Slide - Aminoácidos Peptídeos e Proteínas 2023 1

09082020 1 AMINOÁCIDOS PEPTÍDEOS E PROTEÍNAS Berg JM Tymoczko JL Gatto Jr GJ Stryer L Bioquímica 7 ed Rio de Janeiro Guanabara Koogan 2014 Capítulos 2 e 3 Somente para fins educacionais intransferível e de uso pessoal dos alunos matriculados na disciplina Introdução à Bioquímica QUI 035 da Universidade Federal de Minas Gerais NÃO é permitida a redistribuição desse material fora desse ambiente Onde indicado as imagens contidas nos slides pertencem ao livro supracitado tendo sido o uso gentilmente autorizado pelo Grupo GEN detentor dos direitos exclusivos para a língua portuguesa AMINOÁCIDOS PEPTÍDEOS E PROTEÍNAS Berg JM Tymoczko JL Gatto Jr GJ Stryer L Bioquímica 7 ed Rio de Janeiro Guanabara Koogan 2014 Capítulos 2 e 3 Conteúdo 21 Aminoácidos e peptídeos estrutura e propriedades 22 Arquitetura proteica estrutura tridimensional das proteínas 23 Purificação de aminoácidos e proteínas 24 Caracterização de aminoácidos e proteínas 25 Síntese de peptídeos 26 Métodos de determinação da estrutura proteica Cap 2 Cap 3 09082020 2 Objetivos de aprendizagem Ao final desta aula você deve ser capaz de Conhecer as definições que diferenciam aminoácidos peptídeos e proteínas Identificar os 20 tipos de aminoácidos e suas propriedades Distinguir entre as estruturas primária secundária terciária e quaternária Descrever as propriedades das principais estruturas secundárias Discutir sobre as diferentes forças e razões para o enovelamento proteico Descrever a síntese de peptídeos em fase sólida Descrever as principais técnicas de separação e análise de proteínas 3 Características básicas de uma proteína Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 4 As proteínas são polímeros lineares feitos de unidades monoméricas denominadas aminoácidos As proteínas contêm uma ampla faixa de grupamentos funcionais As proteínas podem interagir uma com a outra e com outras moléculas biológicas Algumas proteínas são bem rígidas mas outras apresentam flexibilidade muito embora limitada 09082020 3 Diferenciando aminoácido peptídeo e proteína 5 Aminoácido unidade monomérica de um peptídeo ou proteína Peptídeo contém de 250 resíduos de aminoácidos n 2 dipeptídeo n 3 tripeptídeo n 4 tetrapeptídeo n 1020 oligopeptídeo n 50 polipeptídeo Proteínas polipeptídeos contendo usualmente mais de 50 resíduos de aminoácidos a maioria das proteínas possuem de 50 a 2000 aa aan ex n 5 aaaaaaaaaa Resíduo de aminoácido é a unidade monomérica de um peptídeo ou proteína Não há consenso sobre esses números Ligação peptídica amídica CONH Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 As proteínas são construídas a partir de um repertório de 20 aminoácidos Somente isômeros L são achados em proteínas Revise os conceitos Estereoquímica Nomenclatura DL relativa Nomenclatura RS absoluta Nomenclatura DL Nomenclatura RS Estrutura e propriedades de aminoácidos 6 09082020 4 7 Estado de ionização em função do pH Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 Concentração Forma catiônica Forma zwitteriônica Forma aniônica Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 Dentre os 20 tipos diferentes de aminoácidos encontrados em proteínas as cadeias laterais R podem variar em Tamanho e forma Carga Capacidade de interações Polaridade Reatividade química 8 Cadeias laterais de aminoácidos Conforme o tipo de cadeia lateral vamos classificar os aminoácidos nas seguintes classes Neutras de baixa polaridade Aromáticas Polares usualmente neutras Polares carregadas positivamente catiônicas Polares carregadas negativamenteaniônicas Polares neutras 09082020 5 CADEIAS LATERAIS NEUTRAS DE BAIXA POLARIDADE 9 Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 CADEIAS LATERAIS AROMÁTICAS CADEIAS LATERAIS POLARES USUALMENTE NEUTRAS 10 pKa 101 pKa 155 pKa 155 pKa 81 pKa das cadeias laterais Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 09082020 6 CADEIAS LATERAIS POLARES CATIÔNICAS CADEIAS LATERAIS POLARES ANIÔNICAS NEUTRAS 11 pKa das cadeias laterais pKa HAdos ácidos conjungados das cadeias laterais CADEIAS LATERAIS POLARES NEUTRAS pKa 107 pKa 121 pKa HA 60 pKa HA 37 pKa HA 42 Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 12 Valores típicos de pKa para os grupos ionizáveis em aminoácidos Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 09082020 7 Aminoácido Abreviação com três letras Abreviação com uma letra Alanina Ala A Arginina Arg R Asparagina Asn N Aspartato ou Ácido aspártico Asp D Cisteina Cis ou Cys C Fenilalanina Fen ou Phen F Glicina ou Glicocola Gli ou Gly G Glutamato ou Ácido glutâmico Glu E Glutamina Gln Q Histidina His H Isoleucina Ile I Leucina Leu L Lisina Lis ou Lys K Metionina Met M Prolina Pro P Serina Ser S Tirosina Tir ou Tyr Y Treonina The ou Thr T Triptofano Trp W Valina Val V 13 Abreviações dos aminoácidos 14 A homoserina não ocorre naturalmente Por quê Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 09082020 8 Os aminoácidos se unem por ligações peptídicas formando cadeias 15 Aminoácido unidade monomérica de um peptídeo ou proteína Peptídeo contém de 250 resíduos de aminoácidos n 2 dipeptídeo n 3 tripeptídeo n 4 tetrapeptídeo n 1020 oligopeptídeo n 50 polipeptídeo Proteínas polipeptídeos contendo usualmente mais de 50 resíduos de aminoácidos a maioria das proteínas possuem de 50 a 2000 aa Características de ligações peptídicas Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 16 Ressonância e planaridade A ligação peptídica tem um caráter de ligação duplaparcial por causa da ressonância Assim a rotação em torno dessa ligação requer elevada energia A ligação peptídica é planar CN 147 Å CN 129 Å Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 09082020 9 17 Na maioria dos casos a ligação trans de uma ligação peptídica é favorecida Quando houver prolina cis ou trans são bem aceitas Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 18 Cadeia lateral Cadeia principal Aceptor de ligação de hidrogênio Doador de ligação de hidrogênio Cadeia polipeptídica elementos importantes O peso molecular médio de um aminoácido é 110 g mol1 A peso molecular de uma proteína é usualmente apresentada em kilodaltons sendo que um Dalton Da corresponde a uma unidade atômica 112 da massa do 12C Exemplo Mioglobina 154 aa 16700 daltons ou 167 kDa Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 09082020 10 Cadeias peptídicas são flexíveis embora de forma restrita Embora não há rotação em torno de uma ligação peptídica As ligações NCa e CaCO formam um eixo de torção Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 19 Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 20 Rotação em torno de Phi Rotação em torno de Psi httpxraybmcuusegerardembo2001modval01html Eixos de torção 09082020 11 Gráfico de Ramachandran Esta representação ilustra quais conformações são favoráveis por não causar estericidade entre os grupos ligados ao carbono alfa 21 Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 Interações específicas entre as cadeias laterais de aminoácidos Interações de van der Waals ex A I L V Ligações de hidrogênio ex S H N C E Interações eletrostáticas ex R D E K Ligações de dissulfeto somente Cisteína 22 Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 09082020 12 23 Ligações de dissulfeto Insulina bovina Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 Efeitos sobre a acidez e basicidade de aminoácidos e seus resíduos 24 Como o meio afeta o pKa de resíduos de aminoácidos Bolsa apolar Asp Bolsa apolar Asp H pKa 37 em H2O Bolsa apolar His Bolsa apolar H pKa 60 em H2O His Aumento do valor de pKa em relação a H2O Diminuição do valor de pKa em relação a H2O 09082020 13 25 pKa 42 em H2O Glu H Diminuição do valor de pKa em relação a H2O His Glu His pKa 60 em H2O Glu H Aumento do valor de pKa em relação a H2O His Glu His pKa 60 em H2O Efeitos sobre a acidez e basicidade de aminoácidos e seus resíduos Como o meio afeta o pKa de resíduos de aminoácidos 26 Sequência de aminoácidos direção de leitura Por convenção o resíduo de aminoácido aminoterminal é considerado o início da cadeia polipeptídica YGGFL LFGGY é outro peptídeo Estrutura de peptídeos e proteínas Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 09082020 14 Hierarquia da Estrutura Proteica 27 Outros detalhes importantes sobre a estrutura proteica Motivos de proteínas estruturas supersecundárias Domínios proteicos Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 Estruturas secundárias regulares Hélicealfa 28 Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 09082020 15 29 A héliceα é uma estrutura helicoidal em que as cadeias laterais apontam para fora do eixo da hélice Todos os grupos da cadeia principal CO e NH com exceção daqueles nas extremidades da hélice realizam ligações de hidrogênio resíduo de aa na posição i CO com o resíduo de aa na posição i4 NH Hélicesα são comumente dextrosas Estruturas secundárias são estruturas regulares Hélicealfa Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 Gráfico de Ramachandran posições das hélicesalfa 30 Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 09082020 16 31 Estruturas secundárias regulares Fitasbeta Em contraste com uma héliceα a cadeia polipeptídica em um fitaβ completamente extendida Fitasβ adjacentes e interagentes por ligações de hidrogênio entre si formam folhasβ Há dois tipos de folhasβ antiparalelas e paralelas Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 32 Folhabeta antiparalela Fitasβ adjacentes dispõemse em direções opostas As ligações de hidrogênio ocorrem entre os grupos NH e CO envolvendo um aminoácido em uma fita com um único aminoácido da fica adjacente Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 09082020 17 33 Folhabeta paralela Fitasβ adjacentes dispõemse na mesma direção As ligações de hidrogênio ocorrem entre os grupos NH e CO envolvendo um aminoácido em uma fita com dois aminoácidos da fica adjacente Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 34 Folhabeta mistas Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 09082020 18 Gráfico de Ramachandran posições das fitasbeta 35 Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 36 Estruturas secundárias nãoregulares Voltabeta e Alças Voltasβ Alças loops Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 09082020 19 37 Proteínas ricas em estruturas secundárias regulares Proteína de ligação de ácido graxo Ferritina Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 Proteínas hidrossolúveis se enovelam em estruturas compactas com o interior apolar 38 Estruturas terciárias Mioglobina Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 09082020 20 Cadeias peptídicas podem se associar em estruturas com múltiplas subunidades 39 Estruturas quaternárias Hemoglobina Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 40 Motivos de proteínas Combinações de estruturas secundárias comuns a muitas proteínas Ex Hélicevoltahélice motivo comum em proteínas que ligam ao DNA Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 09082020 21 41 Domínios de proteínas Algumas proteínas apresentam regiões de enovelamento independente conectadas por um segmento curto e flexível Ex Proteína contendo 4 domínios Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 A sequência de aminoácidos de uma proteína determina sua estrutura tridimensional 42 Experimento de Anfinsen sobre enovelamento proteico Em alguns casos isso não funciona ex o enovelamento depende chaperonas Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 Uréia βmercaptoetanol 09082020 22 43 Enovelamento proteico é um processo altamente cooperativo Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 44 As proteínas enovelamse por meio de estabilização progressiva de intermediários Não é um processo aleatório Paradoxo de Levinthal o Por exemplo o Para uma proteína de 100 aa o Considerando 3 conformações diferentes para cada aminoácido o Teríamos um total de 3100 estruturas ou 5 x 1047 o Se demorar 1013 s para uma estrutura converter em outra o Teríamos um tempo total de busca de 5 x 1047 x 1013 5 x 1034 s ou 16 x 1027 anos Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 09082020 23 Peptídeos podem ser sintetizados por métodos automatizados em fase sólida 45 Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 46 Metódos de purificação de proteínas Expressão Purificação Análise Lise celular Centrifugação Precipitação Diálise Cromatografia o Filtração em gel o Trocaiônica o Afinidade Eletroforese em gel Degradação de Edman Espectrometria de massas Cristalografia de raiosX Ressonância Magnética Nuclear Criomicroscopia eletrônica 09082020 24 47 Metódos de purificação de proteínas Expressão Purificação Análise Lise celular Centrifugação Precipitação Diálise Cromatografia o Filtração em gel o Trocaiônica o Afinidade Eletroforese em gel Degradação de Edman Espectrometria de massas Cristalografia de raiosX Ressonância Magnética Nuclear Criomicroscopia eletrônica 48 Lise celular e centrifugação diferencial Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 09082020 25 49 Metódos de purificação de proteínas Expressão Purificação Análise Lise celular Centrifugação Precipitação Diálise Cromatografia o Filtração em gel o Trocaiônica o Afinidade Eletroforese em gel Degradação de Edman Espectrometria de massas Cristalografia de raiosX Ressonância Magnética Nuclear Criomicroscopia eletrônica 50 Precipitação seletiva saltingout httpswwwsigmaaldrichcom Aniôns SO4 2 HPO4 2 Acetato Cl NO3 Br ClO3 I ClO4 SCN Cátions NH4 K Na Li Mg2 Ca2 Guanidínio Solubilidade Série de Hofmeister Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 09082020 26 51 Metódos de purificação de proteínas Expressão Purificação Análise Lise celular Centrifugação Precipitação Diálise Cromatografia o Filtração em gel o Trocaiônica o Afinidade Eletroforese em gel Degradação de Edman Espectrometria de massas Cristalografia de raiosX Ressonância Magnética Nuclear Criomicroscopia eletrônica 52 Diálise Método de separação com base no tamanho da molécula Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 09082020 27 53 Metódos de purificação de proteínas Expressão Purificação Análise Lise celular Centrifugação Precipitação Diálise Cromatografia o Filtração em gel o Trocaiônica o Afinidade Eletroforese em gel Degradação de Edman Espectrometria de massas Cristalografia de raiosX Ressonância Magnética Nuclear Criomicroscopia eletrônica 54 Cromatografia de Filtração em Gel Método de separação com base no tamanho da molécula Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 09082020 28 55 Cromatografia de Filtração em Gel Volume de eluição Concentração P1 P2 P3 Conclusão Tamanho P1 P2 P3 Um possível cromatograma para uma mistura de 3 proteínas 56 Metódos de purificação de proteínas Expressão Purificação Análise Lise celular Centrifugação Precipitação Diálise Cromatografia o Filtração em gel o Trocaiônica o Afinidade Eletroforese em gel Degradação de Edman Espectrometria de massas Cristalografia de raiosX Ressonância Magnética Nuclear Criomicroscopia eletrônica 09082020 29 57 Cromatografia de Trocaiônica Método de separação com base na carga da proteína considera o ponto isoeletrônico da proteína pI Resina SP Resina de trocaiônica de cátions Resina Q Resina de trocaiônica de ânions Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 58 Cromatografia de Trocaiônica Uma mistura de 3 proteínas com pontos isoelétricos diferentes Carga pI em pH 75 P1 6 P2 7 P3 8 pH pI pH pI pH pI Volume de eluição Concentração P3 Um possível cromatograma utilizando Resina Q tampão A contém 0 NaCl e tampão B 100 NaCl A 100 B 0 A 0 B 100 Injeção P2 P1 09082020 30 59 Metódos de purificação de proteínas Expressão Purificação Análise Lise celular Centrifugação Precipitação Diálise Cromatografia o Filtração em gel o Trocaiônica o Afinidade Eletroforese em gel Degradação de Edman Espectrometria de massas Cristalografia de raiosX Ressonância Magnética Nuclear Criomicroscopia eletrônica 60 Cromatografia de Afinidade Método de separação com base em uma afinidade específica Por exemplo glicose proteínas ligadoras de glicose Ni2 proteínas contendo uma cauda de 6xHistag Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 09082020 31 61 Cromatografia de Afinidade Volume de eluição Concentração P3 A 100 B 0 A 0 B 100 Injeção P2 P1 Uma mistura de 3 proteínas sendo duas com afinidades diferentes por glicose Um possível cromatograma tampão A contém 0 Glicose e tampão B 100 Glicose 62 Metódos de purificação de proteínas Expressão Purificação Análise Lise celular Centrifugação Precipitação Diálise Cromatografia o Filtração em gel o Trocaiônica o Afinidade Eletroforese em gel Degradação de Edman Espectrometria de massas Cristalografia de raiosX Ressonância Magnética Nuclear Criomicroscopia eletrônica 09082020 32 63 Eletroforese em gel Separação de proteínas utilizando um campo elétrico Dodecilsulfato de sódio SDS SDSPAGE As proteínas são separadas em uma forma desenovelada e carregada negativamente por conta da interação de uma molécula de SDS para cada 2 resíduos de aminoácidos Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 64 Eletroforese em gel preparo de um gel de acrilamida Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 09082020 33 65 Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 Eletroforese em gel As proteínas são reveladas utilizando o agente Azul de Coomassie e analisadas frente a um padrão de proteínas com peso molecular conhecido 66 Metódos de purificação de proteínas Expressão Purificação Análise Lise celular Centrifugação Precipitação Diálise Cromatografia o Filtração em gel o Trocaiônica o Afinidade Eletroforese em gel Degradação de Edman Espectrometria de massas Cristalografia de raiosX Ressonância Magnética Nuclear Criomicroscopia eletrônica 09082020 34 Determinação da sequência de aminoácidos 67 Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 68 Metódos de purificação de proteínas Expressão Purificação Análise Lise celular Centrifugação Precipitação Diálise Cromatografia o Filtração em gel o Trocaiônica o Afinidade Eletroforese em gel Degradação de Edman Espectrometria de massas Cristalografia de raiosX Ressonância Magnética Nuclear Criomicroscopia eletrônica 09082020 35 A determinação da massa de uma proteína e sua composição podem ser determinadas por Espectrometria de Massas 69 Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 70 Espectrometria de Massas Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 09082020 36 71 Metódos de purificação de proteínas Expressão Purificação Análise Lise celular Centrifugação Precipitação Diálise Cromatografia o Filtração em gel o Trocaiônica o Afinidade Eletroforese em gel Degradação de Edman Espectrometria de massas Cristalografia de raiosX Ressonância Magnética Nuclear Criomicroscopia eletrônica A estrutura tridimensional de uma proteína pode ser determinada por cristalografia de raios X Solução aquosa de proteína solução precipitante Solução precipitante 72 Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 09082020 37 73 Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 Um mapa de densidade eletrônica em cristalografia de raios X 74 Metódos de purificação de proteínas Expressão Purificação Análise Lise celular Centrifugação Precipitação Diálise Cromatografia o Filtração em gel o Trocaiônica o Afinidade Eletroforese em gel Degradação de Edman Espectrometria de massas Cristalografia de raiosX Ressonância Magnética Nuclear Criomicroscopia eletrônica 09082020 38 A estrutura tridimensional de uma proteína pode ser determinada por Ressonância Magnética Nuclear 75 Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 76 Ressonância Magnética Nuclear Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 09082020 39 77 Ressonância Magnética Nuclear Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 78 Metódos de purificação de proteínas Expressão Purificação Análise Lise celular Centrifugação Precipitação Diálise Cromatografia o Filtração em gel o Trocaiônica o Afinidade Eletroforese em gel Degradação de Edman Espectrometria de massas Cristalografia de raiosX Ressonância Magnética Nuclear Criomicroscopia eletrônica 09082020 40 79 Criomicroscopia eletrônica CryoEM Uma fina camada de uma solução proteica é rapidamente congelada e analisada por microscopia eletrônica de transmissão O resultado é um conjunto de diferentes orientações da proteína Berg et al Bioquímica 7 ed 2014 AMINOÁCIDOS PEPTÍDEOS E PROTEÍNAS Berg JM Tymoczko JL Gatto Jr GJ Stryer L Bioquímica 7 ed Rio de Janeiro Guanabara Koogan 2014 Capítulos 2 e 3 Conteúdo 21 Aminoácidos e peptídeos estrutura e propriedades 22 Arquitetura proteica estrutura tridimensional das proteínas 23 Purificação de aminoácidos e proteínas 24 Reações de caracterização de aminoácidos e proteínas 25 Síntese de peptídeos 26 Métodos de determinação da estrutura proteica