporcional a atividade da ALT Aspartato aminotransferase Mét Karmen 1 Ác aspártico ác cetoglutárico AST ác glutâmico ác oxaloacético ácido oxaloacético NADH H MDH ácido málico NAD O decréscimo da absorbância em 340 nm devido a formação de NAD é proporcional a atividade da AST Causas de elevação de AST e ALT Elevação de AST e ALT Causas 10 VRS Hepatite virótica aguda Hepatite tóxica Hepatite alcoólica 510 VRS Hepatite crônica ativa Cirrose descompensada Colestase intra hepática Hepatoma 5 VRS Esteatose Hepatite crônica persistente Cirrose biliar Diagnóstico enzimático das doenças hepáticas Lactato desidrogenase LDH Classificação EC11127 PM 140000 daltons Inibidores ácido pirúvico oxalato EDTA heparina Zn Isoenzimas a LDH é formada pela união de subunidades existem 2 subunidades H e M a enzima cataliticamente ativa é um tetrâmero No soro é encontrada uma fração de origem 100 citosólica VR 95 a 225 UL Determinação da atividade Método de Wroblewski 1 ácido pirúvico NADH H LDH ácido lático NAD O decréscimo da absorbância em 340nm devido à produção de NAD é proporcional à atividade de LDH Método de Wacker 1 ácido lático NAD LDH ácido pirúvico NADH H O aumento da absorbância em 340nm devido à produção de NADH é proporcional à atividade de LDH ISOENZIMAS As múltiplas formas de uma enzima são frequentemente descritas como isoenzimas isozimas distinguidas pelas diferentes propriedades físicas mobilidade eletroforética e inativação química ou térmica A LDH apresentase em cinco formas isoméricas com diferentes graus de expressão nos diversos tecidos e ou órgãos e originamse por combinações distintas das cadeias ou subunidades H e M em uma estrutura tetramérica Todas as formas descritas da LDH são citosólicas DESIDROGENASE LÁTICA Isoenzimas LDH Iso enzima Tetrâmero Miocárdio Fígado Músculo Cérebro Rim 1 4H 2 3H1M 3 2H2M 4 1H3M 5 4M FOSFATASES removem o grupo fosforil da proteína restaurandoa ao seu estado original defosforilado São transmembrânicas contendo 240 resíduos domínio catalítico arginina e cisteína FOSFATASES Diagnóstico enzimático das doenças hepáticas PAL Fosfatase alcalina Fosfohidrolase monoester ortofosfórica Classificação EC3131 PM 70000 a 120000 daltons Inibidores EDTA oxalato citrato e Ca Fontes líquidos corporais endotélio vascular células hepáticas vesícula biliar ducto biliar pulmões intestino placenta rins pâncreas e medula óssea e tecido ósseo Método de Roy mod 1 Timolftaleína monofosfato PAL timolftaleína Pi pH básico COR AZUL A intensidade de cor final é medida em 590 nm e é proporcional a atividade da PAL Método de Referência 4nitrofenil fosfato H2O PAL 4nitrofenol AMARELO O aumento de absorbância em 405 nm é proporcional a atividade Valor de Referência Adultos 13 a 43 UIL Crianças 56 a 156 UIL Alterações da atividade da PAL Doenças hepáticas Hepatite aguda Hepatite alcoólica Cirrose Colestase Tumores hepáticos Cirrose biliar Doenças ósseas Fraturas Osteonecrose Osteoporose Osteomalácia Sarcoma Doença de Paget Doenças do pâncreas Pancreatite aguda Tumores Neoplasia maligna Doenças gastrin testinais Úlcera duodenal Jejunite colite Trombose Outras doenças Hipertireoidismo Tireotoxicose Diabetes mellitus Infarto agudo do miocárdio Falha cardíaca congestiva neoplasias extrahepáticas Hiperfosfatasemia Fosfatase Ácida Símbolo PAC Nome Ortofosfórica monoester fosfohidrolase Classificação EC3132 PM 100000 daltons pH ótimo 48 a 60 Inibidores oxalato fluoreto heparina Cu detergentes A fração eritrocitária é inibida por formaldeído e a prostática por tartarato Ativadores Mg Zn Isoenzimas prostática eritrocitária plaquetária Fontes principalmente próstata 1000x mais que em outros tecidos e hemácias Também nas plaquetas fígado baço rins ossos e medula óssea Reação catalisada a PAC catalisa a hidrólise de ésteres fosfóricos orgânicos produzindo fosfato inorgânico numa faixa de pH variando de 48 a 60 de acordo com a seguinte reação OH OH HO P O R H2O PAC HO P O R OH O OH Éster fosfórico fosfato inorgânico A PAC de interesse clínico é a PAP fosfatase ácida próstática PAP FOSFATASE ÁCIDA PROSTÁTICA Métodos de Determinação da Atividade a Método de Roy mod é o método de referência da AACC 1 Timolftaleína monofosfato PAP timolftaleína Pi 2 Timolftaleína OH COR AZUL A intensidade de cor final medida em 590nm é proporcional a atividade da PAP Valor de Referência 015 a 056 UIL Interpretação Clínica diagnóstico do câncer de próstata metástase hiperplasias prostáticas após o toque prostático prisão de ventre câncer de mama Gama Glutamil Tanspeptidase A gama glutamil transpeptidase ou transferase GGT é uma enzima presente nas membranas celulares e nas frações microssômicas envolvidas no transporte de aminoácidos através da membrana celular Regula o transporte dos aa catalisando a transferência de um grupo glutamil da glutationa para um aa livre Aumento relacionase à doença hepatobiliar GAMA GLUTAMIL TRANSPEPTIDASE Diagnóstico enzimático das doenças hepáticas GGT gama glutamil transferase Classificação EC2322 PM 82000 daltons Inibidores oxalato fluoreto citrato Fontes fígado ductos biliares intra e extra hepáticos pâncreas e rins Método de Szasz 1 Glutamil pnitroanilida glicilglicina GGT Glutamil glicilglicina p nitroanilina AMARELO Medese o aumento de absorbância em 405 nm que é proporcional a atividade da GGT Valor de Referência Homem 8 a 37 UIL Mulher 5 a 24 UIL Alterações da atividade da GGT Alterações GGT Drogas barbitúricos antidepressivos analgésicos contraceptivos Álcool Hiperlipidemias Diabetes mellitus Hipertireoidismo Artrite reumatóide Doenças do pâncreas IAM Doenças malignas ENZIMAS CARDÍACAS Profª Regina H Pires Infarto Agudo do Miocárdio Tempo 0 Isquemia do miocárdio Disfunção das bombas iônicas membranárias Liberação de íons intracelulares K Zn PO4 3 Mg Desregulação do metabolismo intracelular Liberação metabólitos intracelulares lactato adenosina etc Tempo 60 minutos Alteração membranas celulares Liberação de macromoléculas intracelulares mioglobina enzimas Necrose celular perda de todo conteúdo celular Íons Metabólitos Macromoléculas Horas Marcadores Cardíacos Marcadores Tradicionais AST LDH CKtotal CKMB Marcadores Avançados CKMB isoformas Mioglobina Troponina I Troponina T Enzimas Cardíacas Enzima Eleva ção Pico Máximo Normaliza ção CK CK MB 4 horas 24 horas 4872 h 2o3o dia AST 612 horas 48 horas 72120 h 3o5o dia LDH 8 horas 4872 horas 240 h 10o14o dia Creatino quinase CK Reação catalisada CreatinaP ADP creatina ATP Valor de referência para a população caucasiana pelo método CKNACEDTA feito a 37oC é 26140 UL para mulheres e 38174 UL para homens Cinética após IAM Elevação 4 a 10 horas após início da dor Pico máximo 18 a 24 horas Retorno 30 a 48 horas Meiavida 16 4 horas MM 1020h MB717h BB3h Eficácia diagnóstica 13 a 18 horas após sintomas CK Creatinoquinase São encontradas no citosol ou associadas com estruturas miofibrilares e são liberadas no sangue posteriormente à um dano ao tecido Possui 3 isoenzimas CK1 CKBB CK2 CKMB e CK3 CKMM CK Isoenzimas B M CKMM CKMB CKBB 1BB 2MB 3MM mito Músculo 97 MM 2 MB BB Miocárdio 60 MM 40 MB mito Cérebro 99 BB mito CK Interpretação Clínica Infarto Agudo do Miocárdio Lesões cardíacas miocardites arritmias graves angina contusão cardíaca cirurgias cardíacas Procedimentos terapêuticos cardioversão ressuscitação cardiopulmonar cateterização angioplastia injeção intramuscular Lesões e doenças da musculatura esquelética fadiga muscular traumas estado de choque miopatias hipertermia maligna dermatomiosites polimiosites distrofias musculares Lesões cerebrais acidente vascular cerebral trombose infarto embolia neoplasias isquemia lesões na cabeça encefalopatias Lesões do trato gastrintestinal infarto necrose tumores Doenças pulmonares pneumonia infecções causadas por Legionella deficiência respiratória hipoxemia lesões no epitélio alveolar asma Lactato desidrogenase LDH Década de 60 IAM Década de 70 eletroforese das isoenzimas Reação catalisada ácido lático NAD ácido pirúvico NADH H Isoenzimas M H H H H H H H H H H H M M M M M M M M M M LDH1 LDH2 LDH3 LDH4 LDH5 LDH Cinética enzimática após IAM Elevação 8 a 12 horas após início da dor Pico máximo 24 a 72 horas Retorno 7 a 14 dias Meiavida 57 a 170 horas média de 99 horas Eficácia diagnóstica 19 a 24 horas após início dos sintomas Valor de referência 125 a 220 UL MARCADORES NÃO ENZIMÁTICOS DA LESÃO CARDÍACA I MIOGLOBINA Proteína citoplasmática transportadora de oxigênio presente no músculo esquelético e cardíaco 2 da proteína total localizada no citoplasma e vida média de 10 minutos Liberada após 1 a 2 h após o início dos sintomas com pico entre 6 a 9h Não é específica Elevase na presença de lesões musculares IRC exercícios extenuantes e exposição à drogas e toxinas MARCADORES NÃO ENZIMÁTICOS DA LESÃO CARDÍACA II TROPONINAS Proteínas contidas nas células musculares do aparelho miofibrilar das células do sarcômero núcleo básico do aparato contráctil Subdividemse em Troponina I subunidade inibidora de actina Troponina C subunidade ligada ao cálcio e reguladora da contração Troponina T subunidade ligada à miosina tropomiosina Existe em três isoformas duas no músculo esquelético e uma no músculo cardíaco Elevamse entre 4 8h dos sintomas com pico entre 36 e 72 h MARCADORES BIOQUÍMICOS DA LESÃO DO MIOCÁRDIO NOVOS MARCADORES PARA O INFARTO DO MIOCÁRDIO I ANOREXINA Proteína ligadora de cálcio com afinidade para fosfatidilserina presente apenas na porção interna da membrana celular Deslocamento para circulação é indicador de desorganização celular relacionado com apoptose II PROTEÍNA LIGADORA DE ÁCIDOS GRAXOS FABP Proteína de baixo peso molecular abundante no citoplasma das células cardíacas Liberação rápida para o plasma 2 a 3 h após dano celular permitindo identificação precoce da lesão miocárdica